轉(zhuǎn)基因煙草方法

.材料與方法實驗材料植物材料：K326煙草種子藥品：MS大量元素，MS微量元素，MS鐵鹽,0吲朵乙酸（^八），6-芐氨基腺瞟呤（6-BA）,煙肌醇（B]B6）蔗糖，瓊脂，頭孢霉素（Cef）,竣芐青霉素（Carb）,卡那霉素（3）、慶大霉素、利福平等；MS培養(yǎng)基（工）大量元素（20乂）500^微量元素（100乂）1001、Fe2+（100x）10mL蔗糖30g、瓊脂8g,PH值約為6.0預(yù)培養(yǎng)基（1L）：大量元素（20x）50mL微量元素（100x）10mLFe2+（100x）10mL6-BA（1000x）2ml、B1B6（200x）5mL甘氨酸（1000x）1mL瓊脂8g,PH值約為6.0高溫滅菌后加IAA（0.2mg/L）1ml分化培養(yǎng)基（1L）:預(yù)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入頭孢霉素21^,竣芐青霉素1ml,卡那霉素1ml.生根培養(yǎng)基（1L）:1/2MS、IAA2mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂5.8g/LpH=5.8LB液體培養(yǎng)基（1L）：胰蛋白胨108、酵母提取物5g、NaCI10gMS0培養(yǎng)基：為不加瓊脂的只含大量元素MS培養(yǎng)基實驗方法.浸染菌液制備將含有目的基因的農(nóng)桿菌在固體18培養(yǎng)基上劃板，28c下暗培養(yǎng)兩天。挑取單菌落，接種于5ml含50mg.L-1卡那霉素、50mg.L-1鏈霉素及50mg.L-1利福平的液體LB培養(yǎng)基中，28℃下振蕩培養(yǎng)過夜。活化過夜的農(nóng)桿菌，按1：50的比例，稀釋到含501^.1-1卡那霉素的新鮮液體LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值約為0.5取培養(yǎng)物1ml,置于無菌離心管中，12000rpm離心1分鐘，棄上清。加入100ml的MS0培養(yǎng)基，混勻。,姻草轉(zhuǎn)化按0十圓盤法轉(zhuǎn)化煙草。將剪切好的煙草0十盤放置在預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)1-2天后，置于懸菌液中（MSO懸浮，可以稀釋50—100倍）浸泡3-5分鐘。然后取出，用無菌濾紙吸去其表面的液體。將浸染過的0十盤分接種在覆有兩層濾紙的預(yù)培養(yǎng)基上號，26c下暗培養(yǎng)20-24八用加頭孢霉素，竣芐青霉素（母液1000倍）的無菌水清洗10分鐘，最后用無菌水清洗10分鐘，然后用無菌濾紙吸去其表面的液體再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進行分化培養(yǎng)，前期2-3天繼代一次，每次繼代需在無菌條件下進行，連續(xù)繼代3次后就每隔兩周繼代一次。共培養(yǎng)至第一個小芽長出。轉(zhuǎn)入組培瓶培養(yǎng)待芽長至2厘米時，在超凈臺上切去芽基部的所有愈傷組織及基部0十片，植于生根培養(yǎng)基上。待根長至3厘米時，取出無菌苗，輕輕打碎固體培養(yǎng)基，洗去殘留的培養(yǎng)基。然后將無菌苗置入土壤，套上透明塑料袋（扎孔），培養(yǎng)大約一周，移到室外。（最初的3天應(yīng)在陰暗處生長）.結(jié)果與分析無菌苗的培養(yǎng)：圖1為K326煙草種子在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天與40天左右的煙草幼苗圖，每個培養(yǎng)瓶有4-5棵煙草幼苗。煙草植株大致生長到株高為6-8厘米時即可用于制作0十盤，此時每株大概有5-8片0十子，取中間大小且健康的的0十片用于制作0十盤。

A B圖1分化培養(yǎng)圖2分別為分化培養(yǎng)初期浸染0十片的培養(yǎng)圖、0十片形成愈傷組織圖片與愈傷組織上煙草新芽圖片。浸染初期由于0十盤體積小，所以每個培養(yǎng)血里面的0十小塊大概15塊。隨著愈傷組織的形成和不斷生長，培養(yǎng)血條件已經(jīng)不能滿足愈傷組織的生長要求，這時將愈傷組織轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶1-2個愈傷組織。定期給愈傷組織更換培養(yǎng)基以保證其充足的成長營養(yǎng)。愈傷組織經(jīng)過再分化長成了煙草幼芽，此時，用攜帶AtWRKY22基因的農(nóng)桿菌浸染的煙草愈傷形成的幼芽長勢良好，而對照組的幼芽則被漂白。AB

AB生根圖3為愈傷組織上形成的幼芽在生根培養(yǎng)基上的生長圖。從圖中可見幼芽生長迅速且未見污染現(xiàn)象，培養(yǎng)基內(nèi)有長短不一的煙草根長出。煙草的根呈淡黃色且非常纖細。此圖片說明轉(zhuǎn)基因煙草幼芽已經(jīng)成功生根。圖3.裁基因煙草的PCR反及分析將移栽的煙草植株在室外條件下生長一段時間，取含有目的基因的轉(zhuǎn)煙草植株0十片和不含目的基因的煙草植株0十片進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)圖譜如下：圖4如圖所示，M為標記基因電泳結(jié)果。1-6為轉(zhuǎn)基因煙草PCR反應(yīng)后的電泳圖譜，7為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M植物0十片的電泳結(jié)果。由圖可知轉(zhuǎn)基因植株中檢測到了目的基因，這表明AtWRKY22基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入煙草植株。而對照組植株沒有檢測到目的基因。.討論作為基因工程的模式植物，煙草是進行轉(zhuǎn)基因研究最早，也是轉(zhuǎn)基因種類較多的經(jīng)濟作物。自1986年以來，已經(jīng)將煙草花0十病毒(TMV)，馬鈴薯Y病毒(PVY),馬鈴薯X病毒(PVX),黃瓜花0十病毒(CMV),苜?；?十病毒(AMV),煙草脆裂病毒(TRV)的外殼蛋白基因，PVY復(fù)制酶基因，CMV的微衛(wèi)星RNA,幾丁質(zhì)酶基因、抗菌肽基因、葡糖糖氧化酶、蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白基因(Bt)和蛋白酶抑制基因口2等上百種外源基因轉(zhuǎn)入煙草獲得表達。在之前擬南芥基因轉(zhuǎn)化煙草的研究中，郭兆奎等［13將擬南芥AVP2基因轉(zhuǎn)入煙草研究了此基因?qū)χ仓晡这涬x子的影響。另外，付乾堂和余迪求［14研究了擬南芥AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33 在非生物脅迫條件下的表達分析。對于AtWRKY22基因，尚慶茂等［15研究了其抗病途徑。本實驗用農(nóng)桿菌介導和0十盤法相結(jié)合將擬南芥AtWRKY22基因轉(zhuǎn)入煙草以獲得抗病性轉(zhuǎn)基因煙草植株。許多因素都影響根癌農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)化：一是受體；二是農(nóng)桿菌；三是受體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)時間。各種因素的影響程度不同。受體0十片的生理狀態(tài)，它決定了被轉(zhuǎn)化的能力。本實驗采用了無菌培養(yǎng)的煙草苗，這就避免了用栽培苗消毒太徹底而導致0十片死亡或是消毒不徹底而導致培養(yǎng)過程中生長其他細菌、真菌的情況。煙草苗齡為1-2個月時，分化再生能力和對農(nóng)桿菌感染的耐受力均較強。苗齡過短時，不易剪出0十緣和主脈的小塊，且這種小塊在分化培養(yǎng)基只能夠也很容易發(fā)白而死亡。如果苗齡過長，特別是繼代的時間過長或是代數(shù)過多，會大大增加0十片玻璃化的機率，再生能力和對農(nóng)桿菌感染的耐受力均下降。對外植體的預(yù)培養(yǎng)促進細胞分裂，分裂后的細胞更容易整合外源DNA，因而提高外源基因的轉(zhuǎn)化率［16上在對照實驗中，不含目的基因的煙草十十盤形成的愈傷組織上產(chǎn)生的新芽被漂白，而轉(zhuǎn)基因愈傷組織上的新芽則正常生長，與趙佩歐等［17］人的實驗結(jié)果相符合，這主要是因為不含目的基因的新芽不含抗病基因，導致外植體在分化培養(yǎng)基上白化死亡。本實驗用WRKY22基因轉(zhuǎn)化煙草，獲得了轉(zhuǎn)基因的煙草植株。農(nóng)桿菌介導AtWRKY22基因轉(zhuǎn)化煙草植株的獲得為今后研究AtWRKY22基因功能提供了科學依據(jù)。參考文獻［1中國植物志編委會.中國植物志加］.北京科學出版社,1985.［2許旭明.煙草的起源與進化［犯.三明農(nóng)業(yè)科技，109(3):25-27,2007.［3朱尊權(quán).中國煙草生產(chǎn)科研現(xiàn)狀與展望［犯.中國煙草學報,14(6):118-119,2008.［4］謝劍平.2006年煙草化學學科研究發(fā)展報告［N］.中國煙草學報，13(2):98-99,2007.［5］郝冬梅.中國煙草加工業(yè)市場結(jié)構(gòu)與績效分析［D］.北京:中國農(nóng)業(yè)大學研究院,2001.［6閆克玉，趙銘欽,煙草原料學加］.科學出版社,2008.［7將樹民煙草知識四百問［M］.上海人民出版社.1987.［8］趙左福，張樂.植物病原細菌簡明手冊［M］.北京:農(nóng)業(yè)植物植疫實驗所，125-128,1992.［9］李光西，方敦煌，殷端.香料煙細菌性斑點病病原鑒定［N］.植物病理學報，37(3):232-236,2007［10楊建卿.煙草病理學國］.合肥中國科學技術(shù)大學出版社，157-161,2003.［11中國植物志編委會.中國植物志國］.北京科學出版社,1985.［12用新甫.轉(zhuǎn)基因植物［M］.北京科學出版社，381-386.,2003.［13郭兆奎，楊謙，嚴培強.擬南芥AVP2基因轉(zhuǎn)化煙草中吸鉀相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄分析［N］西北農(nóng)林科技大學學報36(9),2008.［14］付乾堂，余迪求.擬南芥AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33 在非生物脅迫條件下的表達分析［J］.HEREDITAS.32(8):848-856,2010.［15尚慶茂，李曉芬，張志剛.植物對逆境交叉適應(yīng)的分子機制［N］西北植物學報27(9):1921-1924,2007.［16王關(guān)林，方宏均.植物基因工程的原理與技術(shù)國］.科學出版社,2002.[17趙佩歐，謝科，郭澤建.水稻OsWRKY10 與GFP融合基因的煙草轉(zhuǎn)化及亞細胞定位觀察?].浙江農(nóng)業(yè)學報18（3）:159-162,2006.致謝大學生活一晃而過，回首走過的歲月，心中倍感充實，當我寫完這篇畢業(yè)論文的時候，有一種如釋重負的感覺，感慨良多。在這即將畢業(yè)的時刻，我想感謝身邊的很多人。首先誠摯地感謝我的論文指導老師李