核酸提取方法資源

核酸提取大體上主要分三大類：基因組DNA、總RNA和質(zhì)粒一、常見提取方法/原理：基因組DNA：CTAB法、SDS法等以去污劑CTAB/SDS等處理樣品，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，裂解細(xì)胞（裂解液通常含EDTA抑制DNase活性，Tns-Cl緩沖防止核酸被破壞，同時具有較高NaCl濃度，維持核酸溶解性）：加氯仿去除蛋白復(fù)合物（有機(jī)相），離心分離，回收水相（內(nèi)含核酸）；異丙醇沉淀DNA,離心回收絮狀DNA,梯度乙醇清洗，自然揮干，溶解DNA于TEbuffer?？俁NA：TRIzol法（苯酚+硫氤化?。?、異硫氤酸弧鹽兩步法、CTAB-PVP法等與DNA提取的原理步驟基本一致。TRIzoVCTAB等buffei?裂解細(xì)胞，解聚染色體，釋放核酸；氯仿除蛋白，離心后回收水性酚相/水相（RNA提取必須是酸性酚或低鹽水相）；異丙醇沉淀，乙醇清洗，揮干，溶解于TEbuffera質(zhì)粒提取：堿裂解法溶液I,50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA,pH8.0；（作用于重懸細(xì)胞、保護(hù)DNA）；溶液U,0.2NNaOH/1%SDS：（堿裂解）溶液HI,3M醋酸鉀/2M醋酸；（中和堿液，SDS鈉離子取代，促蛋白-基因復(fù)合物沉淀）從上清回收質(zhì)粒二、核酸提取技術(shù)細(xì)節(jié)注意點(diǎn)：基因組DNA提取技術(shù)細(xì)節(jié)及原因：CTAB/SDS裂解液配制中必須注意pH值，酸堿度嚴(yán)重影響提取所得核酸的質(zhì)量。原因在于DNA提取與RNA提取所用的裂解液理論上是可以通用的，但DNA與RNA在溶解性差異上的表現(xiàn)在高鹽狀態(tài)下DNA-蛋白復(fù)合物可溶，低鹽狀態(tài)下RNA-蛋白復(fù)合物可溶；而在苯酚溶液中，酸性酚下RNA可溶，堿性酚下DNA可溶；故必須注意bu任ei?酸堿和鹽平衡問題。樣品研磨需要充分研磨，組織結(jié)塊、樣品成團(tuán)將極大的影響裂解液滲透和生物膜體系崩解,影響核酸溶出?？俁NA提取技術(shù)細(xì)節(jié)及原因：RNase控制問題，裂解液處理完畢后的實驗步驟必須嚴(yán)格無酶操作。原因在于樣品經(jīng)裂解處理離心后各步驟中樣品不再處于RNase抑制劑保護(hù)下，如果在后續(xù)步驟使用的耗材中沾染RNase將對總量本就較少的RNA造成嚴(yán)重破壞。樣品研磨盡量迅速。原因在于通過減少樣品細(xì)胞裂解的時間，使含RNase抑制劑的裂解液盡快浸潤樣品，阻遏樣品內(nèi)源RNase活性。質(zhì)粒抽提技術(shù)細(xì)節(jié)及原因：溶液II加入進(jìn)行樣品堿解時，動作必須輕緩。原因在于NaOH+SDS的組合主要目標(biāo)在于迅速裂解樣品，但強(qiáng)堿存在的情況卜，基因組DNA極有可能斷裂，如果裂解過程中過于粗放,基因組DNA將斷裂進(jìn)入裂解液，無法伴隨蛋白沉淀而從體系中清除。三、核酸提取常見問題及對策基因組DNA提取常見問題與對策：1、DNA得率低對策：“巧婦難為無米之炊”，因此收集盡可能多的樣本是首選方法?。?！在樣品量無法增加的情況下，裂解液務(wù)必與樣品充分混勻，各種試劑千萬不要過期（PS：節(jié)儉是美德，但要不壞事才是美德）若全程操作規(guī)范，得率尚不理想，則可以考慮對抽提DNA過程進(jìn)行重復(fù)。2、OD260/280不理想對策：OD260通常是表征核酸的，核酸因為共扼環(huán)光吸收發(fā)生在240-29011111之間，最大吸收峰一般在260nm左右，單鏈RNA,雙鏈DNA,環(huán)狀DNA等吸光略有差別，基因組DNAOD260/280應(yīng)為1.8左右，偏高則意味著RNA污染；偏低意味著蛋白/多酚污染。3、OD260/230不理想對策：OD230一般是多糖類物質(zhì)（碳水化合物主要吸收峰），4、電泳-膠孔發(fā)亮對策：膠孔發(fā)亮多是蛋白和多酚物質(zhì)污染1、上樣量與裂解體系上樣量是DNA提取的經(jīng)典問題，無論用什么方法，首先要解決的就是上樣量問題，不同的上樣量對應(yīng)不同的試劑體系，上樣量過多或多少都會影響裂解的效果。以GNT-B02的磁珠法全血基因組DNA提取試劑盒為例，標(biāo)準(zhǔn)上樣量為2003,上下浮動不超過100111.搭配的裂解液用量為400U1,有些老師由于實驗要求，需要大體積的上樣量，這在實際操作中，就需要對磁珠法的操作流程進(jìn)行改良，一般的改良思路是按比例放大裂解體系；但有些實驗的上樣量達(dá)到亳升以上，這種情況下，就不能再簡單的放大裂解體系了，需要先用紅細(xì)胞裂解液對樣品進(jìn)行處理，將上樣體枳濃縮后，再進(jìn)行磁珠法操作流程的優(yōu)化。2、磁珠結(jié)團(tuán)磁珠結(jié)團(tuán)是經(jīng)常遇到的現(xiàn)象，是由磁珠本身特性和磁珠所處試劑環(huán)境兩方面造成的，有些磁珠不僅在全血DNA提取過程中會結(jié)團(tuán)，其他的樣本也同樣會結(jié)團(tuán)，有些老師在初次遇到這種現(xiàn)象的時候會感覺不適應(yīng)，其實結(jié)團(tuán)現(xiàn)象可以用來提前預(yù)判實驗結(jié)果，結(jié)團(tuán)往往是吸附了大量核酸，如果哪次實驗沒有結(jié)團(tuán)，本次的實驗結(jié)果或許會不太好，不過也不能一概而論，雜質(zhì)太多也是引起磁珠結(jié)團(tuán)的原因。通過修改試劑配方，優(yōu)化試劑配置，可以改善磁珠的結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，但是該工作較為復(fù)雜，需要對各種參數(shù)進(jìn)行調(diào)整。不過對于磁吸速度較慢的磁珠，結(jié)團(tuán)后能明顯提高磁吸速度，提高實驗效率，只要磁珠在洗脫步驟能夠分散，而且結(jié)果也在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，磁珠結(jié)團(tuán)并不會影響整體效果。3、得率低得率是影響下游實驗的最直接因素，根據(jù)我們的經(jīng)驗，200U1的全血，得率一般在3ug以上，用GNT-B02的試劑盒，能穩(wěn)定在5ug以上，有些老師的實驗結(jié)果只有2ug左右，甚至更低，這就需要重點(diǎn)排查兩個環(huán)節(jié)，一是裂解環(huán)節(jié)，二是洗脫環(huán)節(jié)，若是裂解環(huán)節(jié)的問題，往往會是在結(jié)合的時候磁珠不結(jié)團(tuán)，或在洗滌的時候上清液顏色為深黃色或紅色，這種情況下，更換全新的裂解液，并且嚴(yán)格按照SOP操作是較為效率的解決辦法洗脫環(huán)節(jié)的問題，經(jīng)常表現(xiàn)為結(jié)團(tuán)的磁珠未被打散，可■考慮加大震蕩力度，或用吸頭吹吸、攪拌。有些老師在得率較低的時候，喜歡加大上樣量，這可能會適得其反：過大的上樣量會抑制裂解液的裂解能力?？俁NA提取常見問題與對策:質(zhì)粒提取常見問題與對策：提質(zhì)粒主要用到三種試劑：試劑一：溶菌液其中的溶菌酶的作用是水解細(xì)胞壁，葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，維持滲透壓，EDTA作螯合金屬離子用。試劑二：NaOH—SDS液NaOH的作用是促使DNA變性，SDS是表面活性劑，除去蛋白質(zhì)。試劑三：NaAc溶液作用是使變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性。提取質(zhì)粒成功的標(biāo)記是把染色體DNA、蛋白質(zhì)與RNA去除干凈,獲取一定得率的質(zhì)粒DNA,在提取過程中，比較關(guān)鍵的步驟是加入試劑一與試劑二時，要控制變性與復(fù)性操作時機(jī)，既使試劑與染色體DNA充分作用使之變性，又要使染色體DNA不產(chǎn)生斷裂成小片斷能與質(zhì)粒DNA分離。這要求試劑與溶菌液充分搖勻，搖動時用力適當(dāng)。一般來說，加入溶液一時可以用力搖動幾次，而加入溶液二時要用力均勻。當(dāng)加入溶液二5min后，溶液會變粘稠,如果不變粘稠，實驗就沒有必要再做下去了。這時要檢查所用的試劑是否正確，不然坐下去只好浪費(fèi)時間。我用過天為時代的質(zhì)粒小提試劑盒，本人認(rèn)為抽提效果很好。為什么這么說，我的細(xì)菌帶有大約20KB的耐藥質(zhì)粒，先前使用上海生工的質(zhì)粒小提試劑盒，提出的質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳總不見條帶，可是，自從用了天為時代的質(zhì)粒小提試劑盒，只要操作步驟正確，均能提取到質(zhì)粒，電泳有多條需要的清晰條帶。我考慮你如果操作方法正確，那前面模糊的條帶應(yīng)該是RNA,而你并未提到質(zhì)粒?？紤]一下你的菌種是否有問題，保存方面有沒有污染，抗性是否存在。建議：確定菌種正確后，再次提質(zhì)粒時，在液體培養(yǎng)基中加入相應(yīng)濃度的抗生素（細(xì)菌具有此抗性，同時細(xì)菌能在此濃度下生存，可測細(xì)菌的MIC值），這樣增菌后，可提局質(zhì)粒濃度。提取質(zhì)粒主要有三種試劑：懸浮液，裂解液，中和液，第一步是懸浮菌體，徹底的懸浮對提取質(zhì)粒的量有很大的關(guān)系。第二步，加入裂解液后，要溫和顛倒兩三次，等一兩分鐘看菌體變清澈時說明裂解完全了，這時需要加入中和液，顛倒兩三次后離心去除沉淀。注意裂解時不可以劇烈晃動，這樣基因組DNA就會污染，到復(fù)性時會和質(zhì)?；煸谝黄穑@樣測OD值是有，但跑膠時就看不到，你上面提不出質(zhì)粒的原因可能是質(zhì)粒丟失了，建議你重新做轉(zhuǎn)化！我曾經(jīng)犯過這樣的錯誤：搖菌的時候沒有加入抗生素。這樣的話在傳代過程中帶有質(zhì)粒的菌體會被逐步淘汰，所以很難提出質(zhì)粒。另外質(zhì)粒破碎我覺得不太可能，你得到的小片斷應(yīng)該是基因組DNA污染吧。記得加PIIPIII后一定要溫柔混勻，切忌劇烈的動作。我以前也是經(jīng)常出現(xiàn)這種情況。仔細(xì)總結(jié)一下?，可能在操作中有些注意的地方操作不得當(dāng)。你是用試劑盒作的嗎？我是用寶生物的試劑盒作的！首先，加試劑1時可■以劇烈震蕩，但是加試劑2的時候，千萬不能震蕩，否則DNA片斷可能會斷裂，而且2液要新鮮配置。加試劑3時反復(fù)顛倒即可！還有，在電泳時是否加Loadmgbuffei-?樣品散開了？我覺得注意以上幾點(diǎn)，現(xiàn)在小題的成功率還是蠻高的！我在提取質(zhì)粒時的技巧是盡量避免劇烈的搖動，不要渦旋：ILHI在冰上進(jìn)行；三種溶液加完后的那次離心延長到15nmi,13200ipmo基本上我每次提取出的質(zhì)粒都是超螺旋狀態(tài)。質(zhì)粒提取后不能完全溶于TE,為什么呢？是因為我用無菌臺吹干酒精吹的太厲害了嗎？做酶切后電泳帶很弱，和不溶應(yīng)該有關(guān)系吧？求答：助］質(zhì)粒提取后DNA不能完全溶于TE的原因1）我的感覺是你的質(zhì)粒提取質(zhì)量不好，不能溶解的部分一定不是質(zhì)粒而是雜質(zhì)。一般來說，即使己經(jīng)干燥的質(zhì)粒沉淀在四度里三天也會完全溶解的。建議你跑膠檢樣看看，或者改用試劑盒提取，國產(chǎn)的合子很便宜，博大泰克的合子100次的才80元，質(zhì)量也不錯.2）吹得太干就會不好溶解：后續(xù)操作跟這個沒有關(guān)系。3）我估計也是蛋白，用槍頭吹勻后還是不能溶解，取上清做酶切后還是有帶的，取上清做電泳發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒有四條帶，不過有一條比較清楚，應(yīng)該沒有影響到后續(xù)操作吧.4）用多少的TE不能溶解啊？個人感覺，有蛋白污染的時候質(zhì)粒比較難溶。純度高的質(zhì)粒很容易溶解的。加無水乙醇的作用是沉淀質(zhì)粒DNA,我們一般用70%的乙醇來洗滌沉淀，洗兩次，若沉淀懸浮還要離心，效果挺好的。不妨試試。提取質(zhì)粒，表面上很簡單，但在做的過程中，卻往往發(fā)現(xiàn)不少的問題。我大概每周要提取將近500個質(zhì)粒，從提取過程來看，出問題的也忘包括幾點(diǎn)：一、提取的量低：二、提取的不純，有RNA；提取的量低，有幾個因素，有可能是裂解不充分；另外和菌種的自身拷貝高低也有很多關(guān)系：含RNA主要是RNA酶混合液洗滌的時候沒有做好，可以少量分次洗滌，效果會更好?，F(xiàn)在提取質(zhì)粒往往有試劑盒，比較方便，但也有弊端，成本高點(diǎn)。我們己經(jīng)設(shè)計實驗，用物理方法去直接進(jìn)行質(zhì)粒的提取純化，從實驗來看也是很好的。就是根據(jù)質(zhì)粒本身帶有負(fù)電荷，它游離與細(xì)胞質(zhì)中不像基因組DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合，在電動勢的作用下可以轉(zhuǎn)移出來。這種方法提取質(zhì)粒也有其弊端，就是對技術(shù)要求比較高，對實驗操作要求比較嚴(yán)格優(yōu)勢也比較突出：省時，成本也降了下來。我覺得有兩方面你可以注意下：1片斷產(chǎn)物有毒，細(xì)菌都死掉了。這是我以前遇到過的情況，過夜搖菌后，第二天可見，細(xì)菌聚集成顆粒狀，提得質(zhì)粒濃度很低，后來發(fā)現(xiàn)是細(xì)菌都死掉了，質(zhì)粒降解了，所以量很低，可能目的基因所表達(dá)的蛋白對細(xì)菌有毒，后來我換了一下菌株，使用Xl-blue,提質(zhì)粒就好了。2有無雜菌污染，Amp培養(yǎng)基搖菌時，由于細(xì)菌會把Amp抗生素降解掉，造成抗生濃度降低，后果就是無抗性細(xì)菌瘋狂生長，原因就是在抗性菌和非抗性菌都能生長的條件下，非抗性菌具有生長優(yōu)勢，另外菌體里含質(zhì)?？截悢?shù)低的細(xì)菌較高的細(xì)菌具有生長優(yōu)勢。所以大提質(zhì)粒時，要從新鮮平板上挑取單克隆細(xì)菌去搖菌，避免雜菌干擾質(zhì)粒抽提，過夜培養(yǎng)的時間不要過長。建議你：1從新鮮平板上挑取菌落來搖菌，按標(biāo)準(zhǔn)步驟來做：新鮮平板上挑取單克隆，震搖培養(yǎng)8小時，然后1/500-1/1000稀釋,過夜搖菌12-16小時。2換菌株，如XI-blue等。3如果以前沒有大提過質(zhì)粒的話，還是仔細(xì)看下說明書。很有可能是大搖時，許多菌死掉了，我建議你搖菌時間稍短一些，然后將菌液放置于4度過夜，再提，或許會好些，11，你的電泳時間太長，或者電壓太高了。要得到大量的質(zhì)粒，有如下幾點(diǎn)供參考1、確保質(zhì)粒在宿主菌中有高拷貝，細(xì)菌培養(yǎng)時保證篩選壓力。不同的質(zhì)粒在宿主菌中的拷貝數(shù)不同，低拷貝的質(zhì)粒很難得到高的量，所以，我們一般把目的基因克隆到高拷貝的質(zhì)粒上。并選用合適的宿主工程菌。在宿主菌的培奔中，抗生素往往加在培養(yǎng)基中用來篩選陽性克隆，然而，當(dāng)宿主菌在對數(shù)生長期，像氨茉青霉素之類的抗生素就會被代謝完了，篩選壓力的消失會讓質(zhì)粒丟失的細(xì)菌得以存活，并在最終占據(jù)很大的比例，所以有的時候提的菌很多，而質(zhì)粒很少。應(yīng)此要保證篩選壓力，抗生素最好選較高的用量。2、質(zhì)粒提取方法的選擇熱裂解法往往會得到較高的產(chǎn)量，質(zhì)量也較好，然而對某些的宿主菌不適合，熱裂解法不穩(wěn)定，不能保證次次成功。小提的結(jié)果較好，相對穩(wěn)定。堿裂解法是最常用的方法，嚴(yán)格按照分子克隆的操作要求去做，一定會得到很好的結(jié)果。12.如果采取堿裂解的方法。我認(rèn)為應(yīng)該控制堿裂解的時間一定要短，我一般是加SolutioiiII后緩慢混勻后，即加入Solutionlll.另外，4度離心后吸取上清時，一定不要吸進(jìn)沉淀雜質(zhì)，否則最后DNA沉淀不能很好溶解。13?為了得到更好效果的圖，最好不要省略酚氯仿抽提這一步，而旦可以適當(dāng)延長抽提的時間。質(zhì)粒DNA的大量提取和純化在制作酶譜、測定序列、制備探針等實驗中需要高純度、高濃度的質(zhì)粒DNA,為此需要大量提取質(zhì)粒DNAo大量提取的質(zhì)粒DNA一般需進(jìn)一步純化,常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。（一）、堿法1、取培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的含pBS質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)液2501111,4°C下5000g離心15分鐘，棄上清,將離心管倒置使上清液全部流盡。2、將細(xì)菌沉淀重新懸浮于50ml用冰預(yù)冷的STE中（此步可省略）。3、同步驟1方法離心以收集細(xì)菌細(xì)胞。4、將細(xì)菌沉淀物重新懸浮于5ml溶液I中,充分懸浮菌體細(xì)胞。5、加入12ml新配制的溶液H,蓋緊瓶蓋，緩緩地顛倒離心管數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物，冰浴10分鐘。6、加9ml用冰預(yù)冷的溶液HI,搖動離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物，冰上放置15分鐘,此時應(yīng)形成白色絮狀沉淀。7、4°C下5000g離心15分鐘。8、取上清液，加入50inlRNA酶A（10mg/ml）,37°C水浴20分鐘。9、加入等體積的飽和酚/氯仿，振蕩混勻,4°C下12000g離心10分鐘。10、取上層水相，加入等體積氯仿，振蕩混勻,4°CF12000g離心10分鐘。11、取上層水相，加入1/5體積的4mol/LNaCl和10%PEG（分子量6000）,冰上放置60分鐘。12、4°C下12000g離心15分鐘，沉淀用數(shù)ml70%冰冷乙醇洗滌，4°C下12000g離心5分鐘。13、真空抽干沉淀，溶于500nilTE或水中。［注意］1.提取過程中應(yīng)盡量保持低溫。加入溶液II和溶液III后操作應(yīng)混和，切忌劇烈振蕩。由于RNA酶A中常存在有DNA酶，利用RNA酶耐熱的特性，使用時應(yīng)先對該酶液進(jìn)行熱處理（80°C1小時），使DNA酶失活。我也遇見過你這樣的問題，用過試劑盒，和簡易的堿裂解法，都沒有提出過質(zhì)粒，或者是跑出很怪的條帶，比如曾經(jīng)跑出2萬的分子量,我想你的問題可能有以下原因：在乙醇沉淀步驟中，將DNA弄丟了.很可能是表皮葡萄球菌污染，具體這方面的分析可見以前的舊貼.或許你提的是少量，電泳胞不出來.或許是存在蛋白質(zhì)污染，或RNA污染等我最近提了幾次質(zhì)粒，產(chǎn)量挺高的，我在提取時某一步稍微注意了一些，我在這里說一下，看看能不能對大家提質(zhì)粒有所幫助。在加入溶液2后我都是讓他們充分作用大約5-7分鐘，不長于7分鐘。加入溶液3后先輕輕混勻，大約混5-10次，然后劇烈震蕩讓白色沉淀成碎豆腐花狀（我覺得這一步挺重要的，這是前面一個戰(zhàn)友告訴我的，呵呵謝謝了），然后在冰浴10Mm.［有問題】冰浴后直接加入等體積酚：氯仿=1:1,然后離心取上清，大約能取400微升最后一步干燥時，一定要干燥充分，最后可以看到質(zhì)粒都變成透明的了。這樣就說明比較純了。往后作酶切連接轉(zhuǎn)化都沒有問題。加溶液2沒有冰浴。3.3是寫得時候沒注意，其實3.4就是3.3無水乙醇沒有冰浴冷，但是加上后是在-20度放置2h用70%乙醇就洗了一次18?建議加溶液2后冰浴5mm,溶液2的主要作用是破細(xì)胞膜以及基因組DNA變性，這是需要一定時間的，沒有冰浴5mm的話細(xì)胞膜未能充分破掉，那么你提質(zhì)粒的效率自然就很低。當(dāng)然，冰浴5min就夠了，時間要嚴(yán)格掌握，也不能超過。此步動作要輕柔。另外，溶液2應(yīng)該是新鮮配置的，否則也會降低效率。質(zhì)粒提取的常見問題1、菌液較多：可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中。收集的菌體量以能夠充分裂解為佳，菌體過多裂解不充分會降低質(zhì)粒的提取效率。未徹底混勻的菌塊會影響裂解,導(dǎo)致提取量和純度偏低，菌體懸浮后若有較多的氣泡也會影響裂解，導(dǎo)致導(dǎo)致提取量和純度偏低。質(zhì)粒提取使用的溶液I主要是懸浮菌體，溶液II裂解菌體，其中的高濃度NaOH破會細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使菌體中的質(zhì)粒DNA釋放出來，溶液HI主要是中和溶液，使溶液恢復(fù)中性環(huán)境，利于質(zhì)粒DNA復(fù)性，溶液D中SDS的Na+會被K+置換，SDS變?yōu)镻DS并結(jié)合大分子的基因組DNA,蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片形成不溶物，然后通過離心可以得到含有質(zhì)粒DNA的上清。因此加入溶液II后要溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免使基因組DNA斷裂污染質(zhì)粒。所用時間不應(yīng)超過5mm,以免質(zhì)粒受到破壞。如果菌液沒有變清亮，可能是由于菌體過多，裂解不徹底，若繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)操作會得到鼻涕狀的沉淀，無法通過離心分離得到含有DNA的上清液，因此在加入溶液II后菌液沒有變清亮后可?以適當(dāng)按比例加大溶液1【和后續(xù)溶液III的用量。2、菌液培養(yǎng)時間：使用TB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌液的時間一般在17小時左右，菌液OD值在2.5-2.6左右為佳，培養(yǎng)時間短會導(dǎo)致菌體生長不充分，培養(yǎng)時間過長菌體會出現(xiàn)死亡，都會影響收集的菌體量，從而影響抽提出的質(zhì)粒DNA的量。在接菌前，可以將保存的菌種先進(jìn)行活化，然后再接菌，可使過夜培養(yǎng)的菌液生長更充分，在一定范圍內(nèi)菌體量的增加，可以提高所提質(zhì)粒的濃度。3、宿主菌株：宿主菌株的種類將會影響質(zhì)粒的收獲量。含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株，HB101,如JM101,JM110,TGl以及它們的衍生菌株，通常因為內(nèi)源核酸酶的存在，或者在提取過程中釋放出來的核酸酶的作用下，將會顯著影響最終收獲量，或者純化到的質(zhì)粒容易降解，推薦將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至不含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株中，如Top10,DH5a進(jìn)行質(zhì)粒純化。4、質(zhì)?？截悢?shù)低：由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可■更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體，或者加大提取的菌液量，并減小洗脫時的體積。5、菌體中無質(zhì)粒：有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長期保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時應(yīng)接種單菌落。有時菌種保存一段時間后會出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的情況，導(dǎo)致無法提出質(zhì)粒，若有保存的質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)化后再挑取單克隆搖菌提質(zhì)粒。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。6、堿裂解不充分：