基因工程哺乳動物基因工程(1)課件

D高等哺乳動物的基因轉(zhuǎn)移8哺乳動物基因工程C高等哺乳動物的載體系統(tǒng)B高等哺乳動物的受體系統(tǒng)A高等哺乳動物基因工程的基本概念E利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)重組蛋白A高等哺乳動物基因工程的基本概念高等哺乳動物基因工程高等哺乳動物細胞基因表達技術(shù)高等哺乳動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因動物個體動物工程細胞哺乳動物遺傳性狀改良藥物篩選研究評價模型人體基因治療蛋白多肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)藥物篩選研究評價模型B高等哺乳動物的受體系統(tǒng)高等哺乳動物細胞的生長特性高等哺乳動物受體細胞的條件高等哺乳動物受體細胞的遺傳標記常用的高等哺乳動物受體細胞(二)高等哺乳動物受體細胞的條件以高效表達外源基因為目標的高等哺乳動物受體細胞應(yīng)具備下列條件細胞系特征喪失細胞接觸抑制性和錨地依賴性特征，便于大

規(guī)模培養(yǎng)合適的標記便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持生長快且齊分裂周期短，生長均一，便于控制遺傳穩(wěn)定性外源基因多次傳代后不至于丟失，易于長期保存大多數(shù)正常的高等哺乳動物細胞并不能同時具備上述條件，癌細胞能安全性能好不合成分泌致病物質(zhì)，不致癌滿足上述前四項要求，但在安全性能上有欠缺。（三）高等哺乳動物受體細胞的遺傳標記1.營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細胞5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）次黃嘌呤核苷一磷酸（HMP）次黃嘌呤核苷（HR）GMPAMP尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）胸腺嘧啶核苷（TR）嘌呤核苷酸生物合成途徑嘧啶核苷酸生物合成途徑次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）（TK）胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤（AP）氨基喋呤（AP）從頭合成途徑補救合成途徑胸腺嘧啶核苷激酶(TK)缺陷型受體細胞(tk

-)：不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上(HAT培養(yǎng)基)生長，載體上的標記基因tk能與之遺傳互補；次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)缺陷型受體細胞(hprt-)：不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上(HAT培養(yǎng)基)生長，載體上的標記基因hprt與之遺傳互補。2.哺乳動物受體細胞常見的遺傳選擇標記遺傳標記編碼產(chǎn)物篩選藥物作用機理APH-

氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶

G418

APH滅活G418DHFR

二氫葉酸還原酶

氨甲喋呤

DHFR變體抗氨甲喋呤

HPH-

潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶

潮霉素B

HPH滅活潮霉素BTK-

胸腺嘧啶核苷激酶

氨基喋呤

TK合成TMPXGPT-黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶

霉酚酸

XGPRT合成GMPADA-

腺嘌呤核苷脫氨酶

腺嘌呤木酮糖苷

ADA滅活Xyl-AC高等哺乳動物的載體系統(tǒng)人腺病毒DNA猴空泡病毒DNA（SV40）人乳多瘤病毒DNA（BKV）人牛痘病毒DNA2.腺病毒的基因組DNAITRITRE1E2E3E4IVa2VAL1L2L3L4L5腺病毒基因組DNA全長36kb，其包裝上限為原基因組的105%，DNA兩端各有一個反向重復(fù)序列（ITR）；E1-E4為早期基因，與病毒基因組的復(fù)制及晚期基因的表達調(diào)控有關(guān)，其中E3編碼晚期基因的調(diào)控因子；L1-L5為編碼病毒包裝蛋白的晚期基因；IVa2和VA均為病毒RNA聚合酶的亞基編碼基因。（二）猴多瘤病毒DNA（SV40）

SV40屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體，由VP1、VP2、VP3三種衣殼蛋白包裝而成，基因組為5224bp的雙鏈環(huán)狀DNA1.SV40的生物學(xué)特性SV40可以與所有哺乳動物宿主細胞中的組蛋白H2、H3、H4結(jié)合，從而使其DNA形成類似核小體的微型染色體結(jié)構(gòu)。SV40感染猴細胞時呈裂解型，不致癌；但感染嚙齒類動物后，便發(fā)生非同源整合而致癌。2.SV40的基因組DNA

t/T基因編碼病毒的小抗原和大SV40DNAoriVP2TVP3VP1t抗原與病毒的致癌作用密切相關(guān)SV40在裂解宿主細胞前的晚期狀態(tài)時，每個宿主細胞含有105個病毒DNA拷貝，因此十分適合用于高效表達外源蛋白3.SV40DNA-質(zhì)粒DNA雜合載體的構(gòu)建

重組的SV40DNA分子必須經(jīng)過包裝后才具有感染能力，因此，插入的外源DNA片段不能太大。為了盡量提高SV40的裝載量，必須刪除一些基因片段，因此重組的SV40分子必須與野生型病毒共感染受體細胞，才能形成有感染力的重組病毒顆粒。oriSV40oriAprviralgenegptpV2-GPTpBR322pBR322SV40pV2-GPT是一種SV40DNA與大腸桿菌質(zhì)粒DNA雜合的載體；gpt為細菌來源的谷氨酸-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因，用于篩選重組子。載體曾被成功地用于在猴腎細胞中表達有生物活性的兔b-珠蛋白。4.利用SV40DNA載體表達外源基因的程序SV40載體病毒晚期基因啟動子篩選標記ori缺陷的SV40輔助病毒去除細菌序列插入外源基因重組分子分離病毒DNA轉(zhuǎn)化篩選增殖感染（三）人乳多瘤病毒DNA（BKV）人乳多瘤病毒（BKV）屬于乳多瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，其基因組為雙鏈DNA，感染宿主細胞后基因不發(fā)生整合，獨立于染色體而自主復(fù)制，每個宿主細胞最高可達500個拷貝。1.人乳多瘤病毒的生物學(xué)特性2.人乳多瘤病毒表達載體的構(gòu)建BKV-E.coli穿梭載體BKVoriBKVgeneDREMMTPAprE.colioriSV40PNeor刪除編碼病毒核心蛋白和外殼蛋白的基因，并與大腸桿菌質(zhì)粒拼接，構(gòu)成穿梭載體；它不能整合，同時也不能形成成熟的病毒顆粒裂解受體細胞。安裝細胞色素P450dioxin介導(dǎo)的增強子DRE，控制小鼠乳腺癌啟動子MMTP，由其帶動外源基因的表達；SV40來源的啟動子控制Neor

標記基因，以G418篩選重組子。以此載體在人細胞系中表達b1-干擾素和單純皰疹病毒B蛋白獲得成功。目前廣泛使用的牛痘病毒表達系統(tǒng)是一種預(yù)先構(gòu)建好的重組病毒。其基因組上插入了一個可表達的大腸桿菌T7RNA聚合酶編碼基因；2.人牛痘病毒DNA表達載體的構(gòu)建在外源基因?qū)胧荏w細胞之前，先以上述的重組病毒感染細胞，使其大量表達T7RNA聚合酶；然后再將含有外源基因和T7啟動子的細菌型重組質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動物受體細胞，此時外源基因整合在受體細胞染色體DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表達出重組蛋白。人囊狀纖維化基因就是采用這種戰(zhàn)略高效表達的。3.利用人牛痘病毒載體表達外源基因的程序牛痘病毒啟動子T7RNA聚合酶基因T7啟動子外源基因細菌重組質(zhì)粒感染轉(zhuǎn)化培養(yǎng)收集（一）哺乳動物細胞的物理轉(zhuǎn)化法利用物理方法轉(zhuǎn)化高等哺乳動物細胞的主要優(yōu)點是外源基因表達盒中不含任何病毒基因序列，這對外源基因表達產(chǎn)物的分離純化減輕了負擔(dān)。但外源基因表達盒進入受體細胞后，往往以多拷貝的形式隨機整合在染色體DNA上，導(dǎo)致受體細胞基因滅活、外源基因不表達。將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解在磷酸緩沖液中，加入CaCl2溶液混勻，此時DNA被包裹在磷酸鈣晶體顆粒內(nèi)；1.磷酸鈣共沉淀法將上述制備的顆粒懸浮液滴入細胞培養(yǎng)皿中，37℃保溫4-16小時此時細胞膜形成吞噬泡，磷酸鈣晶體局部溶解膜結(jié)構(gòu)，DNA便進入受體細胞；棄去DNA溶液，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7天即可篩選轉(zhuǎn)化株。如果在外源DNA中摻入少量的受體細胞內(nèi)源性DNA可以提高轉(zhuǎn)化效率。利用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)化腫瘤病毒DNA，可使正常細胞轉(zhuǎn)化為癌細胞，這是人們對腫瘤發(fā)生機制的最早理解。將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解受體細胞懸浮液中，然后加入電擊轉(zhuǎn)化儀的樣品槽內(nèi)，兩端施加瞬時高壓電場，使細胞膜產(chǎn)生細小的縫隙，此時，DNA片段便可不經(jīng)過胞飲作用直接進入受體細胞。電擊轉(zhuǎn)化法常用于對磷酸鈣共沉淀法無效的細胞類型，如生長在懸浮液中的淋巴細胞等。2.電擊轉(zhuǎn)化法通過激素療法使雌鼠超數(shù)排卵，并與雄性小鼠交配，然后殺死雌鼠，從其輸卵管內(nèi)取出受精卵；上述程序多用于動物個體的轉(zhuǎn)基因過程，由于必須單細胞逐一操作，所以不太適用于基因的克隆和表達。4.顯微注射法借助于顯微鏡將純化的DNA溶液迅速注入到受精卵中變大了的雄性原核內(nèi)。血影細胞是指哺乳動物的紅細胞在機械作用、病毒誘導(dǎo)、低滲環(huán)境下發(fā)生溶血，血紅蛋白大量溢出，最后形成僅被細胞膜包裹的細胞核結(jié)構(gòu)。因此，可先將外源DNA轉(zhuǎn)入血影細胞，然后再將血影細胞與受體細胞在適當條件下發(fā)生融合，從而將外源DNA轉(zhuǎn)入受體細胞。5.血影細胞介導(dǎo)法在溶血過程中，紅細胞膜的通透性大增，在血紅蛋白溢出的同時，外源DNA也容易進入。當上述外界條件消失后，紅細胞膜又可恢復(fù)原來的通透性。(二)哺乳動物細胞的病毒轉(zhuǎn)染法

以病毒DNA為載體可以將外源基因直接轉(zhuǎn)染或與野生型病毒顆粒共轉(zhuǎn)染特定的受體細胞。這種方法具有定向性好、實驗重復(fù)性佳、導(dǎo)入效率高等優(yōu)點，但也存在一定的缺陷，如目前常用的載體宿主范圍有限，往往無法轉(zhuǎn)染一些具有重要經(jīng)濟價值的家禽和牲畜細胞等。E利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)重組蛋白哺乳動物細胞高效表達外源蛋白的基本原理利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)人組織型纖溶酶原激活劑利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)人凝血因子VIII（一）哺乳動物細胞高效表達外源蛋白的基本原理基因擴增是外源基因在哺乳動物細胞內(nèi)高效穩(wěn)定表達的一種特殊方式。1.通過強化基因擴增高效表達外源基因氨甲喋呤(MTX)是動物細胞中的關(guān)鍵代謝酶二氫葉酸還原酶(DHFR)的特異性抑制劑，細胞培養(yǎng)物經(jīng)氨甲喋呤處理后，絕大多數(shù)細胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來的抗性細胞中，dhfr基因均得以擴增。這些抗性細胞正是通過增加相關(guān)基因的拷貝數(shù)、提高關(guān)鍵代謝酶的表達水平，從而抵消氨甲喋呤的抑制效應(yīng)。更重要的是，擴增的區(qū)域遠遠大于dhfr基因本身，即與dhfr基因相鄰的DNA區(qū)域同時被擴增。1)DHFR-MTX高效表達系統(tǒng)DHFR-MTX高效表達系示意圖外源基因dhfr轉(zhuǎn)染dhfr-細胞系單克隆培養(yǎng)轉(zhuǎn)移0.05mMMTX培養(yǎng)單克隆轉(zhuǎn)移培養(yǎng)單克隆轉(zhuǎn)移5mMMTX0.25mMMTX培養(yǎng)單克隆外源基因擴增至100拷貝2)GS-MSX高效表達系統(tǒng)谷氨酰胺合成酶（GS）能解除甲硫氨酸亞砜（MSX）對動物細胞的毒害作用。先將帶有GS編碼基因的載體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的哺乳動物細胞中，由于只有多拷貝的GS編碼基因才能抗MSX，所以在轉(zhuǎn)染過程中不必使用GS缺陷型的受體細胞；而且在正常的MSX濃度下就能篩選到含有高拷貝外源基因的轉(zhuǎn)染細胞，這是GS-MSX系統(tǒng)比DHFR-MTX系統(tǒng)優(yōu)越之處。2.通過強化基因轉(zhuǎn)錄高效表達外源基因在載體上安裝病毒或細胞來源的強啟動子以及有效的翻譯元件，也是使外源基因高效表達的一種手段，如：AprM13oriColE1oriCMVPPolylinkerGeneIntronSV40TPolyAsignal高效表達載體mRNA前體AAAAAAAAAmRNA細胞巨化病毒CMV的啟動子動物珠蛋白基因的內(nèi)含子SV40的終止子和polyA化信號序列絕大多數(shù)哺乳動物細胞的表達型載體上攜帶內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，因為mRNA前體的剪切能促進成熟mRNA向胞質(zhì)的運輸，有利于翻譯。有的還含有各種信號肽序列。3.利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)的重組蛋白迄今為止，已有大約300種重組蛋白藥物正在進行臨床試驗，但在哺乳動物工程細胞中大規(guī)模生產(chǎn)的只有少數(shù)幾種：b

干擾素 g

干擾素凝血因子VIII 凝血因子IX促紅細胞生成素（EPO） 生長因子（hGH）白介素2（IL-2） 乙型肝炎表面抗原單克隆抗體 CD4受體組織型纖溶酶原激活劑（tPA） 4.利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體大多數(shù)惡性淋巴瘤細胞表面上都有一種特異性的糖蛋白campath；b

肌動蛋白啟動子抗體輕鏈cDNAb

肌動蛋白終止子pLdhfrSV40啟動子Neor鼠金屬硫蛋白啟動子β肌動蛋白啟動子抗體重鏈cDNAb

肌動蛋白終止子pH用人源化的小鼠抗campath抗體治療非霍金淋巴細胞瘤患者，效果良好。重組抗體采用DHFR-MTX系統(tǒng)表達。5.利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)人組織纖溶酶原激活劑第一個由重組哺乳動物細胞規(guī)?；a(chǎn)的醫(yī)用蛋白是治療急性心肌梗塞的溶血栓藥物：人組織纖溶酶原激活劑（tPA）。同樣