MERS-CoV的樣品采集和實驗室檢測課件

MERS-CoV的樣品采集和實驗室檢測一、概況中東呼吸綜合征冠狀病毒（MiddleEastRespirtorySyndromeCoronavirus,MERS-CoV)2012年6月13日，沙特診斷首例中東呼吸綜合征。追溯調(diào)查，2012年3月該病就已經(jīng)在中東存在。一、概況2012年9月，命名為新型冠狀病毒（novelcoronavirus)。2013年5月23日，由國際病毒分類委員會命名為中東呼吸綜合征冠狀病毒（97.8%）。20多個國家有病例報告，均和中東有流行病學(xué)關(guān)聯(lián)，中東以外地區(qū)尚為發(fā)現(xiàn)原發(fā)感染病例。病原學(xué)β類冠狀病毒的2c亞群，無包膜，單股正鏈的RNA病毒。和蝙蝠的CoV基因相似性70.1%，和SARS病毒的基因相似性54.9%。MERS-CoV受體二肽基肽酶（hDPP4，也稱為CD26)，位于人深部呼吸道組織。該受體宿主分布廣泛：蝙蝠、人、豬二、病例定義疑似病例符合流行病學(xué)史和臨床表現(xiàn)，但尚無實驗室確認依據(jù)。中東呼吸綜合征病例診療方案（2014年版）臨床診斷病例滿足疑似病例標(biāo)準(zhǔn)，僅有實驗室陽性篩查結(jié)果（如僅呈單靶標(biāo)PCR或單份血清抗體陽性）的患者。滿足疑似病例標(biāo)準(zhǔn)，因僅有單份采集或處理不當(dāng)?shù)臉?biāo)本而導(dǎo)致實驗室檢測結(jié)果陰性或無法判斷結(jié)果的患者。中東呼吸綜合征病例診療方案（2014年版）無癥狀感染者無臨床癥狀，但具備實驗室確診依據(jù)4項之一者。中東呼吸綜合征病例診療方案（2014年版）三、實驗室檢測方法病毒分離病毒核酸檢測血清免疫學(xué)檢測采集對象疑似病例密接者不作為采樣對象。特殊情況下，當(dāng)能夠證明密接者連續(xù)14天接觸患者時，可采集密接者上呼吸道標(biāo)本。采集的標(biāo)本下呼吸道標(biāo)本的病毒載量高。上呼吸道標(biāo)本亦可檢出。血液標(biāo)本中可檢出病毒、抗體。尿、糞便標(biāo)本病毒載量較低。采樣的時間PCR法檢測的標(biāo)本在發(fā)病7天內(nèi)采集。解除隔離前，連續(xù)2天采集?？贵w檢測的血液標(biāo)本采集時間雙份血：第1份血液標(biāo)本：發(fā)病7天內(nèi)；第2份血液標(biāo)本：第1份血液標(biāo)本采集后，間隔14-21天采集。單份血：發(fā)病14天后采集。標(biāo)本采集主要材料無菌拭子：聚丙烯纖維頭的拭子。15ml的采樣管、帶螺旋蓋的器皿。3ml病毒保存液、生理鹽水等。真空采血管（紅、黃、橙黃）、采血針等。標(biāo)本的采集方法下呼吸道標(biāo)本：痰：由患者直接將痰液收集于有蓋能夠密閉的無菌器皿內(nèi)。抽吸液：將真空泵與導(dǎo)尿管相連。將導(dǎo)尿管插入鼻腔與上腭平行，打開真空裝置，緩慢抽吸，同樣收集另外一個鼻孔。用病毒采樣液3mL涮洗導(dǎo)尿管。采樣液收集于采樣管內(nèi)。上呼吸道標(biāo)本咽拭子：右手握筆式持無菌拭子擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將拭子頭浸入病毒保存液中，擠壓拭子頭部數(shù)次，用力折斷拭子的尾部，將拭子的尾部棄去。血清標(biāo)本的采集真空采血管：選擇紅色、黃色、橙黃色蓋的管子。根據(jù)采集對象具體情況選擇采集部位，消毒，采血針穿刺充盈的靜脈血管，真空采血管負壓采集5ml靜脈血。止血。上下顛倒采血管5次。標(biāo)注采血管：編號、患者姓名等。采血管放置30min后，2h內(nèi)分離提取血清。血清管標(biāo)注與原采血管一致。（二）標(biāo)本的保存和運輸標(biāo)本采集后盡快送到實驗室。如果不能在72h小時內(nèi)送到實驗室，建議保存在-80℃冰箱或者干冰、液氮上。避免反復(fù)凍融標(biāo)本。運送時，三層包裝：密閉的采樣管、密封罐，防破碎、針刺的采樣箱。樣品周圍有冰排。全血應(yīng)該分離血清保存4℃或者-20℃凍存。不建議保存于無霜冰箱，因為其溫度變動范圍大。專人專車。

標(biāo)本的簽收標(biāo)本保存及運輸正確；標(biāo)本狀態(tài)完好，無泄漏；送檢單填寫字跡清晰、內(nèi)容完整，與標(biāo)本信息一一對應(yīng)。送樣者和收樣者簽字，并記錄時間。核酸檢測方法rRT-PCR法：有3種靶目標(biāo)rRT-PCR檢測法。有檢測E蛋白上游基因（upE），有檢測開放閱讀框1b（ORF1b），開放閱讀框1a(ORF1a)上靶目標(biāo)的方法。美國CDC發(fā)展了另外的rRT-PCR法檢測MERS-CoV的核衣殼蛋白基因（N)，能夠?qū)pE和ORF1a方法的篩選和診斷以補充。測序：RNA依賴RNA聚合酶（RdRp)或者N基因序列測序MERS-CoV病毒核酸檢測1.檢測方法實時熒光RT-PCR(rRT-PCR）技術(shù)，病毒核酸檢測的特異性和敏感性最好，且能快速區(qū)分病毒類型和亞型，一般能在4-6小時內(nèi)獲得結(jié)果。rRT-PCR技術(shù)作為常規(guī)檢測方法。MERS-CoV病毒基因序列測序2.具體做法及實驗結(jié)果判定至少雙靶標(biāo)PCR檢測陽性。或者單個靶標(biāo)PCR陽性產(chǎn)物，經(jīng)基因測序確認。upE的rRT-PCR檢測，陰性者，否定。陽性者，進一步用rRT-PCR法檢測ORF1a，陽性者，確診。陰性者，進一步使用RdRp或者N基因序列測序法檢測，如果序列不吻合，則判為陰性。核酸檢測結(jié)果陰性，可再次采樣檢測。rRT-PCR假陰性結(jié)果標(biāo)本質(zhì)量不好；標(biāo)本采集時間晚，或早于發(fā)病時間；標(biāo)本處理和運送不合適；其它技術(shù)原因：如病毒變異或者PCR被抑制。（三）血清中抗體檢測方法IFA法ELISA法NT法血清學(xué)檢測恢復(fù)期血清中東呼吸綜合征冠狀病毒抗體較急性期血清抗體水平呈4倍以上升高，證實為MERS-CoV陽性病例。單份血清（恢復(fù)期血清）中東呼吸綜合征冠狀病毒抗體陽性，證實有感染。人群血清學(xué)檢測：感染率調(diào)查；確定危險人群。試劑需要向相關(guān)實驗室索要。四、解除隔離體溫基本正常、臨床癥狀好轉(zhuǎn)，病原學(xué)檢測連續(xù)兩次陰性，可出院或轉(zhuǎn)至其他相應(yīng)科室治療其他疾病。五、總結(jié)MERS-CoV是個新型病毒。實