分子生物學(xué)-質(zhì)粒課件

分子生物學(xué)李松2022/11/261分子生物學(xué)李松2022/11/261質(zhì)粒2質(zhì)粒2用于基因克隆的載體質(zhì)粒（plasmid）噬菌體或病毒DNA考斯質(zhì)粒（cosmid）與噬菌粒人造染色體載體用于基因克隆的載體質(zhì)粒（plasmid）噬菌體或病毒DNA考載體的功能及特征運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件載體的功能及特征運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)載體應(yīng)具備的條件具有針對受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）

具有合適的篩選標(biāo)記具有較高的外源DNA的載裝能力具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點或整合位點載體應(yīng)具備的條件具有針對受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子質(zhì)粒常見于原核細(xì)菌和真菌中絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA（covalentlyclosedcircularDNA）質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1-300kb質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨立于寄主染色體而自質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應(yīng)關(guān)系根據(jù)在每個細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒1-3拷貝stringentplasmid松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒10-60拷貝stringentplasmid質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時存在于一個細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容粒組成不相容性群。質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時質(zhì)粒的不相容性：分子機(jī)制兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)。其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢。質(zhì)粒的不相容性：分子機(jī)制兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等；如Col、R的其它成員；非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個過程由bom和mob基因決定質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性菌的質(zhì)粒可分成兩大類：接合型質(zhì)粒攜帶特殊的遺傳標(biāo)記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物物質(zhì)合成抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義攜帶特殊的遺傳標(biāo)記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳質(zhì)粒的構(gòu)建天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。目前實驗室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個野生型質(zhì)粒構(gòu)建的：pSC1018.8kb拷貝數(shù)5四環(huán)素抗性標(biāo)記基因TcrColE16.5kb拷貝數(shù)20-30大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因E1RSF2124ColE1衍生質(zhì)粒氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因Apr質(zhì)粒的構(gòu)建天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：高拷貝質(zhì)粒突變拷貝數(shù)控制基因拷貝數(shù)1000-3000擴(kuò)增基因低拷貝質(zhì)粒來自pSC101拷貝數(shù)小于10

表達(dá)某些毒性基因溫敏質(zhì)粒在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)測序質(zhì)粒含有測序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker整合質(zhì)粒裝有整合促進(jìn)基因及位點便于外源基因的整合穿梭質(zhì)粒裝有針對兩種不同受體的復(fù)制子便于基因克隆表達(dá)質(zhì)粒裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒裝有報告基因便于啟動子等元件的克隆篩選人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：高拷貝質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制pBR322：氯霉素可擴(kuò)增拷貝數(shù)50-100/cell用于基因克隆重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制pBR322：氯霉素可擴(kuò)pUC18/19：拷貝數(shù)2000-3000/cell用于基因克隆和測序裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標(biāo)記lacZ’pUC18/19：拷貝數(shù)2000-3000/質(zhì)粒表達(dá)型質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)質(zhì)粒表達(dá)型質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)172022/11/26常用克隆載體類型：T-載體，pUC系列，pMD系列，一些表達(dá)型質(zhì)粒特點：功能單位小，拷貝數(shù)多172022/11/26常用克隆載體類型：T-載體，pUC系182022/11/26T-vector182022/11/26T-vector192022/11/26BluewhiteScreen192022/11/26BluewhiteScreen202022/11/26202022/11/26212022/11/26常用表達(dá)系統(tǒng)原核細(xì)胞：大腸桿菌、芽孢桿菌等真核細(xì)胞：絲狀真菌、酵母、昆蟲、哺乳動物細(xì)胞等212022/11/26常用表達(dá)系統(tǒng)原核細(xì)胞：大腸桿菌、芽孢質(zhì)粒DNA的分離純化實驗室一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒DNA：氯化銫密度梯度離心法

質(zhì)粒DNA純度高、周期長、設(shè)備要求高、溴乙錠污染堿溶法

質(zhì)粒DNA純度底、快速、操作簡便沸水浴法

質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間質(zhì)粒DNA的分離純化實驗室一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒DNA堿溶法：

用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁加NaOH和SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物

加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質(zhì)離心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白質(zhì)乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒DNA用無DNase的RNase去除殘余的RNA

cccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA堿溶法：用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)分子生物學(xué)李松2022/11/2624分子生物學(xué)李松2022/11/261質(zhì)粒25質(zhì)粒2用于基因克隆的載體質(zhì)粒（plasmid）噬菌體或病毒DNA考斯質(zhì)粒（cosmid）與噬菌粒人造染色體載體用于基因克隆的載體質(zhì)粒（plasmid）噬菌體或病毒DNA考載體的功能及特征運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件載體的功能及特征運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)載體應(yīng)具備的條件具有針對受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）

具有合適的篩選標(biāo)記具有較高的外源DNA的載裝能力具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點或整合位點載體應(yīng)具備的條件具有針對受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子質(zhì)粒常見于原核細(xì)菌和真菌中絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA（covalentlyclosedcircularDNA）質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1-300kb質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨立于寄主染色體而自質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應(yīng)關(guān)系根據(jù)在每個細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒1-3拷貝stringentplasmid松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒10-60拷貝stringentplasmid質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時存在于一個細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容粒組成不相容性群。質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時質(zhì)粒的不相容性：分子機(jī)制兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)。其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢。質(zhì)粒的不相容性：分子機(jī)制兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性菌的質(zhì)粒可分成兩大類：接合型質(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等；如Col、R的其它成員；非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個過程由bom和mob基因決定質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|(zhì)粒攜帶特殊的遺傳標(biāo)記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物物質(zhì)合成抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義攜帶特殊的遺傳標(biāo)記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳質(zhì)粒的構(gòu)建天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。目前實驗室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個野生型質(zhì)粒構(gòu)建的：pSC1018.8kb拷貝數(shù)5四環(huán)素抗性標(biāo)記基因TcrColE16.5kb拷貝數(shù)20-30大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因E1RSF2124ColE1衍生質(zhì)粒氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因Apr質(zhì)粒的構(gòu)建天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：高拷貝質(zhì)粒突變拷貝數(shù)控制基因拷貝數(shù)1000-3000擴(kuò)增基因低拷貝質(zhì)粒來自pSC101拷貝數(shù)小于10

表達(dá)某些毒性基因溫敏質(zhì)粒在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)測序質(zhì)粒含有測序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker整合質(zhì)粒裝有整合促進(jìn)基因及位點便于外源基因的整合穿梭質(zhì)粒裝有針對兩種不同受體的復(fù)制子便于基因克隆表達(dá)質(zhì)粒裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒裝有報告基因便于啟動子等元件的克隆篩選人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：高拷貝質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制pBR322：氯霉素可擴(kuò)增拷貝數(shù)50-100/cell用于基因克隆重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制pBR322：氯霉素可擴(kuò)pUC18/19：拷貝數(shù)2000-3000/cell用于基因克隆和測序裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標(biāo)記lacZ’pUC18/19：拷貝數(shù)2000-3000/質(zhì)粒表達(dá)型質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)質(zhì)粒表達(dá)型質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)402022/11/26常用克隆載體類型：T-載體，pUC系列，pMD系列，一些表達(dá)型質(zhì)粒特點：功能單位小，拷貝數(shù)多172022/11/26常用克隆載體類型：T-載