三懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察課件

實(shí)驗(yàn)三懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞

的培養(yǎng)與觀察實(shí)驗(yàn)三懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞

1細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念

細(xì)胞傳代：細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定時(shí)間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念2三懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察課件3細(xì)胞系cellline細(xì)胞株cellstrain

三懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察課件4培養(yǎng)細(xì)胞的特性培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式貼附生長(zhǎng)：必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)。見于各種實(shí)體瘤細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)：于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的特性5

每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程游離期貼壁期潛伏期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期停止期（平臺(tái)期）

每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程6游離期：

細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。

10分鐘一4小時(shí)游離期：7貼壁期：

細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時(shí)貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長(zhǎng)基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）貼壁期：8三懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察課件9潛伏期此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)話動(dòng)，而無細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時(shí)。潛伏期10對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：11停止期（平臺(tái)期）：細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性停止期（平臺(tái)期）：12培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件1細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要2細(xì)胞的生存環(huán)境溫度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4滲透壓3無污染4無毒培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件1細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要13

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用品：超凈工作臺(tái)，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器液氮罐自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)吸引器，培養(yǎng)板，凍存管

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用品：14壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣電熱干燥箱：干熱消毒（160℃，2小時(shí)）。主要用干玻璃器皿消毒濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌超凈工作臺(tái)：為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒

三懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察課件15無菌細(xì)胞培養(yǎng)室無菌細(xì)胞培養(yǎng)室16其它物品細(xì)胞凍存管其它物品細(xì)胞凍存管17超凈臺(tái)超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。

超凈臺(tái)超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾器除18濾器濾器19三懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察課件20CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃，14h)。③箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000毫升，以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃21三懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察課件22自動(dòng)雙重純水蒸餾器純水儀自動(dòng)雙重純水蒸餾器23酶標(biāo)儀微孔板震蕩器酶標(biāo)儀24培養(yǎng)板培養(yǎng)板25培養(yǎng)瓶培養(yǎng)瓶26常用玻璃器皿清洗浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小時(shí)）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50℃烘干常用玻璃器皿清洗27清潔液的配制清潔液的配制282細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20加水至1000ml2細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制29消化液：

胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。

胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用消化液：30培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來源受限。成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然31合成培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類32人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。

人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)33血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子③激素④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等⑤各種生長(zhǎng)因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分血清中含有：34一般說來．含5％小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死．但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加10％血清．血清中不僅存在促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，提供細(xì)胞體外適于生存的微環(huán)境．一般說來．含5％小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死35血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56℃，30分鐘血清的消毒：過濾除菌血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。36抗菌素的使用：在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100u?？咕氐氖褂茫?7完全培養(yǎng)基的組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％碳酸氫鈉2.0g/L青、鏈霉素各100卑位／毫升完全培養(yǎng)基的組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基38完全培養(yǎng)基的配制RPMI-1640培養(yǎng)粉1袋碳酸氫鈉2.0g青、鏈霉素各100單位／毫升

加三蒸水至1000ml,過濾除菌。

調(diào)節(jié)pH值至7.2

加血清（終濃度10％）

完全培養(yǎng)基的配制39細(xì)胞傳代方法根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有3種：

1懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。細(xì)胞傳代方法根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有3種：402半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代

此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。3貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代

采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。2半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代41一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.掌握觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)狀況的方法。2.掌握細(xì)胞傳代的方法。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.掌握觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)狀況的方42二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從培養(yǎng)瓶以大于或等于1：2的比例轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的操作過程。傳代后的細(xì)胞生長(zhǎng)密度降低，可獲取新鮮培養(yǎng)基中的豐富營(yíng)養(yǎng)，有利于細(xì)胞在體外環(huán)境更好的生長(zhǎng)與繁殖。二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從培養(yǎng)瓶以大于或等于1：2的43三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑

1.材料：懸浮細(xì)胞、貼壁細(xì)胞2.器材與儀器：刻度吸管、吸球、橡皮吸頭、培養(yǎng)瓶（小方瓶或中方瓶）、華氏管等。（上述器材需徹底清洗，玻璃器材160?C烤干或塑料器材烘干，包裝后高壓蒸汽滅菌30min或輻照滅菌，備用。）超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、酒精燈、酒精棉球、試管架、記號(hào)筆、廢液缸等。3.試劑：無鈣鎂PBS溶液、0.25%胰蛋白酶等。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑

1.材料：懸浮細(xì)胞、貼壁細(xì)胞44四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、準(zhǔn)備工作：1）肥皂洗手，在進(jìn)行無菌操作前，用75%的酒精擦拭雙手，注意指間，和指甲周圍。同時(shí)，用酒精棉球擦拭超凈臺(tái)。2）將培養(yǎng)液放置室溫，備用。3）打開超凈臺(tái)內(nèi)的紫外燈，照射20min。同時(shí)，將實(shí)驗(yàn)所需材料也放入超凈臺(tái)進(jìn)行滅菌（血清、培養(yǎng)基除外）4）倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞的狀態(tài)，是否已經(jīng)長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶，需要進(jìn)行分瓶。2、關(guān)閉超凈臺(tái)的紫外燈，打開風(fēng)機(jī)。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、準(zhǔn)備工作：1）肥皂洗手，在進(jìn)行無菌操作前，用453、點(diǎn)燃酒精燈，取出刻度吸管，在火焰上略燒，然后，安上吸球待用。4、在打開培養(yǎng)瓶之前，用酒精棉球擦拭瓶蓋，打開后，瓶口在酒精燈上過火焰，再用吸管輕輕吸出舊的培養(yǎng)液，注意吸管不要碰到布滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶的側(cè)壁。加入無鈣鎂PBS洗滌細(xì)胞，再用吸管吸去液體。5、對(duì)于貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法，將0.25%胰酶加入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，顯微鏡下隨時(shí)觀察，見到細(xì)胞的突起消失、細(xì)胞變圓時(shí)，立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，吸出胰酶。記住不要消化時(shí)間過長(zhǎng)，否則，細(xì)胞會(huì)被胰酶消化掉。6、加入適量無鈣鎂PBS或培養(yǎng)基清洗一遍，立即倒掉。3、點(diǎn)燃酒精燈，取出刻度吸管，在火焰上略燒，然后，安上吸球待467、加入含有10%血清的培養(yǎng)基，用吸管吹打細(xì)胞，一定要輕輕吹打，使其從瓶壁上脫落分散到培養(yǎng)基中，再補(bǔ)加培養(yǎng)基，按1:3進(jìn)行分瓶。然后，用火焰燒培養(yǎng)瓶的瓶口和蓋，再蓋好培養(yǎng)瓶的蓋，在瓶外注明細(xì)胞名稱、日期、實(shí)驗(yàn)人員姓名等，放入CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于懸浮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法，只需要將細(xì)胞進(jìn)行離心，1000rpm/5min，然后，換入新的培養(yǎng)基即可，再分裝到不同的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。不健康的細(xì)胞質(zhì)中有空泡，細(xì)胞內(nèi)有顆粒樣物質(zhì)，細(xì)胞間空隙增大、變形、不規(guī)則，失去原有的特點(diǎn)。7、加入含有10%血清的培養(yǎng)基，用吸管吹打細(xì)胞，一定要輕輕吹478、結(jié)果觀察一般情況下，傳代后的貼壁細(xì)胞在2h后貼壁，2~4d可在瓶底形成單層，需要再次進(jìn)行傳代。細(xì)胞培養(yǎng)過程中，需要每天在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，重點(diǎn)注意以下幾點(diǎn)：1）觀察細(xì)胞是否污染。注意培養(yǎng)液的顏色變化與澄清與否。2）觀察細(xì)胞是否增殖，細(xì)胞密度是否發(fā)生變化。3）觀察細(xì)胞形態(tài)特征。4）對(duì)活細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例，可用0.5%臺(tái)盼藍(lán)染液進(jìn)行染色。8、結(jié)果觀察48五、注意事項(xiàng)

注意每個(gè)操作環(huán)節(jié)，嚴(yán)格防止細(xì)胞污染。傳代或換液24~48h注意觀察細(xì)胞是否被污染，污染的細(xì)胞培養(yǎng)液變渾濁，鏡下可見有大量菌絲。如果細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)特性改變，胞質(zhì)內(nèi)顆粒性物質(zhì)增多，盡管培養(yǎng)液不變渾濁，考慮可能有支原體污染。污染的細(xì)胞立即從培養(yǎng)箱中取走，以免污染其它細(xì)胞。

五、注意事項(xiàng)

注意每個(gè)操作環(huán)節(jié)，嚴(yán)格防止細(xì)胞污染。傳代或換液49細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定（示教）原理：生長(zhǎng)曲線的測(cè)定（計(jì)數(shù)法）是測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)生長(zhǎng)數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，為培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。生長(zhǎng)曲線常用于測(cè)定細(xì)胞體外生長(zhǎng)的趨勢(shì)或藥物等外來因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。一般細(xì)胞傳代之后，經(jīng)過短暫的懸浮到貼壁，隨后經(jīng)歷潛伏期，再進(jìn)入大量分裂的指數(shù)生長(zhǎng)期。在細(xì)胞達(dá)到飽和密度后，停止生長(zhǎng)，進(jìn)入平頂期，然后退化衰亡。

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定（示教）原理：50實(shí)驗(yàn)器材與試劑：1、器材：細(xì)胞培養(yǎng)所需器材（同前）、細(xì)胞計(jì)數(shù)器、倒置顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、微量加樣器、塑料槍頭等2、試劑：完全培養(yǎng)基、無鈣鎂PBS、0.25%胰酶溶液、0.5%臺(tái)盼藍(lán)染液、藥物實(shí)驗(yàn)器材與試劑：51正常細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：1.

胰酶消化細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基中止，輕輕吹打，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。2.根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，每個(gè)方瓶中接種細(xì)胞3×105個(gè)，加3ml培養(yǎng)基，共接種7瓶（由于是學(xué)生實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞用量較大，故每實(shí)驗(yàn)組不做重復(fù)計(jì)數(shù)，最后可用每班所計(jì)數(shù)的值求均數(shù)。也可接種9瓶細(xì)胞，計(jì)數(shù)9天）。3.每間隔24h，共7天，分別計(jì)數(shù)每瓶細(xì)胞數(shù)。4.計(jì)數(shù)時(shí)，用胰酶消化至鏡下見細(xì)胞縮成圓形，用一定體積的原培養(yǎng)基中止消化，然后將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，再用27ul細(xì)胞加入3ul臺(tái)盼藍(lán)染色液混合，顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，換算成單位體積的活細(xì)胞數(shù)（根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的濃度，細(xì)胞懸液與臺(tái)盼藍(lán)染色液的比例可調(diào)整）。以每班計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)取平均數(shù)。6.以細(xì)胞數(shù)（105/ml）為縱軸，以時(shí)間（h或d）為橫軸，繪制生長(zhǎng)曲線圖。7.繪制實(shí)驗(yàn)結(jié)果。正常細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：52正常細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖正常細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖53復(fù)習(xí)思考題：細(xì)胞培養(yǎng)的過程中應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？復(fù)習(xí)思考題：54實(shí)驗(yàn)三懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞

的培養(yǎng)與觀察實(shí)驗(yàn)三懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞

55細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念

細(xì)胞傳代：細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定時(shí)間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念56三懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察課件57細(xì)胞系cellline細(xì)胞株cellstrain

三懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察課件58培養(yǎng)細(xì)胞的特性培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式貼附生長(zhǎng)：必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)。見于各種實(shí)體瘤細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)：于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的特性59

每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程游離期貼壁期潛伏期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期停止期（平臺(tái)期）

每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程60游離期：

細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。

10分鐘一4小時(shí)游離期：61貼壁期：

細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時(shí)貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長(zhǎng)基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）貼壁期：62三懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察課件63潛伏期此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)話動(dòng)，而無細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時(shí)。潛伏期64對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：65停止期（平臺(tái)期）：細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性停止期（平臺(tái)期）：66培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件1細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要2細(xì)胞的生存環(huán)境溫度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4滲透壓3無污染4無毒培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件1細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要67

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用品：超凈工作臺(tái)，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器液氮罐自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)吸引器，培養(yǎng)板，凍存管

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用品：68壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣電熱干燥箱：干熱消毒（160℃，2小時(shí)）。主要用干玻璃器皿消毒濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌超凈工作臺(tái)：為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒

三懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察課件69無菌細(xì)胞培養(yǎng)室無菌細(xì)胞培養(yǎng)室70其它物品細(xì)胞凍存管其它物品細(xì)胞凍存管71超凈臺(tái)超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。

超凈臺(tái)超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾器除72濾器濾器73三懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察課件74CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃，14h)。③箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000毫升，以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃75三懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察課件76自動(dòng)雙重純水蒸餾器純水儀自動(dòng)雙重純水蒸餾器77酶標(biāo)儀微孔板震蕩器酶標(biāo)儀78培養(yǎng)板培養(yǎng)板79培養(yǎng)瓶培養(yǎng)瓶80常用玻璃器皿清洗浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小時(shí)）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50℃烘干常用玻璃器皿清洗81清潔液的配制清潔液的配制822細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20加水至1000ml2細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制83消化液：

胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。

胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用消化液：84培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來源受限。成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然85合成培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類86人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。

人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)87血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子③激素④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等⑤各種生長(zhǎng)因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分血清中含有：88一般說來．含5％小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死．但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加10％血清．血清中不僅存在促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，提供細(xì)胞體外適于生存的微環(huán)境．一般說來．含5％小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死89血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56℃，30分鐘血清的消毒：過濾除菌血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。90抗菌素的使用：在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100u?？咕氐氖褂茫?1完全培養(yǎng)基的組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％碳酸氫鈉2.0g/L青、鏈霉素各100卑位／毫升完全培養(yǎng)基的組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基92完全培養(yǎng)基的配制RPMI-1640培養(yǎng)粉1袋碳酸氫鈉2.0g青、鏈霉素各100單位／毫升

加三蒸水至1000ml,過濾除菌。

調(diào)節(jié)pH值至7.2

加血清（終濃度10％）

完全培養(yǎng)基的配制93細(xì)胞傳代方法根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有3種：

1懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。細(xì)胞傳代方法根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有3種：942半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代

此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。3貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代

采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。2半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代95一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.掌握觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)狀況的方法。2.掌握細(xì)胞傳代的方法。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.掌握觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)狀況的方96二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從培養(yǎng)瓶以大于或等于1：2的比例轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的操作過程。傳代后的細(xì)胞生長(zhǎng)密度降低，可獲取新鮮培養(yǎng)基中的豐富營(yíng)養(yǎng)，有利于細(xì)胞在體外環(huán)境更好的生長(zhǎng)與繁殖。二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從培養(yǎng)瓶以大于或等于1：2的97三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑

1.材料：懸浮細(xì)胞、貼壁細(xì)胞2.器材與儀器：刻度吸管、吸球、橡皮吸頭、培養(yǎng)瓶（小方瓶或中方瓶）、華氏管等。（上述器材需徹底清洗，玻璃器材160?C烤干或塑料器材烘干，包裝后高壓蒸汽滅菌30min或輻照滅菌，備用。）超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、酒精燈、酒精棉球、試管架、記號(hào)筆、廢液缸等。3.試劑：無鈣鎂PBS溶液、0.25%胰蛋白酶等。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑

1.材料：懸浮細(xì)胞、貼壁細(xì)胞98四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、準(zhǔn)備工作：1）肥皂洗手，在進(jìn)行無菌操作前，用75%的酒精擦拭雙手，注意指間，和指甲周圍。同時(shí)，用酒精棉球擦拭超凈臺(tái)。2）將培養(yǎng)液放置室溫，備用。3）打開超凈臺(tái)內(nèi)的紫外燈，照射20min。同時(shí)，將實(shí)驗(yàn)所需材料也放入超凈臺(tái)進(jìn)行滅菌（血清、培養(yǎng)基除外）4）倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞的狀態(tài)，是否已經(jīng)長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶，需要進(jìn)行分瓶。2、關(guān)閉超凈臺(tái)的紫外燈，打開風(fēng)機(jī)。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、準(zhǔn)備工作：1）肥皂洗手，在進(jìn)行無菌操作前，用993、點(diǎn)燃酒精燈，取出刻度吸管，在火焰上略燒，然后，安上吸球待用。4、在打開培養(yǎng)瓶之前，用酒精棉球擦拭瓶蓋，打開后，瓶口在酒精燈上過火焰，再用吸管輕輕吸出舊的培養(yǎng)液，注意吸管不要碰到布滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶的側(cè)壁。加入無鈣鎂PBS洗滌細(xì)胞，再用吸管吸去液體。5、對(duì)于貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法，將0.25%胰酶加入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，顯微鏡下隨時(shí)觀察，見到細(xì)胞的突起消失、細(xì)胞變圓時(shí)，立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，吸出胰酶。記住不要消化時(shí)間過長(zhǎng)，否則，細(xì)胞會(huì)被胰酶消化掉。6、加入適量無鈣鎂PBS或培養(yǎng)基清洗一遍，立即倒掉。3、點(diǎn)燃酒精燈，取出刻度吸管，在火焰上略燒，然后，安上吸球待1007、加入含有10%血清的培養(yǎng)基，用吸管吹打細(xì)胞，一定要輕輕吹打，使其從瓶壁上脫落分散到培養(yǎng)基中