混合系列蛋白激酶樣結構域MLKL通過磷酸化RIP3引發(fā)壞死性的膜破裂課件

混合系列蛋白激酶樣結構域MLKL被RIP3磷酸化可引發(fā)壞死性的膜破裂HuayiWang,1LimingSun,1LijingSu,2JosepRizo,2LeiLiu,1Li-FengWang,3Fu-ShengWang,3andXiaodongWang1

王華翌、孫麗明、LijingSu、JosepRizo、劉磊、王立峰、王福生（北京302醫(yī)院）、王曉東（MolecularCell，2014）匯報人：付瑋瑋一、前言 程序性細胞死亡在多細胞個體的成長發(fā)育過程中扮有重要作用，主要分為兩種途徑——凋亡和壞死，它們有著不同的形態(tài)學和生物化學變化。 凋亡主要表現(xiàn)為細胞體積縮小、核膜破裂、DNA降解為約180-200bp的整數(shù)倍、并最終形成胞膜包被的凋亡小體，很快被巨噬細胞和鄰近細胞所吞噬。這些凋亡過程中形態(tài)學和生物化學的變化主要由一類半胱氨酸蛋白酶caspases執(zhí)行。這些蛋白酶通過外在的死亡誘導信號激活，如腫瘤壞死因子受體或Bcl-2家族蛋白，它們可使原來位于線粒體膜間隙的蛋白質釋放到胞漿，其中一種釋放細胞色素C，與胞漿中的Apaf-1結合后激活caspases。 腫瘤壞死因子（TNF）還可誘導細胞壞死，表現(xiàn)為細胞腫脹、胞內細胞器變形或腫大、細胞ATP含量減少、細胞膜破裂。這種形式的壞死,又稱為necroptosis，需要受體互作的蛋白激酶RIP1、RIP3的激活。研究采用RIP3敲除的小鼠證實這種形式的細胞死亡對于應答微生物感染和炎癥介導的組織損傷具有重要意義。 RIP3如何引發(fā)細胞壞死以及該途徑是否自然運行在人類組織中是我們理解細胞壞死面臨的兩大難題。RIP1,RIP3以及MLKL相互結合形成一個信號復合體，被稱作“necrosome”。且MLKL激酶結構域的357位的蘇氨酸和358位的絲氨酸（人源）在細胞程序性壞死被啟動后被RIP3磷酸化。MLKL是擁有激酶結構域（與RIP3結合）但無激酶功能的假激酶。MLKL敲除的小鼠被證實與RIP3敲除的小鼠對細胞壞死具有相似的抵抗能力。但MLKL磷酸化導致細胞壞死的機制目前尚不清楚。二、文章的總體模式圖

RIP1,RIP3以及MLKL相互結合形成一個細胞壞死復合體“necrosome”；MLKL激酶結構域的T357/S358位被RIP3磷酸化；磷酸化的MLKL從單體狀態(tài)向寡聚體狀態(tài)轉化；寡聚化的MLKL結合磷酸肌醇和心肌磷脂,整個復合體從細胞質轉移到細胞膜和細胞器膜上，并在這些膜結構上形成通透性孔道，破壞膜的完整性，引起細胞壞死。三、文章的亮點RIP3激酶對MLKLT357/S358位的磷酸化驅使MLKL形成寡聚物；MLKL寡聚物從胞漿易位到

細胞器膜和質膜上；MLKL寡聚物在細胞壞死過程中直接破壞細胞膜的完整性；MLKL磷酸化發(fā)生在藥物引起的肝損傷病人活檢組織中。1.MLKL磷酸化是細胞壞死的標志；2.磷酸化的MLKL在細胞壞死過程中易位到膜部分；3.Necrosomes復合體在細胞壞死過程中轉移到質膜和細胞器膜上；4.MLKL在細胞壞死過程中形成寡聚體；5.MLKL結合磷脂和脂質體；6.MLKL通過在膜上形成通透性孔道引起膜泄漏和細胞壞死；7.藥物引起的肝損傷病人活檢組織中檢測到MLKL磷酸化信號。四、文章結構框架流程圖(主要通過7幅圖展開)圖1、MLKL磷酸化是細胞壞死的標志

圖B進一步驗證了MLKL磷酸化與細胞死亡相關；從圖可以看出HT-29細胞在TSZ共同處理下不同時間的p-MLKL、ATP水平和膜泄漏情況（通過測定胞質蛋白酶的活性得到，CytoTox-Glokit）；6小時后三個信號同時出現(xiàn)變化。補充圖中又對另一種人類細胞系（白血病細胞株U937）進行了類似的研究，發(fā)現(xiàn)MLKL磷酸化信號和細胞壞死的相關性同樣出現(xiàn)在U937細胞系中。圖2A：采用TrionX-114分離內在膜蛋白的示意圖；圖2B：HT-29在TSZ處理的不同時間點細胞提取物的westernblotting情況；細胞壞死誘導6小時后，磷酸化的MLKL在水相出現(xiàn)，且非磷酸化的MLKL逐漸減少；同時，磷酸化的MLKL此時出現(xiàn)在膜相；暗示MLKL在被RIP3磷酸化后從溶膠轉移到膜部分。圖2C：NSA（MLKL抑制劑）先前驗證出不能阻止MLKL發(fā)生磷酸化，但可以阻止細胞壞死，現(xiàn)在驗證NSA可以阻止p-MLKL轉移到膜上；分別對比2、6和4、8，在沒加壞死抑制劑時，p-MLKL主要集中在膜上，加抑制劑后，則主要在水相，暗示NSA雖然不影響MLKL的磷酸化，但p-MLKL不轉移到膜上；圖2D：MLKL磷酸化位點突變后在細胞壞死過程中不會轉移到膜上。圖3、Necrosomes復合體在細胞壞死過程中轉移到質膜和細胞器膜上

圖3A：差速離心分離細胞器的基本步驟；圖3B：細胞器特異性標記（質膜和核內體：EGFR；線粒體：Tom20；溶酶體和核內體:

Lamp1；內質網(wǎng)：ERp72）；左圖顯示僅用TNF處理，不出現(xiàn)p-MLKL，且MLKL、RIP3、RIP1主要存在于S100，即上清液水相中；RIP1在水相和膜上都比較多，暗示其可結合TNF受體。右圖顯示在TSZ處理后，p-MLKL出現(xiàn)在各種細胞器膜上。圖3C：前三行紅色點和綠色點的重疊百分比為14%-23%；細胞膜的p-MLKL信號為22%。線粒體內質網(wǎng)的正常駐留蛋白溶酶體和核內體微分干涉圖像質膜圖4、MLKL在細胞壞死過程中形成寡聚體

圖4A：P-MLKL在非還原凝膠中有寡聚體存在，在還原凝膠則沒有；寡聚體靠二硫鍵連接；圖4B：采用凝膠過濾（Superdex200）分析純化的重組蛋白MLKL；洗脫位置表明了分子大?。ㄒ姌顺撸谞钕偾虻鞍?670kDa;鐵蛋白,440kDa;BSA,67kDa;卵清蛋白,44kDa;核糖核酸酶A,14kDa）；非還原凝膠還原凝膠圖5、MLKL結合磷脂和脂質體

圖5A：（TAG：甘油三酯；DAG：甘油二酯；PA：磷脂酸；PS：磷酯酰絲氨酸；PE：磷脂酰乙醇胺；PC：卵磷脂；PG：磷脂酰甘油；Cardiolipin:心磷脂；PI：磷脂酰肌醇；Cholesterol：膽固醇）；15種膜脂的布局圖；圖5B：MLKL-FL(full-length，1–471aa);MLKL-CC(coiled-coildomain,1–178aa);MLKL-KL(kinase-likedomain，179–471aa)；使用Anti-N-terminalorC-terminalMLKLantibodies檢測MLKLsignal。4種磷脂--心磷脂、PI4P、PI(4,5)P2、PI(3,4,5)P3結合最多；KL結構域不結合任何脂質。圖6、MLKL通過在膜上形成通透性孔道引起膜泄漏和細胞壞死圖6A-C：先讓Tb3+離子和脂質體結合，然后和帶有DPA的MLKL蛋白孵育，Tb3+有弱熒光活性，當從脂質體中釋放與DPA結合時，Tb3+/DPA螯合物使熒光活性增加104倍，從而給出脂質體破裂的信號；圖6A為三種形式的MLKL蛋白膜破裂情況；圖6B為脂質體中包含不同脂類時膜破裂的情況；圖6C為添加NSA后可以抑制膜的破裂；圖6D：MLKL全長或N端卷曲結構域可以使膜破裂；而C端激酶結構域不起作用；圖6E：采用人類骨肉瘤細胞系U2OS，其中MLKL-FKBPV融合蛋白受doxycycline（多西環(huán)素）誘導的啟動子控制，U2OS不表達RIP3，因此正常情況下不經(jīng)歷細胞壞死；僅當Dox存在時可表達融合蛋白，但有30%的細胞死亡，添加AP20187后，細胞死亡率增加到60%；添加z-VAD和Nec-1時沒有顯著變化，但添加NSA時細胞死亡率下降，暗示細胞死亡是由MLKL介導的。圖7、藥物引起的肝損傷病人活檢組織中檢測到MLKL磷酸化信號圖7A：藥物引起的肝損傷病人活檢組織染色（圖中顯示病變部位三個臨近的區(qū)域）；a為蘇木精將細胞核染成藍紫色，phospho-MLKL抗體將病變部位復染為紅色；b為沒有采用第一抗體染色的陰性對照；c為蘇木精和phospho-MLKL抗體復染的肝損傷嚴重的部位；圖7B：兩個健康器官移植捐贈者的肝活檢組織樣本的免疫組