Ch12-tan-基因診斷與基因治療課件

第十六章基因診斷與基因治療Genediagnosisandgenetherapy第十六章基因診斷與基因治療1基因診斷的概念：以DNA和RNA為診斷材料，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)方法，直接檢查基因的結(jié)構(gòu)、或表達(dá)是否異常，對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法。基因診斷的概念：2用途——診斷下列兩種類型疾?。?、內(nèi)源基因的變異2、外來生物的入侵基因結(jié)構(gòu)的異常基因致病基因表達(dá)的異常用途——診斷下列兩種類型疾?。?、內(nèi)源基因的變異3第一節(jié)基因診斷一、基因診斷的特點(diǎn)：1.特異性高，針對(duì)性強(qiáng)：使用基因探針通過分子雜交進(jìn)行高特異性分析以基因作為檢測(cè)對(duì)象，屬于病因診斷或發(fā)病原因分析。2.靈敏度高:

用放射性同位素、酶或化學(xué)發(fā)光試劑標(biāo)記探針，有很高的檢測(cè)靈敏度，PCR擴(kuò)增也有很高的靈敏度。3.早期診斷：無臨床表現(xiàn)4.取樣方便：不受組織時(shí)相限制5.安全高效：不必培養(yǎng)高危病菌病毒，還可分亞型6.適應(yīng)范圍廣：可檢測(cè)內(nèi)源性基因和外來基因。第一節(jié)基因診斷一、基因診斷的特點(diǎn)：4二、基因診斷的內(nèi)容和技術(shù)直接診斷___致病基因明確間接診斷___致病基因不明確，基因連鎖分析分子基礎(chǔ)——基因結(jié)構(gòu)異?；虮磉_(dá)異常二、基因診斷的內(nèi)容和技術(shù)直接診斷___致病基因明確5（1）DNA序列測(cè)定（2）核酸分子印跡雜交（3）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)PCR-SSCP限切酶酶譜分析PCR-RFLP隨機(jī)引物分析PCR-RAPD（4）DNA芯片技術(shù)基因診斷的常用技術(shù)類型（1）DNA序列測(cè)定基因診斷的常用技術(shù)類型61、點(diǎn)突變的診斷PCR結(jié)合點(diǎn)雜交DNA芯片技術(shù)限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析法RFLP針對(duì)不同突變類型的基因診斷技術(shù)1、點(diǎn)突變的診斷針對(duì)不同突變類型的基因診斷技術(shù)7

正?；颍涸O(shè)計(jì)寡核苷酸探針MGGTACGATGCGGTTAACGCGCCATGCTACGCCAATTGCGC突變基因：設(shè)計(jì)寡核苷酸探針N

GGTACGATGTGGTTAACGCGCCATGCTACACCAATTGCGC

8MNMNMNMNMNMNMNMN9雜交的結(jié)果：（Ⅰ）受檢者DNA與N雜交，與M不雜交：突變基因純合子（Ⅱ）與M、N都能雜交：突變基因雜合子（Ⅲ）與M雜交，與N不雜交：沒有這種突變基因（Ⅳ）M、N均不雜交：可能是新突變雜交的結(jié)果：（Ⅰ）受檢者DNA與N雜交，與M不雜交：突變10（2）診斷未知的點(diǎn)突變常用檢測(cè)方法：①PCR-SSCP②DNA芯片③測(cè)序（2）診斷未知的點(diǎn)突變11①PCR-SSCP檢測(cè)法單鏈構(gòu)象多態(tài)性SinglestrandconformationpolymorphismSSCP①PCR-SSCP檢測(cè)法12基本原理

單鏈DNA在中性溶液中可形成一定的空間構(gòu)象，構(gòu)象與其堿基順序相關(guān)。因此當(dāng)單鏈DNA中堿基變異時(shí)，如堿基替換，它的空間構(gòu)象也發(fā)生一定變化。這種現(xiàn)象稱為單鏈構(gòu)象多態(tài)性?；驹?3單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，其遷移率不僅與鏈長(zhǎng)有關(guān)，還與單鏈DNA的空間構(gòu)象有關(guān)，因此堿基變異引起的構(gòu)象變化也可改變單鏈DNA的電泳遷移率。單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，其14ssDNAdsDNA高溫變性，快速冰浴野生型DNA突變型DNASSCP原理示意圖慢快點(diǎn)樣孔ssDNAdsDNA高溫變性，快速冰浴野生型DNA突變型DN152、少數(shù)核苷酸缺失或插入突變的診斷方法同點(diǎn)突變的診斷2、少數(shù)核苷酸缺失或插入突變的診斷方法同點(diǎn)突變的診斷163、大片斷缺失或插入突變的診斷常采用PCR法致病基因引物1引物2引物3引物43、大片斷缺失或插入突變的診斷致病基因引物1引物2引物3174、基因重排（染色體易位）的診斷常采用PCR法引物1引物2引物34、基因重排（染色體易位）的診斷引物1引物2引物3185、基因擴(kuò)增的診斷常采用Southern印跡雜交定量法5、基因擴(kuò)增的診斷19關(guān)于多態(tài)性分析基因組的核酸分子堿基排列順序在同種生物的不同個(gè)體之間或等位基因之間存在差異的現(xiàn)象稱為基因多態(tài)性。DNA多態(tài)性可分為位點(diǎn)多態(tài)性和重復(fù)序列多態(tài)性兩種。關(guān)于多態(tài)性分析基因組的核酸分子堿基201、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）分析1、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restrictionfragm21DNA分子中某些堿基的變異（即位點(diǎn)多態(tài)性）可使某種限制性核酸內(nèi)切酶的切點(diǎn)消失或出現(xiàn)新的切點(diǎn)，因此用同一種限制性核酸內(nèi)切酶消化不同個(gè)體的DNA分子時(shí)，會(huì)產(chǎn)生各不相同的限制性片段類型。這種現(xiàn)象稱為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。DNA分子中某些堿基的變異（即位點(diǎn)多態(tài)性）可22限制酶酶切位點(diǎn)的改變?cè)斐傻腞FLP可分為兩種情況：

①限制酶識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生單個(gè)堿基置換，導(dǎo)致酶切位點(diǎn)消失或獲得，此稱為點(diǎn)多態(tài)性。這種多態(tài)性只有兩個(gè)等位片斷，即多態(tài)位點(diǎn)的有或無。限制酶酶切位點(diǎn)的改變?cè)斐傻腞FLP可分為兩種23

②限制酶識(shí)別位點(diǎn)之間的DNA序列缺失、插入或重組，限制酶識(shí)別序列不發(fā)生變化，但它在基因組中的位置發(fā)生了變化。這種多態(tài)性可以有兩個(gè)或兩個(gè)以上的等位片斷。②限制酶識(shí)別位點(diǎn)之間的DNA序列缺失、插入或重組，限24RFLP分析法限制酶酶切圖譜直接分析法RFLP間接分析法RFLP分析法25（1）限制酶酶切圖譜直接分析法①限制酶酶切—Southern印跡雜交。②PCR—限制酶酶切（1）限制酶酶切圖譜直接分析法26應(yīng)用RFLP診斷鐮刀狀紅細(xì)胞性貧血正常人珠蛋白基因GAGHbS的珠蛋白mRNAGlu正常人珠蛋白肽鏈GUGHbS的珠蛋白肽鏈ValHbS的珠蛋白基因6CAC正常人珠蛋白mRNA6CTC應(yīng)用RFLP診斷鐮刀狀紅細(xì)胞性貧血正常人珠蛋白基因G27MstⅡ酶切位點(diǎn)CCTNAGGCCTNTGGMstⅡ酶AT替換MstⅡ酶切位點(diǎn)CCTNAGGCCTNTGGMstⅡ酶AT替28HbA---------CCTGAGGAG-------HbS---------CCTGTGGAG-------MstⅡMstⅡMstⅡ1.1kb0.2kb1.3kbHbA---------CCTGAGGAG-------291.1kb1.3kb0.2kbSSASFAARFLP法檢測(cè)HbSSS:HbS純合子AS:HbS雜合子AA:正常F:被檢胎兒(放射性自顯影圖譜)1.1kb1.3kb0.2kbSSASFAARFLP法檢測(cè)H30（2）RFLP間接分析法——RFLP連鎖分析法甲型血友病疾病種類：X染色體連鎖性遺傳病缺陷基因：凝血因子Ⅷ基因主要臨床表現(xiàn)：出血性疾?。?）RFLP間接分析法——31應(yīng)用PCR-RFLP連鎖分析法診斷甲型血友病用一對(duì)引物擴(kuò)增凝血因子Ⅷ基因第18外顯子內(nèi)的一個(gè)142bp片斷，該片斷含一個(gè)BclⅠ多態(tài)性位點(diǎn)。酶解后，如果存在BclⅠ酶切位點(diǎn)，則產(chǎn)生99bp和43bp兩個(gè)片斷；如果不存在則只有142bp一個(gè)片斷。研究證明，142bp片斷與甲型血友病基因連鎖。應(yīng)用PCR-RFLP連鎖分析法診斷甲型血友病32142bp99bp正常男性女性攜帶者先證者胎兒絨毛樣品142bp99bp正常男性女性攜帶者先證者胎兒絨毛樣品332、DNA重復(fù)序列多態(tài)性分析2、DNA重復(fù)序列多態(tài)性分析34（三）基因表達(dá)異常的診斷1、mRNA的定量分析（1）相對(duì)定量斑點(diǎn)雜交RT-PCR（2）絕對(duì)定量2、mRNA長(zhǎng)度分析Northern印跡雜交RT-PCR（三）基因表達(dá)異常的診斷2、mRNA長(zhǎng)度分析35三、遺傳病的基因診斷

1、直接診斷策略2、間接診斷策略三、遺傳病的基因診斷1、直接診斷策略36（一）血紅蛋白病1.異常血紅蛋白病1、DNA檢測(cè)與分析（1）PCR-限制酶譜分析法（2）Southern印跡雜交分析法2、RNA檢測(cè)與分析RT-PCR（一）血紅蛋白病37鐮狀細(xì)胞貧血?。╯icklecellaneamia）MstII酶切位點(diǎn)CCTNAGGGGANTCC點(diǎn)突變TACCANAGGGGTNTCC

酶切凝膠電泳Southernblock珠蛋白基因探針雜交

鐮狀細(xì)胞貧血病（sicklecellaneamia）M382.

地貧(1)-地貧1）DNA檢測(cè)與分析（a）RFLP（b）PCR2）RNA檢測(cè)與分析RT-PCR2.地貧39（2）-地貧的基因診斷1)DNA檢測(cè)與分析（1）PCR-探針法（2）PCR-RFLP連鎖分析法（3）DNA芯片技術(shù)2)RNA檢測(cè)與分析RT-PCR（2）-地貧的基因診斷40C地中海貧血珠蛋白基因3’端缺失0.6kb

BglIIBglIIACC地中海貧血珠蛋白基因3’端缺失0.6kb

Bg41（二）血友病AfactorVIII基因缺陷（堿基取代、缺失或插入等）基因產(chǎn)物凝血因子VIII無活性或不穩(wěn)定，導(dǎo)致凝血障礙。PCR擴(kuò)增因子VIII基因的18號(hào)外顯子142bp片段BclI限制酶酶切位點(diǎn)在基因內(nèi)18號(hào)外顯子3′端電泳染色,分析片段的家系分布,作出產(chǎn)前診斷142bp99bp父母兒胎兒

(先證者)(女)（二）血友病AfactorVIII基因缺陷（堿基取代、缺42四、腫瘤的基因診斷一)腫瘤基因診斷的策略1、檢測(cè)腫瘤標(biāo)記基因或mRNA2、檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因3、檢測(cè)腫瘤相關(guān)病毒基因四、腫瘤的基因診斷一)腫瘤基因診斷的策略43（二）腫瘤相關(guān)基因的檢測(cè)

ras癌基因的檢測(cè)1、常見突變類型：點(diǎn)突變（突變熱點(diǎn)在12、13、61位密碼子的編碼區(qū)）2、常用檢測(cè)方法（1）PCR-ASO（2）PCR-SSCP（二）腫瘤相關(guān)基因的檢測(cè)44抑癌基因p53的檢測(cè)1、常見突變類型：點(diǎn)突變突變熱點(diǎn)在5~8號(hào)外顯子，有少量插入或缺失2、常檢測(cè)方法（1）PCR-SSCP（2）PCR結(jié)合序列分析（3）PCR-RFLP抑癌基因p53的檢測(cè)45五、感染性疾病的基因診斷目前應(yīng)用最多是PCR法，不僅可檢測(cè)病原體的DNA（如乙肝病毒、巨細(xì)胞病毒、乳頭瘤病毒、結(jié)核桿菌等），而且可檢測(cè)RNA病原體（RT-PCR檢測(cè)艾滋病病毒、丙肝病毒等）。五、感染性疾病的基因診斷目前應(yīng)用最多是PCR法，不僅可檢測(cè)病46應(yīng)用范圍1.可快速準(zhǔn)確查出致病病原體;2.適于早期診斷、帶菌帶毒者和潛在感染的發(fā)現(xiàn)；3.大規(guī)模病原流行病學(xué)的現(xiàn)場(chǎng)篩查4.病原體抗藥性的快速敏感試驗(yàn);5.對(duì)微生物的科屬種進(jìn)行準(zhǔn)確分類鑒定;。應(yīng)用范圍47六基因診斷在法

醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用PCR結(jié)合DNA指紋技術(shù)六基因診斷在法

醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用PCR結(jié)合DNA指紋技術(shù)48Southernblot應(yīng)用DNA指紋分析血跡中的DNASouthernblot應(yīng)用血跡中的DNA49第二節(jié)基因治療

Genetherapy基因治療的概念基因治療是指把目的基因?qū)肴梭w，通過在特定靶細(xì)胞中表達(dá)該細(xì)胞本來不表達(dá)或低表達(dá)、或已異常突變而不表達(dá)的基因，或采用特定方式關(guān)閉、抑制異常表達(dá)基因，達(dá)到治療疾病目的的治療方法。第二節(jié)基因治療

Genetherapy基因治療的概念50Ch12-tan-基因診斷與基因治療課件51Ch12-tan-基因診斷與基因治療課件52一、基因治療的必要條件（1）用傳統(tǒng)治療無效或效果不佳；（2）發(fā)病的分子機(jī)制已闡明，且目的基因已經(jīng)克隆且對(duì)其產(chǎn)物有詳盡的了解，；（3）目的基因能在體外操作，能有效的導(dǎo)入靶細(xì)胞；能在靶細(xì)胞中一段時(shí)間或長(zhǎng)期穩(wěn)定駐留；（4）導(dǎo)入基因能有適度表達(dá)；（5）基因?qū)敕椒ê退幂d體對(duì)靶細(xì)胞安全無害；（6）目的基因的表達(dá)不需嚴(yán)格控制，或能夠人為控制；（7）人類的基因治療需經(jīng)過嚴(yán)格審批一、基因治療的必要條件（1）用傳統(tǒng)治療無效或效果不佳；53二、基因治療的主要策略二、基因治療的主要策略54（一）基因修復(fù)或基因矯正

矯正突變堿基，精確的原位修復(fù)最理想，難以實(shí)現(xiàn)（一）基因修復(fù)或基因矯正

矯正突變堿基，精確的原位修復(fù)55(二)基因置換指將特定的目的基因?qū)胩囟ǖ募?xì)胞，通過定位重組，以導(dǎo)入基因置換基因組內(nèi)的原有缺陷基因基因打靶技術(shù)（同源重組）(二)基因置換56（三）基因增補(bǔ)1、概念通過導(dǎo)入外源基因是靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因。2、基因添加的兩種類型（1）針對(duì)特定的缺陷基因?qū)肫湎鄳?yīng)正?；颍?）向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞中本來不表達(dá)的基因（三）基因增補(bǔ)1、概念57（四）基因干預(yù)采取特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或通過破壞某個(gè)基因使之不表達(dá)1.反義核酸技術(shù)2.核酶3.RNA干擾技術(shù)（RNAi)（四）基因干預(yù)采取特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或通過破壞某58Ch12-tan-基因診斷與基因治療課件59三、基因治療的基本程序（一）目的基因的選擇和制備三、基因治療的基本程序（一）目的基因的選擇和制備60（二）靶細(xì)胞的選擇（二）靶細(xì)胞的選擇61（三）基因的導(dǎo)入

（基因轉(zhuǎn)移技術(shù)）基因治療的方式：體內(nèi)法：體內(nèi)直接轉(zhuǎn)移基因法

回體法：靶細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療（三）基因的導(dǎo)入

（基因轉(zhuǎn)移技術(shù)）基因治療的方式：62基因?qū)氲姆绞讲《据d體法非病毒載體法基因?qū)氲姆绞讲《据d體法63Ch12-tan-基因診斷與基因治療課件64Ch12-tan-基因診斷與基因治療課件65Ch12-tan-基因診斷與基因治療課件66逆轉(zhuǎn)錄病毒載體1、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)構(gòu)ψLTRLTRgagpolenvψLTRLTRgagpolenv67在包裝細(xì)胞中包裝成假病毒LTRLTRneuψAmproriE在包裝細(xì)胞中包裝成假病毒LTRLTRneuψAmprori682、包裝細(xì)胞3、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn)（1）結(jié)構(gòu)和感染過程與普通逆轉(zhuǎn)錄病毒相似；（2）可使靶細(xì)胞變成穩(wěn)定表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；（3）感染靶細(xì)胞后不擴(kuò)散；（4）假病毒感染靶細(xì)胞的效率非常高；（5）不感染非增殖細(xì)胞。2、包裝細(xì)胞694、安全性問題（1）感染的可能性（2）污染的可能性（3）在靶細(xì)胞基因組中的整合4、安全性問題70（二）腺病毒載體1、結(jié)構(gòu)E1AE1BE2BE2AE4E3L1~L5（二）腺病毒載體E1AE1BE2BE2AE4E3L1~L571Ch12-tan-基因診斷與基因治療課件722、特點(diǎn)（1）宿主范圍廣（2）腺病毒蛋白表達(dá)不以宿主增殖為必要條件（3）可獲得高病毒效價(jià)（4）重組體非常穩(wěn)定（5）不會(huì)引起腫瘤（6）有較高的安全性（7）無包膜，不易被補(bǔ)體滅活，可直接在體內(nèi)應(yīng)用（8）不整合入染色體2、特點(diǎn)73（三）腺相關(guān)病毒載體1、結(jié)構(gòu)ITRITRREPCAPψ（三）腺相關(guān)病毒載體ITRITRREPCAPψ742、特點(diǎn)（1）能夠進(jìn)行位點(diǎn)特異性整合（2）無致病性（3）載體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單（4）穩(wěn)定（5）不引起腫瘤形成2、特點(diǎn)75（四）單純皰疹病毒載體1、結(jié)構(gòu)abU1b`a`c`Usca2、特點(diǎn)（1）滴度高（2）容量大（3）增殖細(xì)胞和非增殖細(xì)胞均可感染（4）不整合，但可長(zhǎng)期存在并可穩(wěn)定表達(dá)（四）單純皰疹病毒載體abU176基因轉(zhuǎn)移的非生物學(xué)方法（一）脂質(zhì)體（二）直接注射法（三）受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)（四）其他方法基因轉(zhuǎn)移的非生物學(xué)方法77（四）轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的篩選和導(dǎo)入基因的鑒定1、選擇靶細(xì)胞應(yīng)考慮因素（1）組織特異性細(xì)胞；（2）易獲得、壽命長(zhǎng)（3）離體細(xì)胞易受外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化；（4）易成活。（四）轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的篩選和導(dǎo)入基因的鑒定782、常用靶細(xì)胞（1）造血細(xì)胞（2）皮膚成纖維細(xì)胞（3）肝細(xì)胞（4）血管內(nèi)皮細(xì)胞（5）淋巴細(xì)胞（6）肌肉細(xì)胞（7）腫瘤細(xì)胞（8）其他細(xì)胞2、常用靶細(xì)胞（1）造血細(xì)胞79四、基因治療的應(yīng)用研究四、基因治療的應(yīng)用研究80（一）單基因遺傳病的基因治療腺苷脫氨酶缺乏癥缺陷基因：腺苷脫氨酶基因主要臨床表現(xiàn)：免疫缺陷基因治療方法：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝細(xì)胞骨髓造血干細(xì)胞回輸體內(nèi)（一）單基因遺傳病的基因治療81Ch12-tan-基因診斷與基因治療課件82血友病血友病83（二）腫瘤的基因治療研究策略（一）修正腫瘤相關(guān)基因的功能1、恢復(fù)抑癌基因的功能2、糾正癌基因的表達(dá)（二）導(dǎo)入特定的基因產(chǎn)生腫瘤特異的藥物敏感性（三）腫瘤的免疫基因治療（二）腫瘤的基因治療研究84復(fù)習(xí)題一、名詞基因診斷、基因治療、-地中海貧血、-地中海貧血、基因轉(zhuǎn)染、基因打靶。復(fù)習(xí)題85二、問題1、基因診斷的優(yōu)點(diǎn)和應(yīng)用如何？2、基因治療的概念、策略和基本步驟是什么？二、問題86第十六章基因診斷與基因治療Genediagnosisandgenetherapy第十六章基因診斷與基因治療87基因診斷的概念：以DNA和RNA為診斷材料，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)方法，直接檢查基因的結(jié)構(gòu)、或表達(dá)是否異常，對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法。基因診斷的概念：88用途——診斷下列兩種類型疾?。?、內(nèi)源基因的變異2、外來生物的入侵基因結(jié)構(gòu)的異常基因致病基因表達(dá)的異常用途——診斷下列兩種類型疾病：1、內(nèi)源基因的變異89第一節(jié)基因診斷一、基因診斷的特點(diǎn)：1.特異性高，針對(duì)性強(qiáng)：使用基因探針通過分子雜交進(jìn)行高特異性分析以基因作為檢測(cè)對(duì)象，屬于病因診斷或發(fā)病原因分析。2.靈敏度高:

用放射性同位素、酶或化學(xué)發(fā)光試劑標(biāo)記探針，有很高的檢測(cè)靈敏度，PCR擴(kuò)增也有很高的靈敏度。3.早期診斷：無臨床表現(xiàn)4.取樣方便：不受組織時(shí)相限制5.安全高效：不必培養(yǎng)高危病菌病毒，還可分亞型6.適應(yīng)范圍廣：可檢測(cè)內(nèi)源性基因和外來基因。第一節(jié)基因診斷一、基因診斷的特點(diǎn)：90二、基因診斷的內(nèi)容和技術(shù)直接診斷___致病基因明確間接診斷___致病基因不明確，基因連鎖分析分子基礎(chǔ)——基因結(jié)構(gòu)異?；虮磉_(dá)異常二、基因診斷的內(nèi)容和技術(shù)直接診斷___致病基因明確91（1）DNA序列測(cè)定（2）核酸分子印跡雜交（3）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)PCR-SSCP限切酶酶譜分析PCR-RFLP隨機(jī)引物分析PCR-RAPD（4）DNA芯片技術(shù)基因診斷的常用技術(shù)類型（1）DNA序列測(cè)定基因診斷的常用技術(shù)類型921、點(diǎn)突變的診斷PCR結(jié)合點(diǎn)雜交DNA芯片技術(shù)限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析法RFLP針對(duì)不同突變類型的基因診斷技術(shù)1、點(diǎn)突變的診斷針對(duì)不同突變類型的基因診斷技術(shù)93

正常基因：設(shè)計(jì)寡核苷酸探針MGGTACGATGCGGTTAACGCGCCATGCTACGCCAATTGCGC突變基因：設(shè)計(jì)寡核苷酸探針N

GGTACGATGTGGTTAACGCGCCATGCTACACCAATTGCGC

94MNMNMNMNMNMNMNMN95雜交的結(jié)果：（Ⅰ）受檢者DNA與N雜交，與M不雜交：突變基因純合子（Ⅱ）與M、N都能雜交：突變基因雜合子（Ⅲ）與M雜交，與N不雜交：沒有這種突變基因（Ⅳ）M、N均不雜交：可能是新突變雜交的結(jié)果：（Ⅰ）受檢者DNA與N雜交，與M不雜交：突變96（2）診斷未知的點(diǎn)突變常用檢測(cè)方法：①PCR-SSCP②DNA芯片③測(cè)序（2）診斷未知的點(diǎn)突變97①PCR-SSCP檢測(cè)法單鏈構(gòu)象多態(tài)性SinglestrandconformationpolymorphismSSCP①PCR-SSCP檢測(cè)法98基本原理

單鏈DNA在中性溶液中可形成一定的空間構(gòu)象，構(gòu)象與其堿基順序相關(guān)。因此當(dāng)單鏈DNA中堿基變異時(shí)，如堿基替換，它的空間構(gòu)象也發(fā)生一定變化。這種現(xiàn)象稱為單鏈構(gòu)象多態(tài)性?；驹?9單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，其遷移率不僅與鏈長(zhǎng)有關(guān)，還與單鏈DNA的空間構(gòu)象有關(guān)，因此堿基變異引起的構(gòu)象變化也可改變單鏈DNA的電泳遷移率。單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，其100ssDNAdsDNA高溫變性，快速冰浴野生型DNA突變型DNASSCP原理示意圖慢快點(diǎn)樣孔ssDNAdsDNA高溫變性，快速冰浴野生型DNA突變型DN1012、少數(shù)核苷酸缺失或插入突變的診斷方法同點(diǎn)突變的診斷2、少數(shù)核苷酸缺失或插入突變的診斷方法同點(diǎn)突變的診斷1023、大片斷缺失或插入突變的診斷常采用PCR法致病基因引物1引物2引物3引物43、大片斷缺失或插入突變的診斷致病基因引物1引物2引物31034、基因重排（染色體易位）的診斷常采用PCR法引物1引物2引物34、基因重排（染色體易位）的診斷引物1引物2引物31045、基因擴(kuò)增的診斷常采用Southern印跡雜交定量法5、基因擴(kuò)增的診斷105關(guān)于多態(tài)性分析基因組的核酸分子堿基排列順序在同種生物的不同個(gè)體之間或等位基因之間存在差異的現(xiàn)象稱為基因多態(tài)性。DNA多態(tài)性可分為位點(diǎn)多態(tài)性和重復(fù)序列多態(tài)性兩種。關(guān)于多態(tài)性分析基因組的核酸分子堿基1061、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）分析1、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restrictionfragm107DNA分子中某些堿基的變異（即位點(diǎn)多態(tài)性）可使某種限制性核酸內(nèi)切酶的切點(diǎn)消失或出現(xiàn)新的切點(diǎn)，因此用同一種限制性核酸內(nèi)切酶消化不同個(gè)體的DNA分子時(shí)，會(huì)產(chǎn)生各不相同的限制性片段類型。這種現(xiàn)象稱為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。DNA分子中某些堿基的變異（即位點(diǎn)多態(tài)性）可108限制酶酶切位點(diǎn)的改變?cè)斐傻腞FLP可分為兩種情況：

①限制酶識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生單個(gè)堿基置換，導(dǎo)致酶切位點(diǎn)消失或獲得，此稱為點(diǎn)多態(tài)性。這種多態(tài)性只有兩個(gè)等位片斷，即多態(tài)位點(diǎn)的有或無。限制酶酶切位點(diǎn)的改變?cè)斐傻腞FLP可分為兩種109

②限制酶識(shí)別位點(diǎn)之間的DNA序列缺失、插入或重組，限制酶識(shí)別序列不發(fā)生變化，但它在基因組中的位置發(fā)生了變化。這種多態(tài)性可以有兩個(gè)或兩個(gè)以上的等位片斷。②限制酶識(shí)別位點(diǎn)之間的DNA序列缺失、插入或重組，限110RFLP分析法限制酶酶切圖譜直接分析法RFLP間接分析法RFLP分析法111（1）限制酶酶切圖譜直接分析法①限制酶酶切—Southern印跡雜交。②PCR—限制酶酶切（1）限制酶酶切圖譜直接分析法112應(yīng)用RFLP診斷鐮刀狀紅細(xì)胞性貧血正常人珠蛋白基因GAGHbS的珠蛋白mRNAGlu正常人珠蛋白肽鏈GUGHbS的珠蛋白肽鏈ValHbS的珠蛋白基因6CAC正常人珠蛋白mRNA6CTC應(yīng)用RFLP診斷鐮刀狀紅細(xì)胞性貧血正常人珠蛋白基因G113MstⅡ酶切位點(diǎn)CCTNAGGCCTNTGGMstⅡ酶AT替換MstⅡ酶切位點(diǎn)CCTNAGGCCTNTGGMstⅡ酶AT替114HbA---------CCTGAGGAG-------HbS---------CCTGTGGAG-------MstⅡMstⅡMstⅡ1.1kb0.2kb1.3kbHbA---------CCTGAGGAG-------1151.1kb1.3kb0.2kbSSASFAARFLP法檢測(cè)HbSSS:HbS純合子AS:HbS雜合子AA:正常F:被檢胎兒(放射性自顯影圖譜)1.1kb1.3kb0.2kbSSASFAARFLP法檢測(cè)H116（2）RFLP間接分析法——RFLP連鎖分析法甲型血友病疾病種類：X染色體連鎖性遺傳病缺陷基因：凝血因子Ⅷ基因主要臨床表現(xiàn)：出血性疾病（2）RFLP間接分析法——117應(yīng)用PCR-RFLP連鎖分析法診斷甲型血友病用一對(duì)引物擴(kuò)增凝血因子Ⅷ基因第18外顯子內(nèi)的一個(gè)142bp片斷，該片斷含一個(gè)BclⅠ多態(tài)性位點(diǎn)。酶解后，如果存在BclⅠ酶切位點(diǎn)，則產(chǎn)生99bp和43bp兩個(gè)片斷；如果不存在則只有142bp一個(gè)片斷。研究證明，142bp片斷與甲型血友病基因連鎖。應(yīng)用PCR-RFLP連鎖分析法診斷甲型血友病118142bp99bp正常男性女性攜帶者先證者胎兒絨毛樣品142bp99bp正常男性女性攜帶者先證者胎兒絨毛樣品1192、DNA重復(fù)序列多態(tài)性分析2、DNA重復(fù)序列多態(tài)性分析120（三）基因表達(dá)異常的診斷1、mRNA的定量分析（1）相對(duì)定量斑點(diǎn)雜交RT-PCR（2）絕對(duì)定量2、mRNA長(zhǎng)度分析Northern印跡雜交RT-PCR（三）基因表達(dá)異常的診斷2、mRNA長(zhǎng)度分析121三、遺傳病的基因診斷

1、直接診斷策略2、間接診斷策略三、遺傳病的基因診斷1、直接診斷策略122（一）血紅蛋白病1.異常血紅蛋白病1、DNA檢測(cè)與分析（1）PCR-限制酶譜分析法（2）Southern印跡雜交分析法2、RNA檢測(cè)與分析RT-PCR（一）血紅蛋白病123鐮狀細(xì)胞貧血?。╯icklecellaneamia）MstII酶切位點(diǎn)CCTNAGGGGANTCC點(diǎn)突變TACCANAGGGGTNTCC

酶切凝膠電泳Southernblock珠蛋白基因探針雜交

鐮狀細(xì)胞貧血?。╯icklecellaneamia）M1242.

地貧(1)-地貧1）DNA檢測(cè)與分析（a）RFLP（b）PCR2）RNA檢測(cè)與分析RT-PCR2.地貧125（2）-地貧的基因診斷1)DNA檢測(cè)與分析（1）PCR-探針法（2）PCR-RFLP連鎖分析法（3）DNA芯片技術(shù)2)RNA檢測(cè)與分析RT-PCR（2）-地貧的基因診斷126C地中海貧血珠蛋白基因3’端缺失0.6kb

BglIIBglIIACC地中海貧血珠蛋白基因3’端缺失0.6kb

Bg127（二）血友病AfactorVIII基因缺陷（堿基取代、缺失或插入等）基因產(chǎn)物凝血因子VIII無活性或不穩(wěn)定，導(dǎo)致凝血障礙。PCR擴(kuò)增因子VIII基因的18號(hào)外顯子142bp片段BclI限制酶酶切位點(diǎn)在基因內(nèi)18號(hào)外顯子3′端電泳染色,分析片段的家系分布,作出產(chǎn)前診斷142bp99bp父母兒胎兒

(先證者)(女)（二）血友病AfactorVIII基因缺陷（堿基取代、缺128四、腫瘤的基因診斷一)腫瘤基因診斷的策略1、檢測(cè)腫瘤標(biāo)記基因或mRNA2、檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因3、檢測(cè)腫瘤相關(guān)病毒基因四、腫瘤的基因診斷一)腫瘤基因診斷的策略129（二）腫瘤相關(guān)基因的檢測(cè)

ras癌基因的檢測(cè)1、常見突變類型：點(diǎn)突變（突變熱點(diǎn)在12、13、61位密碼子的編碼區(qū)）2、常用檢測(cè)方法（1）PCR-ASO（2）PCR-SSCP（二）腫瘤相關(guān)基因的檢測(cè)130抑癌基因p53的檢測(cè)1、常見突變類型：點(diǎn)突變突變熱點(diǎn)在5~8號(hào)外顯子，有少量插入或缺失2、常檢測(cè)方法（1）PCR-SSCP（2）PCR結(jié)合序列分析（3）PCR-RFLP抑癌基因p53的檢測(cè)131五、感染性疾病的基因診斷目前應(yīng)用最多是PCR法，不僅可檢測(cè)病原體的DNA（如乙肝病毒、巨細(xì)胞病毒、乳頭瘤病毒、結(jié)核桿菌等），而且可檢測(cè)RNA病原體（RT-PCR檢測(cè)艾滋病病毒、丙肝病毒等）。五、感染性疾病的基因診斷目前應(yīng)用最多是PCR法，不僅可檢測(cè)病132應(yīng)用范圍1.可快速準(zhǔn)確查出致病病原體;2.適于早期診斷、帶菌帶毒者和潛在感染的發(fā)現(xiàn)；3.大規(guī)模病原流行病學(xué)的現(xiàn)場(chǎng)篩查4.病原體抗藥性的快速敏感試驗(yàn);5.對(duì)微生物的科屬種進(jìn)行準(zhǔn)確分類鑒定;。應(yīng)用范圍133六基因診斷在法

醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用PCR結(jié)合DNA指紋技術(shù)六基因診斷在法

醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用PCR結(jié)合DNA指紋技術(shù)134Southernblot應(yīng)用DNA指紋分析血跡中的DNASouthernblot應(yīng)用血跡中的DNA135第二節(jié)基因治療

Genetherapy基因治療的概念基因治療是指把目的基因?qū)肴梭w，通過在特定靶細(xì)胞中表達(dá)該細(xì)胞本來不表達(dá)或低表達(dá)、或已異常突變而不表達(dá)的基因，或采用特定方式關(guān)閉、抑制異常表達(dá)基因，達(dá)到治療疾病目的的治療方法。第二節(jié)基因治療

Genetherapy基因治療的概念136Ch12-tan-基因診斷與基因治療課件137Ch12-tan-基因診斷與基因治療課件138一、基因治療的必要條件（1）用傳統(tǒng)治療無效或效果不佳；（2）發(fā)病的分子機(jī)制已闡明，且目的基因已經(jīng)克隆且對(duì)其產(chǎn)物有詳盡的了解，；（3）目的基因能在體外操作，能有效的導(dǎo)入靶細(xì)胞；能在靶細(xì)胞中一段時(shí)間或長(zhǎng)期穩(wěn)定駐留；（4）導(dǎo)入基因能有適度表達(dá)；（5）基因?qū)敕椒ê退幂d體對(duì)靶細(xì)胞安全無害；（6）目的基因的表達(dá)不需嚴(yán)格控制，或能夠人為控制；（7）人類的基因治療需經(jīng)過嚴(yán)格審批一、基因治療的必要條件（1）用傳統(tǒng)治療無效或效果不佳；139二、基因治療的主要策略二、基因治療的主要策略140（一）基因修復(fù)或基因矯正

矯正突變堿基，精確的原位修復(fù)最理想，難以實(shí)現(xiàn)（一）基因修復(fù)或基因矯正

矯正突變堿基，精確的原位修復(fù)141(二)基因置換指將特定的目的基因?qū)胩囟ǖ募?xì)胞，通過定位重組，以導(dǎo)入基因置換基因組內(nèi)的原有缺陷基因基因打靶技術(shù)（同源重組）(二)基因置換142（三）基因增補(bǔ)1、概念通過導(dǎo)入外源基因是靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因。2、基因添加的兩種類型（1）針對(duì)特定的缺陷基因?qū)肫湎鄳?yīng)正?；颍?）向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞中本來不表達(dá)的基因（三）基因增補(bǔ)1、概念143（四）基因干預(yù)采取特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或通過破壞某個(gè)基因使之不表達(dá)1.反義核酸技術(shù)2.核酶3.RNA干擾技術(shù)（RNAi)（四）基因干預(yù)采取特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或通過破壞某144Ch12-tan-基因診斷與基因治療課件145三、基因治療的基本程序（一）目的基因的選擇和制備三、基因治療的基本程序（一）目的基因的選擇和制備146（二）靶細(xì)胞的選擇（二）靶細(xì)胞的選擇147（三）基因的導(dǎo)入

（基因轉(zhuǎn)移技術(shù)）基因治療的方式：體內(nèi)法：體內(nèi)直接轉(zhuǎn)移基因法

回體法：靶細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療（三）基因的導(dǎo)入

（