艾滋病與人類免疫缺損病毒的分子生物學(xué)

艾滋病與人類免疫缺損病毒的分子生物學(xué)

Molecularbiologyofacquiredimmunodeficiencysyndromeandhumanimmunodeficiencyvirus

第十四章1內(nèi)容8.1概述8.2HIV病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)與傳染8.3HIV基因結(jié)構(gòu)及編碼的蛋白8.4HIV的感染與復(fù)制8.5HIV基因的表達(dá)調(diào)控8.6病毒的致病機制8.7病毒感染與機體免疫8.8病毒感染的診斷8.9艾滋病的治療和預(yù)防2８.１概述HIV在病毒分類學(xué)上屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科（Retroviridae），慢病毒屬中的靈長類免疫缺損病毒亞屬，包括兩種，即HIV-I和HIV-II。該病毒科中共有7屬。反轉(zhuǎn)錄病毒科的主要成員如下表1。3表14８.２HIV病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)與傳染

一、形態(tài)結(jié)構(gòu)1、HIV結(jié)構(gòu)(平面)圖.152.HIV結(jié)構(gòu)(立體)圖.26傳播途徑：血液、血液制品以及人體分泌液，如奶液和精液等。傳播對象：T淋巴細(xì)胞，也可以感染其他類型如B淋巴細(xì)胞和單形核細(xì)胞等。危害：HIV能夠攻擊人體的免疫系統(tǒng)，特別是能夠侵入T細(xì)胞，使T細(xì)胞大量死亡，導(dǎo)致患者喪失一切免疫功能。二、病毒的傳染78８.３HIV基因結(jié)構(gòu)及編碼的蛋白一、基因結(jié)構(gòu)

HIV基因組由兩條單鏈正鏈RNA組成，每個RNLA基因組約為9.7kb。在RNA5’端有一帽子結(jié)構(gòu)(m7G5`GmpNp)，3’端有P0ly(A)尾巴。由結(jié)構(gòu)上包括LTR，結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)（gag），蛋白酶編碼區(qū)（pro），多種酶活性的蛋白編碼區(qū)（pol），外膜蛋白（env）編碼區(qū)以及6個調(diào)節(jié)基因。見(圖3)、（圖4）。9圖.310圖.4HIV基因結(jié)構(gòu)及編碼的蛋白11

二、編碼蛋白的功能

1.gag基因:

gag基因編碼病毒的核心蛋白，翻譯時先形成一個分子量大約是55kD的前體蛋日（p55），然后在HIV蛋白酶的作用下裂解成p17、p24、p15三個蛋白質(zhì)。p24和p17分別參與構(gòu)成HIV顆粒的內(nèi)殼和內(nèi)膜，p15進(jìn)一步裂解成與病毒RNA結(jié)合的核殼蛋白p9和p7。122.pol基因:

pol基因編碼病毒復(fù)制所需的酶類，其中p66蛋白為逆轉(zhuǎn)錄酶，p32蛋白則為整合酶（integrase，INT）。3.pro基因:

從pol和gag基因重疊區(qū)內(nèi)起始的一段序列為pro基因，它編碼蛋白酶p22，p22在裂解上述HIV蛋白前體形成終末成熟蛋白的過程中起著主要作用。134.env基因:

env基因先編碼出一個88kD的蛋白質(zhì)，經(jīng)糖基化后分子量增至160kD，這就是HIV包膜糖蛋白前體gP160。該前體蛋白在蛋白酶作用下被切割成gp120和gp41，gp120暴露于病毒包膜之外稱外膜蛋白。14

８.４HIV的感染與復(fù)制圖.5HIV的感染過程15

HIV的感染

HIV感染細(xì)胞時可與細(xì)胞的CD4受體蛋白相結(jié)合；gp41稱跨膜蛋白，是嵌入病毒包膜脂質(zhì)中的部分。當(dāng)gp120與CD4受體結(jié)合后，其構(gòu)象改變導(dǎo)致與gP41分離，暴露出的gp41可插入細(xì)胞膜，造成膜融合，致使病毒核心被導(dǎo)入細(xì)胞。HIV與受體結(jié)合后，病毒核心進(jìn)入細(xì)胞并在酶作用下脫去蛋白殼。RT以病毒RNA為模板合成單鏈DNA，隨之經(jīng)細(xì)胞的DNA聚合酶合成雙鏈cDNA。cDNA經(jīng)環(huán)化后整合到細(xì)胞染色體上，病毒核酸隨細(xì)胞的分裂而傳至子代細(xì)胞，十分穩(wěn)定，可長期潛伏。16

原病毒整合到宿主染色體上,無癥狀;原病毒利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和合成系統(tǒng)產(chǎn)生病毒mRNA,其中一部分編碼病毒蛋白,與基因組RNA組裝成新的病毒顆粒,從宿主細(xì)胞中釋放出來侵染其他健康細(xì)胞;宿主細(xì)胞死亡.主要過程總結(jié)如下:17８.５HIV基因的表達(dá)調(diào)控LTR序列(1)核心調(diào)控元件(2)核心轉(zhuǎn)錄單位(3)反式作用因子應(yīng)答元件參與復(fù)制的調(diào)控蛋白(1)Tat蛋白(2)Rev蛋白(3)Nef蛋白(4)Vpr蛋白(5)Vpu蛋白(6)Vif蛋白18

一、LTR序列1.核心調(diào)控元件2.核心轉(zhuǎn)錄單位3.反式作用因子應(yīng)答元件（見圖6）19調(diào)節(jié)單位

核心單位TRA

圖.6201.調(diào)節(jié)單位Coup-TFAP-1NF-ATUSFTCF-1аNF-κβ-453-78圖.721Coup-TF-371-334

雞卵蛋白轉(zhuǎn)錄因子是coup-F家族中相對低分子量蛋白含有鋅指環(huán)結(jié)構(gòu)，起負(fù)調(diào)節(jié)作用22AP-1

激活蛋白1由含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的c-jun和c-Fos家族成員組成的二聚體，屬于正調(diào)節(jié)因子-347-32923NF-AT

激活T細(xì)胞核因子（有兩個結(jié)合位點）。-292-235-216-20324USF

上游激活因子含有螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)具有負(fù)調(diào)節(jié)作用-160-17325TCF-1а

T細(xì)胞因子1a含有高速泳動簇基序，起正調(diào)節(jié)作用-139-12426NF-κβ

核因子κβ含有鋅指環(huán)結(jié)構(gòu)及錨定蛋白重復(fù)序列，是增強子區(qū)。由3-4bp間隔的兩個10bp（GGGACTTCCC）序列構(gòu)成，負(fù)責(zé)調(diào)控HIV基因在多種細(xì)胞（尤其是T細(xì)胞）中高速表達(dá)。-104-78272.核心單位-780

SP1

TATA圖.828

SP1

Sp1含有與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)和兩個富含谷氨酰胺的結(jié)構(gòu)域?？尚纬啥垠w或三聚體。當(dāng)三個sp1分子與DNA結(jié)合后，改變了DNA的空間構(gòu)型，激活HIV基因的轉(zhuǎn)錄。-78富含GC-4629TATA

TATA元件兩端有反向重復(fù)序列，可能是轉(zhuǎn)錄因子螺旋-環(huán)-螺旋DNA結(jié)合蛋白的識別位點。TATA元件上結(jié)合的是一組蛋白質(zhì)，這些蛋白稱為轉(zhuǎn)錄因子ⅡD（TFⅡD），也包括一些輔助激活蛋白（TBP）的細(xì)胞因子，這種作用是與RNA聚合酶相關(guān)，由此啟動轉(zhuǎn)錄。-24

-28303.TRA圖.931TRA(反式激活因子應(yīng)答元件)似發(fā)夾結(jié)構(gòu)，含有4個莖區(qū)和一個環(huán)區(qū)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)與tat蛋白結(jié)合有關(guān)。只有與tat蛋白共結(jié)合，才能轉(zhuǎn)錄出長mRNA，否則只能轉(zhuǎn)錄出小段的mRNA。32二、參與HIV復(fù)制的調(diào)控蛋白

1.Tat蛋白2.Rev蛋白3.Nef蛋白4.Vpr蛋白5.Vpu蛋白6.Vif蛋白33（1）Tat蛋白的結(jié)構(gòu)由tat基因編碼，tat有兩個外顯子，前外顯子編碼67aa,后外顯子編碼34aa，共101aa。兩個外顯子所形成的肽共有6個結(jié)構(gòu)區(qū)。前外顯子有5個區(qū)，后外顯子為一個區(qū)。見（圖.10）1.Tat蛋白34

Tat蛋白有6個結(jié)構(gòu)區(qū)，見下圖，其中第一、第二和第四個三個結(jié)構(gòu)區(qū)與反式激活功能有關(guān)。圖.10Tat蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖35第1區(qū)為N區(qū)，也是酸性氨基酸區(qū)，因含有Gln和Asp對激活HIV-1基因的表達(dá)有增強作用。36第2區(qū)為富含Cys區(qū)，在其16個aa中含有7個Cys,可以與二價金屬離子形成tat二聚體，在7個Cys中有6個是維持tat活性所必需的。37第4區(qū)為堿性區(qū)，有兩個功能：48~52為GRKKR（甘-精-賴-賴-精）序列，是核仁定位信號，可介導(dǎo)自身或異種蛋白進(jìn)入細(xì)胞核。該肽段可與TAR的RNA的凸起部分特異結(jié)合。38（2）調(diào)控原理Tat與TAR是一個協(xié)同調(diào)解過程。

TAR序列及完整的高級結(jié)構(gòu)對調(diào)控的影響。若TAR序列發(fā)生突變，雖tat蛋白也能結(jié)合，但不能激活HIV表達(dá)。寄主因子協(xié)同作用的影響

在不同的細(xì)胞中，tat的活性可有上千倍的差別，在人鼠雜交細(xì)胞中，只有在保持人第12號染色體的雜交瘤細(xì)胞中，tat才能有效地激活HIV-1的轉(zhuǎn)錄。說明其調(diào)控還需寄主細(xì)胞編碼蛋白的協(xié)助作用。39上游啟動子和增強子對調(diào)控的影響

當(dāng)TAR遠(yuǎn)離啟動子時，它的活性迅速下降。而且這種依賴作用對非激活和激活細(xì)胞并不一樣，對激活細(xì)胞作用非常大，而NF-κβ的作用恰與上述依賴作用相反。40

Rev蛋白由兩個外顯子組成，分別編碼一個25個氨基酸和91個氨基酸的肽段，這兩個肽段最終組成一個116個氨基酸、其主要功能是促進(jìn)HIV基因表達(dá)由早期（轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白mRNA）向晚期（轉(zhuǎn)錄HIV結(jié)構(gòu)蛋白mRNA）的轉(zhuǎn)化，并促進(jìn)晚期轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。2.Rev蛋白4142Nef蛋白由Nef基因編碼的，分子量為27kD，屬于負(fù)調(diào)控蛋白和磷酸化蛋白，與細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)相結(jié)合。Nef蛋白非HIV復(fù)制所必需，但可抑制HIVLTR特異性轉(zhuǎn)錄的HIV－1原病毒基因的表達(dá)。3.Nef蛋白43

Vpr蛋白由96個氨基酸構(gòu)成，亦非HIV復(fù)制所必須，但存在于病毒顆粒中。含有vpr基因的HIV毒株與無vpr基因的HIV毒株比較，前者在細(xì)胞中生長較快，致細(xì)胞病變也較強于無vpr基因的天然株。4.Vpr蛋白44

Vpu蛋白是含81個氨基酸的磷酸化蛋白，為HIV－1特有，其功能可能是促進(jìn)HIV－1顆粒的裝配和從細(xì)胞膜釋放，或抑制HIV－1顆粒從細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)中芽生。5.Vpu蛋白45

Vif蛋白是分子量為23kD的病毒顆粒感染性因子，缺失Vif基因的HIV－1可在細(xì)胞內(nèi)正常復(fù)制并產(chǎn)生病毒顆粒，但其比無Vif基因缺失的HIV-1產(chǎn)生的病毒顆粒的感染性低1000倍。6.Vif蛋白46HIV復(fù)制與細(xì)胞表達(dá)圖解RNARTcDNA(單鏈)DNA聚合酶環(huán)化細(xì)胞染色體切割酶切口切口p32DNA(雙鏈)LTRSp1TATATARgagpolvprvpuenvnefLTRRevratvif指導(dǎo)調(diào)控基因表達(dá)(結(jié)構(gòu)基因不表達(dá))Tat蛋白tatRev蛋白nef蛋白Vpu蛋白Vpr蛋白Vif蛋白RevRev運入細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白RNA組裝新的HIV侵染轉(zhuǎn)錄mRNAmRNA迅速被切割運入細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄不被切割47８.６病毒的致病機制一、臨床癥狀

感染的急性期：HIV初次感染人體后，開始大量復(fù)制和擴散的過程，這時感染者血清出現(xiàn)HIV抗原，從外周血細(xì)胞、腦脊液和骨髓細(xì)胞也能分離到HIV。

無癥狀潛伏期：約70％以上的原發(fā)感染者在感染后2～4周內(nèi)出現(xiàn)急性感染癥狀，包括發(fā)熱、咽炎、淋巴結(jié)腫大持續(xù)1～2周，此期感染者無任何臨床癥狀，形同健康人，外周血中HIV抗原含量很低或檢測不到。

艾滋病相關(guān)綜合癥期：隨感染時間的延長，HIV重新開始大量復(fù)制并造成免疫系統(tǒng)的進(jìn)行性損傷。在臨床上，病人感染逐步發(fā)展到持續(xù)性全身性淋巴腺病、艾滋病相關(guān)綜合癥（AIDS－relatedcomplex，ARC）。約有50％的感染者在感染后7～8年發(fā)展到艾滋病。48

產(chǎn)毒性HIV感染的最終結(jié)果是產(chǎn)生大量病毒顆粒，造成感染細(xì)胞死亡，這是逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒亞科病毒的特征。HIV除在細(xì)胞內(nèi)大量繁殖造成細(xì)胞死亡外，還可經(jīng)以下幾種情況導(dǎo)致免疫功能下降：HIV顆粒表面的gp120蛋白脫落，與正常TH細(xì)胞膜上CD4受體結(jié)合，該細(xì)胞被免疫系統(tǒng)誤認(rèn)為是病毒感染細(xì)胞而遭殺滅。因TH細(xì)胞CD4受體被gpl20封閉，影響其免疫輔助切能。HIVgp120蛋白可刺激機體產(chǎn)生抗其CD4結(jié)合部位的抗獨特型抗體，此抗體是抗CD4受體的抗自身抗體，可阻斷TH細(xì)胞的功能。受染細(xì)胞表面帶有病毒包膜蛋白gp120，可與其他CD4+細(xì)胞結(jié)合并形成巨細(xì)胞而失去功能，如此加速了HIV對免疫系統(tǒng)損害的范圍和程度。二、病因：49病毒的致病機制超抗原（superantfeen）：

超抗原可導(dǎo)致小鼠體內(nèi)特定的T淋巴細(xì)胞亞群的消失和免疫缺損的發(fā)生。普通抗原需要經(jīng)T淋巴細(xì)胞受體的α和β兩條鏈的識別才能激活一細(xì)胞。體內(nèi)有多種α鏈和β鏈，二者可任意配對，構(gòu)成極為多樣的受體組合和表面帶該抗體的T淋巴細(xì)胞亞群，而超級抗原則與T淋巴細(xì)胞受體β鏈結(jié)合，導(dǎo)致所有帶有此β鏈的T淋巴細(xì)胞亞群均被激活。而且與被普通抗原激活的結(jié)果不同，這些T淋巴細(xì)胞亞群不是產(chǎn)生了對抗原的免疫反應(yīng)并分裂增生，而是喪失了對抗原的反應(yīng)。并逐漸從免疫系統(tǒng)中消失。50８.７病毒感染與機體免疫一、體液免疫

HIV自然感染過程中，機體可產(chǎn)生高滴度的抗HIV多種蛋白質(zhì)的抗體，包括中和抗體。中和抗體盡管有組特異性的，但主要是型特異性的。這些抗體有一定的保護(hù)作用，主要是在急性感染期降低血清中的病毒抗原量乃至清除病毒。51二、細(xì)胞免疫

HIV感染也刺激機體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，包括依賴于抗體的細(xì)胞毒性（antibody－dePendentcellmediatedcytotoxicity，ADCC）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)（cytotoxicTlymPhocyte，CTL）和自然殺傷細(xì)胞（naturalkillercell，NK）等。特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，特別是CTL對于殺傷HIV感染的細(xì)胞和阻止HIV經(jīng)細(xì)胞接觸而擴散發(fā)揮重要作用，CTL可以幫助清除急性感染期多部位HIV感染灶和HIV感染早期的少量有HIV復(fù)制的細(xì)胞。52８.８病毒感染的診斷艾滋病診斷就是要找出HIV感染的證據(jù)，即HIV抗原或抗HIV抗體的存在。一、抗原檢測

1、病毒分離

2、逆轉(zhuǎn)錄酶測定

3、核酸測定53二、血清學(xué)診斷

HIV感染血清學(xué)診斷的方法有多種，與各種方法均是獨立的確診實驗的抗原檢測方法不同，每種血清學(xué)診斷方法各有所長及不足，常常按一定的組合配合應(yīng)用，以互相補充，達(dá)到做出高效、正確診斷的目的。

54８.９艾滋病的治療和預(yù)防一、治療

迄今為止，雖然對艾滋病的研究受到了高度重視，仍無任何藥物可以完全抑制HIV在感染者體內(nèi)的增殖并徹底治愈艾滋病。目前，已批準(zhǔn)的抗HIV病毒藥物主要有：核苷酸型反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（表2）、非核苷酸型反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（表3）和蛋白酶抑制劑（表4）。55

核苷酸型反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑Abacavir(ABC)Stavudine(d4T)Didanosine(ddl)Zalcitabine(ddc)Lamivudine(3Tc)Zidovudine(AZT)表.256非核苷酸型反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑EfavirenzNevirapineDelavirdine表.357蛋白酶抑制劑AmprenavirIndinavirLopinavirNelfinavirRitonavirSaquinavir

表.458二、預(yù)防

病毒疫苗

1.HIV疫苗應(yīng)用與失敗

在HIV疫苗應(yīng)用的巨大市場兩方面因素的驅(qū)動