菌種冷凍保藏

菌種冷凍保藏菌種保藏對(duì)于生物制藥是一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)工作。要使菌種長(zhǎng)期保藏，且其生物學(xué)性狀和遺傳性質(zhì)不變，必須選擇適宜的載體和更穩(wěn)定的保藏方法。菌種保藏?zé)o論哪種方法，其原理都是創(chuàng)造一個(gè)抑制細(xì)胞代謝的環(huán)境，即低溫、干燥、缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)，使新陳代謝活動(dòng)處于高度靜止?fàn)顟B(tài)。在眾多的菌種保存方法中，相對(duì)所需保藏環(huán)境，冷凍真空干燥法（即冷凍管保藏）是目前保藏方法中應(yīng)用最為廣泛最為有效的一種。1、冷凍真空干燥保藏原理冷凍真空干燥保藏法可使細(xì)胞或如子水分在凍結(jié)狀態(tài)下直接升華而干燥。冷凍管保藏的三要素：真空一一降低水的蒸汽壓以加速水分的蒸發(fā)；冷凍一一使水蒸氣冷凝以減輕真空泵負(fù)荷，加速干燥；低溫一一達(dá)到進(jìn)一步加速干燥的目的。2、冷凍干燥的優(yōu)點(diǎn)：對(duì)微生物的生物活性影響?。凰酶煞凼杷?，溶解性好；水分含量低。由于同時(shí)滿(mǎn)足菌種保藏三要素，使微生物始終處在低溫、干燥、缺氧的條件下，能克服傳代、沙土管簡(jiǎn)單保藏方法的不足，保藏菌種范圍廣、時(shí)間長(zhǎng)（保藏期可達(dá)數(shù)年至十?dāng)?shù)年）、存活率高、保存過(guò)程不易失活和退化等。3、主要步驟為：3.1將待保藏菌種的細(xì)胞或抱子懸浮于保護(hù)劑（如脫脂牛奶）中；3.2在低溫（-45°C以下）下使微生物細(xì)胞快速冷凍；3.3在真空條件下使冰升華，以除去大部分的水分；3.4封口使菌種始終處于真空缺氧狀態(tài)；3.5冷藏創(chuàng)造低溫、干燥的保藏環(huán)境。4、材料菌株：篩選出具有優(yōu)良性能的菌株。試劑：2%HC1；脫脂牛奶（20%乳液）、器具：培養(yǎng)皿、接種環(huán)、250ml三角瓶、高壓蒸汽滅菌鍋、牛皮紙、酒精噴燈、恒溫培養(yǎng)箱、酒精棉球、淚滴型安瓶管、標(biāo)簽、長(zhǎng)頸毛細(xì)玻璃管、普通棉、凍干機(jī)。培養(yǎng)：種子液體培養(yǎng)基、斜面或平板培養(yǎng)基。5、主要流程備淚滴型安瓶管一備脫脂乳f制菌懸液一分裝一預(yù)凍一真空干燥一封管一保藏6、操作方法6.1準(zhǔn)備安甑管選取質(zhì)地均勻、無(wú)毛點(diǎn)、無(wú)氣泡的中性硬質(zhì)玻璃專(zhuān)用菌種冷凍管，形狀為長(zhǎng)頸球形底（亦稱(chēng)淚滴型安甑管），規(guī)格約外徑6?7.5mm,長(zhǎng)105mm,球部直徑9?llmin,壁厚0.6?1.2nun。先用2%鹽酸浸泡8?10h,再經(jīng)自來(lái)水沖洗多次，用蒸儒水涮洗2?3次，烘干；管口塞上棉花，用牛皮紙包扎，1.05kg/cm2,121°C滅菌30分鐘，取出置37°C孵育24小時(shí)，重復(fù)滅菌一次，105?110C烤干（有硅膠指示劑的要使硅膠達(dá)到深藍(lán)色），置干燥器內(nèi)備用。6.2制備脫脂乳取市售新鮮、清潔、無(wú)抗生素污染的原牛奶300ml煮沸，在5000r/nuii下離心10分鐘,除去上層奶皮、油脂，吸取下層奶液，經(jīng)脫脂棉過(guò)濾，如此反復(fù)3次脫去脂肪，然后分裝入兩個(gè)250ml三角瓶中，加棉塞并用牛皮紙包頭、扎牢，在115°C25min高壓蒸汽滅菌，冷卻后做無(wú)菌試驗(yàn)，4C冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ部梢再?gòu)買(mǎi)袋裝或盒裝的超高溫滅菌優(yōu)質(zhì)脫脂牛奶直接使用，無(wú)需再滅菌。還可將脫脂奶粉制成還原乳，配成20%乳液，同上滅菌后使用。如滅菌后放置時(shí)間超過(guò)24小時(shí)，則應(yīng)棄用。6.3菌種準(zhǔn)備菌種要求為篩選得到的優(yōu)質(zhì)良種，生長(zhǎng)良好的純種，抱子新鮮，菌齡以處于穩(wěn)定期或超過(guò)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為好，有利于延長(zhǎng)凍干存活期。放線菌斜面種子培養(yǎng)7?10天，生長(zhǎng)飽滿(mǎn)，抱子豐富，且無(wú)菌檢查合格。6.4制菌懸液形成抱子的鏈霉菌要盡可能保存抱子，避免基質(zhì)菌絲.體。每支長(zhǎng)好的斜面加5?10ml脫脂牛乳，用接種環(huán)將抱子輕輕刮下（注意勿刮起培養(yǎng)基），或震蕩洗下抱子層，制成菌懸液。一般要求制成的如子濃度達(dá)IO、?10】。個(gè)，高濃度的菌懸液有利菌種保藏。多年后存活率仍高。6.5分裝菌懸液制備完成后要盡快分裝。分裝冷凍管時(shí)用滅菌的長(zhǎng)頸毛細(xì)吸管吸取菌懸液，插入預(yù)先的冷凍管球形底部，每支冷凍管分裝量約0.2?0.5毫升，分裝后向管頸部塞入無(wú)菌脫脂棉，以不緊為宜。并貼上標(biāo)簽，同時(shí)配制1支1%氯化鉆牛奶溶液干燥指示管。分裝時(shí)間要短，要盡快進(jìn)入凍結(jié)。6.6預(yù)凍因?yàn)檠杆俪蜏仡A(yù)凍可保持菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)成份原狀，利于細(xì)菌存活。故將分裝好的冷凍管及指示管置于低溫冰箱冷凍室-70°CT快速冷凍過(guò)夜。無(wú)低溫冰箱可用冷凍劑如干冰（固體CO2）酒精液或干冰丙酮液，溫度可達(dá)-70°Co也可用液氮。將冷凍管插入冷凍劑，只需冷凍4-5分鐘，即可使懸液結(jié)冰。也可用液氮預(yù)凍。還可用低溫冰箱-80°C預(yù)凍1?2小時(shí)后轉(zhuǎn)入冷凍真空干燥。6.7冷凍真空干燥真空冷凍干燥器有成套的裝置出售（長(zhǎng)藥廠新近成立菌種中心，購(gòu)有該機(jī)）。按其方法操作。冷凍干燥機(jī)要先開(kāi)機(jī)預(yù)冷30分鐘以上，再根據(jù)冷凍干燥機(jī)的水分蒸發(fā)能力，確定一次放入的冷凍管數(shù)量。將預(yù)凍好的冷凍管及指示管于次日取出迅速放入己預(yù)冷的冷凍干燥機(jī)的干燥箱內(nèi)，開(kāi)動(dòng)真空泵進(jìn)行一級(jí)真空抽干，待指示管出現(xiàn)由粉紅色變?nèi)m色時(shí)，再進(jìn)行二級(jí)抽干12ho二級(jí)真空干燥既保持菌體細(xì)胞干燥度，乂避免細(xì)胞反復(fù)凍結(jié)造成保存中菌體死亡，因而能更長(zhǎng)期保存菌種，并能提高其存活率，乂不會(huì)發(fā)生菌株的變異冷凍干燥，時(shí)間一般為8?20小時(shí)。6.8干燥的確認(rèn)和停機(jī)終止干燥時(shí)間應(yīng)根據(jù)下列情況判斷：①冷凍管內(nèi)菌懸液呈酥塊狀或松散片狀；②真空度接近空載時(shí)的最高值；③選用1?2支對(duì)照管，其水份與菌懸液同量，其干燥后視為完結(jié)。確認(rèn)菌懸液是否己經(jīng)干燥的另一方法是：一看真空度，二看冷凍室溫度。當(dāng)水分已經(jīng)蒸發(fā)完，即水蒸汽分壓接近零時(shí)，真空度將達(dá)到最高值而不再上升；由于蒸發(fā)是一個(gè)吸熱過(guò)程,在整個(gè)冷凍干燥過(guò)程中冷凍室的溫度會(huì)維持很低，使菌懸液一直處于凍結(jié)狀態(tài)，當(dāng)沒(méi)有水分繼續(xù)蒸發(fā)后，冷凍室不再吸熱，溫度開(kāi)始自然上升。確認(rèn)干燥后，要先開(kāi)啟冷凍室的進(jìn)氣閥，讓真空釋放，然后停泵，打開(kāi)冷凍室，將冷凍管取出。為了確保冷凍管內(nèi)的菌粉不被污染，在冷凍室進(jìn)氣口應(yīng)裝有空氣過(guò)濾器（如塞滅菌棉）。6.9封管將取出的冷凍管，裝入抽真空的耐壓橡皮歧管上抽氣，待真空度抽至1.33Pa（0.01亳米汞拄）后，再采用酒精噴燈火焰于冷凍管頸部棉塞以下熔封處拉細(xì)熔封，封管好后，要用高頻火花器檢查各冷凍管的真空情況。如果冷凍管頂部呈現(xiàn)灰藍(lán)色光，即證明保持著真空。檢查時(shí)高頻電火花器要射向冷凍管的上半部。6.10冷凍保藏封管合格的冷凍管置冰箱-20C避光處作長(zhǎng)期保存。較低的保藏溫度（-20?-70°C）對(duì)于菌種的長(zhǎng)期穩(wěn)定更好。注意事項(xiàng)7.1淚滴型安瓶瓶不易進(jìn)水，清洗時(shí)拿少量安瓶瓶慢慢傾斜，使其管內(nèi)浸入鹽酸；用蒸僧水

洗時(shí)亦如此；塞棉花時(shí)注意松緊適宜，利于防止污染及抽真空。7.2脫脂乳最好在使用頭一天配制好滅菌；滅菌需注意溫度不能過(guò)高，在115°C25min分鐘即可；當(dāng)壓力降為0后，應(yīng)盡快將其拿出，防止高溫破壞其成分（滅菌后顏色發(fā)生變化的不可用）o7.3分裝時(shí)，需三個(gè)人配合，一個(gè)吸菌液，另一個(gè)塞棉花，還有一個(gè)貼標(biāo)簽。7.4采用酒精噴燈進(jìn)行封管時(shí)，燒的溫度要適宜。封管后不要立即放在臺(tái)面上，以防受冷撕裂。長(zhǎng)頸毛細(xì)玻璃管附圖：淚滴型安瓶管棉塞□熔封區(qū)（標(biāo)簽處——裝液區(qū)——C-—多頭岐管抽真空?—附：1、冷凍保藏改進(jìn)方法（一）長(zhǎng)頸毛細(xì)玻璃管抽真空?—因真空冷凍干燥器價(jià)格比較昂貴，通?？股厣a(chǎn)廠都采用自制的簡(jiǎn)單易行辦法，可達(dá)到同樣的目的。即:1.真空干燥：取出預(yù)凍好的冷凍管，置于如沙土管制備能抽真空的玻璃干燥器內(nèi)（干燥器四周置冰塊或無(wú)水乙醇、冰鹽水放低溫冰箱或普通冰箱冷凍室事先冷至-21°C土），迅速抽真空。其間不斷更換冰塊或冷凍液。能將該玻璃干燥器置于冰柜抽真空更好。連續(xù)抽氣6?

8h即可。（干燥器蓋底接觸處需事先均勻涂抹凡士林石臘，以防微小漏氣。）2.封管：自制一個(gè)帶多頭的岐管，主管連接真空泵，每個(gè)岐管連接都采用可抽真空的耐壓硅膠管，能裝上多支冷凍管即可。3.還可用自制簡(jiǎn)易的冷凍干燥機(jī)制備冷凍管：如圖:冷凍真空室（放冷凍干燥管）硅膠管2、冷凍保藏改進(jìn)方法（二）冷凍真空室（放冷凍干燥管）硅膠管冷凍管由傳統(tǒng)的玻璃管改為0.5ml帶蓋塑料管（維奧即采用此法可保藏大量的錐形塑料管，其材質(zhì)不詳，能耐高溫滅菌，蓋為按壓式）。方法：⑴將塑料管置耐高壓盒器內(nèi)，用雙層牛皮紙包好，高壓蒸汽121°C20min消毒，放烤箱80°C烤干。⑵在凈化工作臺(tái)內(nèi)將脫脂牛奶洗下的抱子懸液用長(zhǎng)頸毛細(xì)吸管加到塑料管的底部，每只0.2ml左右，切記不要將牛奶污染離心管口。⑶將加好菌液的塑料管置于管架上放入盒器內(nèi)置-20°C冰箱預(yù)凍，預(yù)凍好后將其放置到真空冷凍干燥機(jī)干燥箱內(nèi)凍干。⑷凍干后在凈化工作臺(tái)內(nèi)壓好塑料管蓋，不抽真空，用封口膜封塑料管口。用記號(hào)筆分別標(biāo)簽，放-20°C冰箱保存。即可。該改