第六章DNA重組與克隆(陜西師范大學)final課件

基因重組與基因工程GeneticRecombinationandGene

cloning

第六章基因重組與基因工程第六章1DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合稱遺傳重組或或基因重排。重組產(chǎn)物稱為重組體?；蛑亟M主要發(fā)生在減數(shù)分裂時同源染色體之間的交換。（形式多樣）重組與進化關系密切，增加群體的遺傳多樣性，利于突變的優(yōu)化組合。DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合稱遺傳重組或或基因2DNA重組接合作用(conjugation)轉化作用(transformation)轉導作用

(transduction)#轉座

(transposition)#同源重組

(homologousrecombination)#位點特異的重組(site-specificrecombination)異常重組DNA重組接合作用(conjugation)轉化作用(t3發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機制的Holliday模型。6.1、同源重組發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousr4Holliday模型中，同源重組主要4個關鍵步驟①兩個同源染色體DNA排列整齊②一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接，形成Holliday中間體③通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA（立體異構）④Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)Holliday模型中，同源重組主要4個關鍵步驟①兩個同源5片段重組體

：切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側來自同一親本DNA。拼接重組體：切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側來自不同親本DNA。

5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′片段重組體：拼接重組體：5′5′5′5′3′3′3′3′6

內(nèi)切酶

(recBCD)DNA侵擾(recA)分支遷移

(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′目錄內(nèi)切酶DNA侵擾分支遷移內(nèi)切酶DNA5′3′7片段重組體（見模型圖左邊產(chǎn)物）：

切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側來自同一親本DNA。拼接重組體（見模型圖右邊產(chǎn)物）：切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側來自不同親本DNA。片段重組體（見模型圖左邊產(chǎn)物）：拼接重組體（見模型圖右邊85′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′9Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體目錄Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′10分支移動的過程伴隨著DNA的修復分支移動的過程伴隨著DNA的修復11同源重組是減數(shù)分裂的原因。同源重組是由于堿基間的精確配對實現(xiàn)的同源重組是減數(shù)分裂的原因。12異源雙鏈與基因交換同源重組時會產(chǎn)生異源雙鏈，從而發(fā)生基因交換。減數(shù)分裂后分離：（對異源雙鏈區(qū)內(nèi)不配對堿基的修復而進行的基因校正過程稱作基因轉換）基因轉換頻率在非對稱異源雙鏈區(qū)較高。基因轉換也可以在有絲分裂時姐妹染色體的等位基因間、有絲分裂與減數(shù)分裂時同一條染色單體上非等位重復基因之間發(fā)生異源雙鏈與基因交換同源重組時會產(chǎn)生異源雙鏈，從而發(fā)生基因交換13Holliday模型提出了同源重組的基本模式，但對于基因重組具體細節(jié)，異源雙鏈的形成細節(jié)不清楚。在Holliday基礎上提出了單鏈斷裂模型和雙鏈斷裂模型，兩個模型的區(qū)別在于解釋重組期間DNA的修復的具體過程不一樣。有供體受體之分。（受體：發(fā)生鏈斷裂的分子P138-139）Holliday模型提出了同源重組的基本模式，但對于基因重14細菌的基因轉移與重組低等生物也可以以轉化、轉導、結合等多種方式實現(xiàn)細胞間的基因轉移。具體方式：接合、轉化、轉導、細胞融合。外源基因的命運：降解、暫時保留、與內(nèi)源基因置換、整合。細菌的基因轉移與重組低等生物也可以以轉化、轉導、結合等多種方15

一、接合作用（conjugation)

當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接 觸時，質粒DNA從一個細胞（細菌）轉移至 另一細胞（細菌）的DNA轉移稱為接合作用。

16

F因子編碼表面排斥蛋白、切口酶、解螺旋酶、DNA轉移通道蛋白等、F因子編碼表面排斥蛋白、切口酶、解螺旋酶、DNA轉移通17

F因子可以與細菌染色體發(fā)生交叉連接而重組整合入細菌染色體F因子可以與細菌染色體發(fā)生交叉連接而重組整合入細菌染色18

二、轉化作用（transformation)

通過自動獲取或人為地供給外源DNA， 使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型。感受態(tài)細胞高濃度鈣可以誘導感受態(tài)感受態(tài)細胞高濃度鈣可以誘導感受態(tài)19例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。20

三、轉導作用（transduction)

當病毒從被感染的細胞（供體） 釋放出來，再次感染另一細胞（受體） 時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間 的DNA轉移及基因重組。

21溶菌感染重組感染細菌噬菌體圖15-3轉導作用轉導：通過病毒介導發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移及基因重組溶菌感染重組感染細菌噬菌體圖15-3轉22轉導：當病毒從被感染的供體細胞釋放出來，再次感染另一受體細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移及基因重組即為轉導作用轉導(transduction)轉導：當病毒從被感染的供體細胞釋放出來，再次感染另一受體細胞23*轉染(transfection)轉染是轉化的一種特殊形式。由transformation（轉化）和infection（感染）兩詞構成。原指將噬菌體、病毒或以其為載體構建的重組子導入受體細胞的過程。通過感染方式將外來DNA引入宿主細胞，并導致宿主細胞遺傳性狀改變的過程稱為轉染。將任何類型DNA轉移至動物細胞內(nèi)的過程均可叫轉染。*轉染(transfection)轉染是轉化的一種特殊形式。24細菌的細胞融合由于細胞質膜融合導致的基因轉移和重組。（原生質體融合）細菌的細胞融合由于細胞質膜融合導致的基因轉移和重組。25細菌的同源重組的酶學機制1、RecBCD（外切核酸酶Ⅴ）和Chi位點具有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、核酸外切酶活性、

序列特異性的單鏈內(nèi)切酶活性單鏈內(nèi)切酶活性和解旋酶活性使DNA產(chǎn)生具有游離末端的單鏈－－－RecA的作用位點RecBCD有固定切割位點原核生物的重組酶學機制已經(jīng)比較清楚Chi位點出現(xiàn)幾率很高，是RecBCD的靶位點GCTGGTGG細菌的同源重組的酶學機制1、RecBCD（外切核酸酶Ⅴ）和263‘?RecBCD的識別和切割位點a、RecBCD結合在DNA的平頭末端（產(chǎn)生機制不清楚）b、外切、解鏈、移動（ATP）c、兔耳狀loop結構產(chǎn)生再旋酶活性低于解旋酶活性）d、RecBCD在loop單鏈區(qū)的

chi位點3‘方4～6NT處切斷單鏈（單鏈內(nèi)切酶）?

chi位點：GCTGGTGG

目前發(fā)現(xiàn)的重組熱點

E.coli

含1000個、Euk.3‘?RecBCD的識別和切割位點a、RecBCD27e、RecBCD切割產(chǎn)生3’單鏈末端e、RecBCD切割產(chǎn)生3’單鏈末端28

2、RecA蛋白

（1）

活性a、RecA有單、雙鏈DNA

結合活性b、RecA有NTPase活性（底物差異活性）與單鏈DNA結合時活性最大---依賴于DNAc、RecA有啟動一個分子的單鏈侵入到另一雙螺旋分子的能力，即聯(lián)會同源DNA

（但其靶DNA必須有缺口－－結合DNA）2、RecA蛋白（1）活性a、RecA有單、雙29第六章DNA重組與克隆(陜西師范大學)final課件30RecA入侵單鏈被置換連RecA引發(fā)鏈侵入模型RecA入侵單鏈被置換連RecA引發(fā)鏈侵入模型31RecA引起的鏈交換和Holliday結構的生成

RecA引起的鏈交換和Holliday結構的生成32

（2）RecA蛋白催化雙鏈和單鏈DNA

的反應階段a、聯(lián)會前階段（緩慢）

RecA與單鏈結合b、單鏈與雙螺旋的互補鏈迅速配對，形成雙鏈連接分子

Holliday（5‘侵入）c、從雙螺旋結構中緩慢置換一條鏈產(chǎn)生一段長的異源雙鏈DNA

反應結束時，RecA結合到雙鏈上?其中—單鏈同化有固定的方向入侵單鏈進入的方向是5’－3‘，雙鏈DNA的互補鏈是3’－5‘（2）RecA蛋白催化雙鏈和單鏈DNA的反應階段a、33第六章DNA重組與克隆(陜西師范大學)final課件34?RecBCD和

RecA的共同作用RecBCD產(chǎn)生游離單鏈---RECA因子接到重組反應?RecBCD和RecBCD產(chǎn)生游離單鏈---35

3、原核同源重組的其它蛋白

需要E.coli中三個基因ruvA,ruvB和ruvC的產(chǎn)物a、RuvA識別Holliday結構的連接點b、RuvB為分枝遷移提供動力（ATPase10～20bp/s）c、RuvC核酸內(nèi)切酶---專一性識別Holliday結構的連接點體外切段連接點以拆分重組體3、原核同源重組的其它蛋白需要E.coli中三個基36?E.coli重組的各階段（損傷修復）損傷DNA復制產(chǎn)生缺口RecA鏈交換第二次鏈交換DNApol通過DNA合成填滿缺口RuvA,B分枝遷移RuvC切割Holliday連接點真核生物同源重組機制自學?E.coli重組的各階段損傷DNA復制產(chǎn)生缺口Re377.2、位點專一性重組（

site-specificrecombination）1、概念：發(fā)生在專一序列而順序極少相同的DNA分子間的重組（包括一些基因表達調(diào)節(jié)、發(fā)育過程中DNA重排）噬菌體基因組整合到細菌染色體基因組中屬此種重組2、特征：?在特定的結合序列部位，有專一的酶催化斷裂重接

----產(chǎn)生精確的DNA重排?都具有整合作用的兩個基本特征a、典型的保守性重組---交換是相互的和保存原先的DNAb、發(fā)生在噬菌體和細菌DNA短同源序列的專一性核苷酸上7.2、位點專一性重組（site-specificr38二、λphage的整合與切除（溶原和裂解狀態(tài)）1、實現(xiàn)機制：均是通過---細菌DNA和λDNA上特定位點之間的重組2、特定位點-----附著位點（attachmentsiteatt）?E.coliattB

含BOB’三序列23bp?λphage

attP

含POP’三序列

240bp?核心序列“O”完全一致

（同源部分）

---位點特異性重組發(fā)生的地方?B,B’,P,P’---臂二、λphage的整合與切除（溶原和裂解狀態(tài)）1、實現(xiàn)機制：393、整合過程?整合后的附著位點為

attL（BOP’）

attR（POB’）?整合位點---attB、attP

切除位點---attL、attR?整合過程需要λ整合酶

（integraseInt）（λ編碼）和寄主的整合宿主因子IHF

（integrationhostfactor）共同作用3、整合過程?整合后的附著位點為?整合位點---40溶源性細菌(lysogen)溶菌周期（lysis）原噬菌體溶源性細菌溶菌周期原噬菌體414、整合分子機制?核心序列O全長15bp，富含A-T?發(fā)生在O內(nèi)的重組交換位點相距

7bp?整合酶的結合位點：attP240bp、attB23bp(兩者的作用不同)?attP位點的負超螺旋為重組所必須---加強了Int和IHF的親和力

-----高劑量的蛋白維持單鏈重組所必需的結構?Int結合

----核心序列的反向位點（切割位置）

----結合在att臂上（臂與核心區(qū)靠近）4、整合分子機制?核心序列O全長15bp，富含A-T?42intIHFXisintIHFXis43?整合體及其作用整合體（intasome）---Int和IHF結合到attP時的復合物?整合體捕獲attB

說明-----

a、attB和attP的最初識別靠Int

識別兩序列的能力

b、兩序列的同源性在鏈交換時為重要因素?整合體及其作用?整合體捕獲attB44?Int蛋白能切斷DNA，并使它重新連接，近而使holliday結構拆分?重組時attP和attB部位交叉斷裂，互補單鏈末端進行交叉雜交?Int蛋白能切斷DNA，并使它重新連接，近而使hol45例（二）細菌的特異位點重組沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉變例（二）細菌的特異位點重組沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉變46hix為反向重復序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進行特異位點重組(倒位)。H片段上有兩個啟動子P，其一驅動hin基因表達，另一正向時驅動H2和rH1基因表達，反向(倒位)時H2和rH1不表達。rH1為H1的阻遏蛋白基因。hix為反向重復序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進行特47H2鞭毛素

阻遏蛋白Hin重組酶轉位片段hinH2IH1

H1鞭毛素hinH2IDNA啟動序列H1啟動序列沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉變P197H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重組酶轉位片段hinH2IH487.3、轉座成分概述1、轉座子(元)或轉座元件(transposonortransposableelement):

基因組上不必借助于同源序列就可以移動的DNA片段，它們可以直接從基因組的一個位點移到另一個位點（供體和受體）轉座（transposition）：轉座元的轉移過程（不十分確切）2、發(fā)現(xiàn)和發(fā)展?1914A.Emerson1936Marcus.M.Rhoabes

玉米果皮、糊粉層花斑突變

玉米籽粒糊粉層色素不穩(wěn)定遺傳機理

跳躍基因（jumpinggene）?1947冷泉港實驗室（美）BarbaraMcClintock7.3、轉座成分概述1、轉座子(元)或轉座元件(transp49a)不依賴供體序列與靶位點間序列的同源性b)轉座不是簡單的轉移，涉及轉座子的復制Hotspots(熱點)Regionalpreference(在3kb區(qū)域內(nèi)的隨機插入)d)某些轉座因子（Tn3）對同類轉座因子的插入具有排他性

（免疫性）e)靶序列在轉座因子兩側會形成正向重復f)轉座因子的切除與轉座將產(chǎn)生復雜的遺傳學效應3、轉座重組的特點c)轉座插入的靶位點并非完全隨機（插入專一型）a)不依賴供體序列與靶位點間序列的同源性b)轉座不是50二、Prok.轉座子種類?兩種類型：簡單轉座子（simpletransposon）（插入序列insertionsequenceIS）復合轉座子（compositetransposon）?共同特征：a）兩端有20～40bp的IR(反向重復序列)b）具有編碼轉座酶（transposase）的基因1、插入序列（最簡單的轉座子稱作插入序列）?最簡單，是細菌染色體、質粒和某些噬菌體的正常組分?命名：IS＋編號（鑒定類型）長度700～2000bp二、Prok.轉座子種類?兩種類型：簡單轉座子（si51?特點：a）兩端IR為轉座酶的識別位點（突變）

b）插入靶位點后會出現(xiàn)靶位點的正向重復（3～9bp）?特點：a）兩端IR為轉座酶的識別位點（突變）52?IS可以正反方向插入到DNA（宿主、質?；蚰承┦删w），常對插入位點后面的基因表達功能產(chǎn)生極性效應?IS可以正反方向插入到DNA（宿主、質粒或某些噬菌53a)Tn/TnAfamily

l具有IR、轉座酶基因、調(diào)節(jié)基因（解離酶）、抗抗生素基因

l

Tn1(AmpR)Tn2(AmpR)Tn3(AmpR)Tn4(AmpRStrR)Tn5(KanR)Tn6(kanR)Tn7(StrRTmpR)Tn9(CamR)Tn10(TetR)

2.5kb20kb

Tn3IRTnpAResTnpRAmpRIR38bp38bp轉座酶

regulatorβ-內(nèi)酰胺酶

2、復合轉座子?兩種類型a)Tn/TnAfamilyl具有IR、轉54b）兩端重復序列為IS的復合轉座子

e.g.

IS插入到功能基因兩端，可能形成復合轉座因子ISISISISLISR臂中心區(qū)臂transpositionb）兩端重復序列為IS的復合轉座子e.g.IS插55?當兩個IS組件相同時，其中任一個都可行使轉座功能?不同時，主要依靠一個?兩側的IS既可以是IR，又可以是DR狀態(tài)（IR多）?當兩個IS組件相同時，其中任一個都可行使轉座功能?563轉座噬菌體Muphage

（巨型轉座子）

C

repressorforA,BB33kd與轉座有關A70kd轉座酶U,S

毒性蛋白attL,attR

與寄主同源，反向重復，轉座必需GinG區(qū)倒位酶attLCABSUattR150bp1.5kb

G倒位區(qū)38kbPgin?以E.coli為寄主的溫和型噬菌體（溶源、裂解）3轉座噬菌體Muphage（巨型轉座子）C57?Mu的插入途徑a）侵入的Mu在溶源化過程中任意插入寄主DNA

（兩側各5bp的靶位點序列重復）b）進入裂解生長后，復制產(chǎn)生后代MuDNA幾乎全部插入寄主

DNA中，并可繼續(xù)轉座（形成寄主DNA和Mu的共合體），噬菌體成熟時，切段共合體包裝?Mu的插入途徑a）侵入的Mu在溶源化過程中任意插58三、轉座子的轉作機制及模式?三種類型：復制型、非復制型和保守型1、復制型轉座模式?實質：轉座子元件被復制并被移動到受體位點，最終轉座過程擴增了轉座子的拷貝（供、受點）?需兩種酶：轉作酶（作用于原拷貝兩末端）解離酶（作用于復制后的拷貝）?模式：三、轉座子的轉作機制及模式?三種類型：復制型、非復制型59?兩大步a)共合體形成切口－連接－復制?兩大步a)共合體形成60b)拆分

靶位點的DR形成b)拆分靶位點的DR形成612、非復制型轉座模式?供體上最終產(chǎn)生雙鏈斷裂?供體位點如不能被修復則有致死效應2、非復制型轉座模式?供體上最終產(chǎn)生雙鏈斷裂?供62五、轉座子的某些遺傳學效應－－P157轉座可以導致基因變異插入操縱子位置可以影響操縱子下游基因表達應用：難以篩選的基因轉移基因定位標記篩選插入突變構建特殊菌株克隆難以進行表型鑒定的基因五、轉座子的某些遺傳學效應－－P157637.3.6真核生物的轉座成分P152自學7.3.6真核生物的轉座成分P152自學64

真核生物的轉座成分根據(jù)轉座機制目前分為兩類：a)

轉座機制與細菌的轉座子類似需要轉座酶、兩端的IR,轉座靶點序列隨機，遺傳信息：DNA→DNA轉座酶、轉座因子兩端的IR序列，?玉米的Ac-Ds元件、果蠅的P元件和FB元件等b)

轉作機制類似逆轉錄病毒真核生物特有的轉座機制（逆轉錄轉座）遺傳信息：DNA→RNA→DNA逆轉錄子轉錄成RNA,然后反轉錄成DNA,插入基因組，類似于逆轉錄病毒的作用?如：逆轉錄病毒、果蠅的copia元件、酵母的Ty元件逆轉錄酶和整合酶，P208逆轉錄酶生物學意義：影響其他基因表達，介導基因重排，促進基因的流動真核生物的轉座成分根據(jù)轉座機制目前分為兩類：a)65第二節(jié)

重組DNA技術DNARecombinationTechnique第二節(jié)

重組DNA技術DNARecombinat66重組DNA技術的發(fā)展史年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉化實驗1973年美國斯坦福大學的科學家構建第一個重組DNA分子1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應用重組DNA技術制造醫(yī)學上重要的藥物。1980年開始建造第一家應用重組DNA技術生產(chǎn)胰島素的工廠1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉重組DNA技術的發(fā)展史年G.J.Mendel的豌豆雜交試67一、相關概念DNA克隆工具酶目的基因基因載體二、基本原理及操作步驟本節(jié)主要內(nèi)容一、相關概念本節(jié)主要內(nèi)容68一、重組DNA技術相關概念克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆一、重組DNA技術相關概念克隆(cl69DNA克隆應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質與載體DNA接合成一具有自我復制能力的DNA分子——復制子(replicon)，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)。DNA克隆70生物技術工程:

基因工程、蛋白質工程、酶工程、細胞工程等。目的①分離獲得某一目的基因或DNA②獲得目的基因的表達產(chǎn)物（蛋白質）基因工程(geneticengineering)

——實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關的工作，又稱重組DNA技術。生物技術工程:基因工程、蛋白質工程、酶工程、細胞工程等。71（二）工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉移酶

TaqDNA聚合酶（二）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶72重組DNA技術中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶在3′羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基重組DNA技術中常用的工具酶工具酶功73限制性核酸內(nèi)切酶

(restrictionendonuclease)識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類核酸內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendo74作用：與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA。分類：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類（基因工程技術中常用的是Ⅱ類）作用：分類：75第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；命名：HindⅢ76Ⅱ類酶識別序列特點：

——

回文結構(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGⅡ類酶識別序列特點：切口：平端切口、粘端切口GGATCC77BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC78有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生79（三）目的基因cDNA(complementaryDNA)基因組DNA(genomicDNA)（三）目的基因cDNA(complementaryDN80（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質所采用的一些DNA分子。常用載體質粒DNA噬菌體DNA病毒DNA（四）基因載體定義常用載體81克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體?？寺≥d體(cloningvector)82載體的選擇標準能自主復制；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。載體的選擇標準能自主復制；831.質粒

(plasmid)特點:

能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。1.質粒(plasmid)特點:細菌染色體外的小型84第六章DNA重組與克隆(陜西師范大學)final課件85λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克隆）EMBL系列（置換型，適用基因組克?。?.噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)2.噬菌體(phage)M13噬86

MultipleCloningSites

873.柯斯質粒(cosmid)pJB8的物理圖譜3.柯斯質粒(cosmid)pJB8的物理圖譜88酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)動物病毒DNA改造的載體腺病毒載體逆轉錄病毒載體桿狀病毒載體其他酵母人工染色體其他89二、重組DNA技術基本原理目的基因的獲取重組DNA導入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構建重組體的篩選克隆基因的表達

二、重組DNA技術基本原理目的基因的獲取重組DNA導入受體菌90

以質粒為載體的DNA

克隆過程以91（一）目的基因的獲取1.化學合成法已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)

（一）目的基因的獲取1.化學合成法921.化學合成法由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列1.化學合成法由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列93組織或細胞染色體DNA基因片段克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉化菌限制性內(nèi)切酶受體菌存在于轉化細菌內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合2.基因組DNA文庫組織或細胞染色體DNA基因片段克隆載體重組DNA分子含重組分94限制酶切位點限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫限制酶切位點限制酶消化除去中間片段cosLRcosc95mRNA

cDNA

雙鏈cDNA

重組DNA分子

cDNA文庫

反轉錄酶載體受體菌復制3.

cDNA文庫逆轉錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTTmRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子96

是一種在體外利用酶促反應大量獲得特異序列的基因組DNA或cDNA的專門技術，又稱為無細胞的分子克隆。4.聚合酶鏈反應（PCR）是一種在體外利用酶促反應大量獲得特異序列的基因組DNA或97模板DNA引物4種dNTPTaqDNA聚合酶含Mg2+的緩沖液。PCR的反應體系

模板DNAPCR的反應體系98（1）變性，加熱至95℃，使模板DNA解開成單鏈；（2）退火，溫度降至適宜，使引物與模板互補結合；（3）延伸，溫度升至72℃，DNA聚合酶以4種dNTP為底物，在引物的3’-OH上，合成與模板互補的DNA新鏈。PCR的基本反應步驟及原理

（1）變性，加熱至95℃，使模板DNA解開成單鏈；PCR的99

PCR反應條件

變性95?C延伸72?C退火Tm-5?CPCR反應條件變性延伸退火100

PCR反應的基本原理PCR反應的基本原理101（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接（二）克隆載體的選擇和構建（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接（二）克隆載體的102BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接BamHⅠ切割反應GGATCCT4DNA連接酶GATC103不同限制酶切位點的連接EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。不同限制酶切位點的連接EcoRⅠ切割位點BglⅡ切割位點1042.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端2.平端連接105目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶重組體1063.同聚物加尾連接在末端轉移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。3.同聚物加尾連接1075′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′

3′5′

5′3′T(T)nTT(T)nT3′5′5′

3′

3′5′

5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉移酶+dATP末端轉移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′3′載體DNA5′3′目的基因限制酶或機械剪切限制酶1084.人工接頭(linker)連接由平端加上帶有新的酶切位點的接頭，再用限制性酶切產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。4.人工接頭(linker)連接109EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ人工接頭及其應用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ人工接頭及其應用CCGA110受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導入方式轉化(transformation)轉染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導入受體菌受體菌條件導入方式（四）重組DNA導入受體菌111（五）重組體的篩選

1.直接選擇法

(1)抗藥性標記選擇

(2)標志補救(markerrescue)

(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡

2.免疫學方法如免疫化學方法及酶免檢測分析等（五）重組體的篩選112(插入失活法)抗藥性標記選擇(插入失活法)113組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進組氨酸合成λDNA重組體標志補救組氨酸缺陷無組氨酸酵母咪唑甘油磷促進組氨酸合成λDNA重組體114

α

互補的檢測α互補的檢測115原位雜交原位雜交116Southern印跡Southern印跡117雞的β肌球蛋白的克隆和檢出雞的β肌球蛋白的克隆和檢出118重組DNA技術操作過程可形象歸納為小結分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉轉入受體菌篩篩選重組體重組DNA技術操作過程可形象歸納為小結分分離目的基119重組DNA技術操作的主要步驟載體質粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉化體外包裝，轉染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交重組DNA技術操作的主要步驟載體質粒噬菌體病毒目的基因（外源120表達體系的建立表達載體的構建受體細胞的建立表達產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達表達體系的建立（六）克隆基因的表達1211.原核表達體系（E.coli表達體系最為常用）標準：選擇標志 強啟動子翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點E.coli表達體系的不足

不宜表達真核基因組DNA不能加工表達的真核蛋白質表達的蛋白質常形成不溶性包涵體(inclusionbody)

很難表達大量可溶性蛋白1.原核表達體系（E.coli表達體系最為常用）122優(yōu)點：可表達克隆的cDNA及真核基因組DNA可適當修飾表達的蛋白質表達產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點：操作技術難、費時、費錢轉染

——將表達載體導入真核細胞的過程方法：磷酸鈣轉染DEAE葡聚糖介導轉染電穿孔脂質體轉染顯微注射2.真核表達體系

酵母、昆蟲、哺乳類動物細胞優(yōu)點：可表達克隆的cDNA及真核基因組DNA轉染——將表123表達載體pFASTBACI的物理圖譜表達載體pFASTBACI的物理圖譜124第六章DNA重組與克隆(陜西師范大學)final課件125（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質，而認識疾病的分子機制。三、重組技術與醫(yī)學的關系（二）生物制藥（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆三、重組技術與醫(yī)學的關系（二）生物126

重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進凝血顆粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子剌激白細胞生成促紅細胞生成素剌激白細胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結合特異性進行診斷試驗、腫瘤導向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預防霍亂重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激127基因診斷(geneticdiagnosis)是利用分子生物學及分子遺傳的技術和原理，在DNA水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變。（三）基因診斷基本過程區(qū)分或鑒定DNA的異常分離、擴增待測的DNA片斷基因診斷(geneticdiagnosis)是利用分子生物128標準.能正確擴增靶基因；.能準確區(qū)分單個堿基的差別；.本底或噪聲低，不干擾DNA的鑒定;.便于完全自動化操作，適合大面積、大人群普查。標準129（四）基因治療定義基因治療(genetherapy)是向有功能缺陷的細胞補充相應功能的基因，以糾正或補償其基因的缺陷，從而達到治療的目的。方式體細胞基因治療(somaticcellgenetherapy)性細胞基因治療(germlinegenetherapy)（四）基因治療定義方式1301.產(chǎn)前診斷2.攜帶者測試3.癥候前診斷4.遺傳病易感性（五）遺傳疾病的預防1.產(chǎn)前診斷（五）遺傳疾病的預防131

復習思考題：

1.概念： （1）克隆 （2）轉化 （3）轉位 （4）基因工程 （5）轉座 （6）限制性核酸內(nèi)切酶 （7）載體 （8）G文庫 （9）質粒 （10）c文庫

2.簡述基因工程的基本過程。

3.簡述目的基因的主要來源或途徑。

132DNA克隆及相關的基因操作技術及其應用在后續(xù)章節(jié)專門講授DNA克隆及相關的基因操作技術及其應用在后續(xù)章節(jié)專門講授1331、Geniusonlymeanshard-workingallone'slife.(Mendeleyer,RussianChemist)

天才只意味著終身不懈的努力。20.8.58.5.202011:0311:03:10Aug-2011:032、Ourdestinyoffersnotonlythecupofdespair,butthechaliceofopportunity.(RichardNixon,AmericanPresident)命運給予我們的不是失望之酒，而是機會之杯。二〇二〇年八月五日2020年8月5日星期三3、Patienceisbitter,butitsfruitissweet.(JeanJacquesRousseau,Frenchthinker)忍耐是痛苦的，但它的果實是甜蜜的。11:038.5.202011:038.5.202011:0311:03:108.5.202011:038.5.20204、Allthatyoudo,dowithyourmight;thingsdonebyhalvesareneverdoneright.----R.H.Stoddard,Americanpoet做一切事都應盡力而為，半途而廢永遠不行8.5.20208.5.202011:0311:0311:03:1011:03:105、Youhavetobelieveinyourself.That'sthesecretofsuccess.----CharlesChaplin人必須相信自己，這是成功的秘訣。-Wednesday,August5,2020August20Wednesday,August5,20208/5/20206、Almostanysituation---goodorbad---isaffectedbytheattitudewebringto.----LuciusAnnausSeneca差不多任何一種處境---無論是好是壞---都受到我們對待處境態(tài)度的影響。11時3分11時3分5-Aug-208.5.20207、Althoughtheworldisfullofsuffering,itisfullalsooftheovercomingofit.----HellenKeller,Americanwriter雖然世界多苦難，但是苦難總是能戰(zhàn)勝的。20.8.520.8.520.8.5。2020年8月5日星期三二〇二〇年八月五日8、Formanismanandmasterofhisfate.----Tennyson人就是人，是自己命運的主人11:0311:03:108.5.2020Wednesday,August5,20209、Whensuccesscomesinthedoor,itseems,loveoftengoesoutthewindow.-----JoyceBrothers成功來到門前時，愛情往往就走出了窗外。11:038.5.202011:038.5.202011:0311:03:108.5.202011:038.5.202010、Lifeismeasuredbythoughtandaction,notbytime.——Lubbock衡量生命的尺度是思想和行為，而不是時間。8.5.20208.5.202011:0311:0311:03:1011:03:1011、Tomakealastingmarriagewehavetoovercomeself-centeredness.要使婚姻長久，就需克服自我中心意識。Wednesday,August5,2020August20Wednesday,August5,20208/5/202012、Treatotherpeopleasyouhopetheywilltreatyou.你希望別人如何對待你，你就如何對待別人。11時3分11時3分5-Aug-208.5.202013、Todowhateverneedstobedoneto

preservethislastandgreatestbastionof

freedom.(RonaldReagan,AmericanPresident)為了保住這最后的、最偉大的自由堡壘，我們必須盡我們所能。20.8.520.8.5Wednesday,August5,202014、Wherethereisawill,thereisaway.(ThomasEdison,Americaninventor)有志者，事竟成。11:01:1911:01:1911:018/5/202011:01:19AM15、

Everymanisthemasterofhisownfortune.----RichardSteele每個人都主宰自己的命運。20.8.511:01:1911:01Aug-205-Aug-2016、Asselfishnessandcomplaintcloudthemind,solovewithitsjoyclearsandsharpensthevision.----HelenKeller自私和抱怨是心靈的陰暗，愉快的愛則使視野明朗開闊。11:01:1911:01:1911:01Wednesday,August5,202017、Donot,foronerepulse,giveupthepurposethatyouresolvedtoeffect.----WillianShakespeare,Britishdramatist不要只因一次失敗，就放棄你原來決心想達到的目的。20.8.520.8.511:01:1911:01:19August5,202018、Thereisnoabsolutesuccessintheworld,onlyconstantprogress.世界上的事沒有絕對成功，只有不斷的進步。2020年8月5日星期三上午11時1分19秒11:01:1920.8.519、Nothingismorefataltohappinessthantheremembranceofhappiness.

沒有什么比回憶幸福更令人痛苦的了。2020年8月上午11時1分20.8.511:01August5,202020、Nomanishappywhodoesnotthinkhimselfso.——PubliliusSyrus認為自己不幸福的人就不會幸福。2020年8月5日星期三11時1分19秒11:01:195August202021、Theemperortreatstalentastools,usingtheirstrongpointtohisadvantage.

君子用人如器，各取所長。上午11時1分19秒上午11時1分11:01:1920.8.5謝謝觀看THEEND1、Geniusonlymeanshard-worki134

基因重組與基因工程GeneticRecombinationandGene

cloning

第六章基因重組與基因工程第六章135DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合稱遺傳重組或或基因重排。重組產(chǎn)物稱為重組體。基因重組主要發(fā)生在減數(shù)分裂時同源染色體之間的交換。（形式多樣）重組與進化關系密切，增加群體的遺傳多樣性，利于突變的優(yōu)化組合。DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合稱遺傳重組或或基因136DNA重組接合作用(conjugation)轉化作用(transformation)轉導作用

(transduction)#轉座

(transposition)#同源重組

(homologousrecombination)#位點特異的重組(site-specificrecombination)異常重組DNA重組接合作用(conjugation)轉化作用(t137發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機制的Holliday模型。6.1、同源重組發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousr138Holliday模型中，同源重組主要4個關鍵步驟①兩個同源染色體DNA排列整齊②一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接，形成Holliday中間體③通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA（立體異構）④Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)Holliday模型中，同源重組主要4個關鍵步驟①兩個同源139片段重組體

：切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側來自同一親本DNA。拼接重組體：切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側來自不同親本DNA。

5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′片段重組體：拼接重組體：5′5′5′5′3′3′3′3′140

內(nèi)切酶

(recBCD)DNA侵擾(recA)分支遷移

(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′目錄內(nèi)切酶DNA侵擾分支遷移內(nèi)切酶DNA5′3′141片段重組體（見模型圖左邊產(chǎn)物）：

切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側來自同一親本DNA。拼接重組體（見模型圖右邊產(chǎn)物）：切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側來自不同親本DNA。片段重組體（見模型圖左邊產(chǎn)物）：拼接重組體（見模型圖右邊1425′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′143Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體目錄Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′144分支移動的過程伴隨著DNA的修復分支移動的過程伴隨著DNA的修復145同源重組是減數(shù)分裂的原因。同源重組是由于堿基間的精確配對實現(xiàn)的同源重組是減數(shù)分裂的原因。146異源雙鏈與基因交換同源重組時會產(chǎn)生異源雙鏈，從而發(fā)生基因交換。減數(shù)分裂后分離：（對異源雙鏈區(qū)內(nèi)不配對堿基的修復而進行的基因校正過程稱作基因轉換）基因轉換頻率在非對稱異源雙鏈區(qū)較高?；蜣D換也可以在有絲分裂時姐妹染色體的等位基因間、有絲分裂與減數(shù)分裂時同一條染色單體上非等位重復基因之間發(fā)生異源雙鏈與基因交換同源重組時會產(chǎn)生異源雙鏈，從而發(fā)生基因交換147Holliday模型提出了同源重組的基本模式，但對于基因重組具體細節(jié)，異源雙鏈的形成細節(jié)不清楚。在Holliday基礎上提出了單鏈斷裂模型和雙鏈斷裂模型，兩個模型的區(qū)別在于解釋重組期間DNA的修復的具體過程不一樣。有供體受體之分。（受體：發(fā)生鏈斷裂的分子P138-139）Holliday模型提出了同源重組的基本模式，但對于基因重148細菌的基因轉移與重組低等生物也可以以轉化、轉導、結合等多種方式實現(xiàn)細胞間的基因轉移。具體方式：接合、轉化、轉導、細胞融合。外源基因的命運：降解、暫時保留、與內(nèi)源基因置換、整合。細菌的基因轉移與重組低等生物也可以以轉化、轉導、結合等多種方149

一、接合作用（conjugation)

當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接 觸時，質粒DNA從一個細胞（細菌）轉移至 另一細胞（細菌）的DNA轉移稱為接合作用。

150

F因子編碼表面排斥蛋白、切口酶、解螺旋酶、DNA轉移通道蛋白等、F因子編碼表面排斥蛋白、切口酶、解螺旋酶、DNA轉移通151

F因子可以與細菌染色體發(fā)生交叉連接而重組整合入細菌染色體F因子可以與細菌染色體發(fā)生交叉連接而重組整合入細菌染色152

二、轉化作用（transformation)

通過自動獲取或人為地供給外源DNA， 使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型。感受態(tài)細胞高濃度鈣可以誘導感受態(tài)感受態(tài)細胞高濃度鈣可以誘導感受態(tài)153例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。154

三、轉導作用（transduction)

當病毒從被感染的細胞（供體） 釋放出來，再次感染另一細胞（受體） 時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間 的DNA轉移及基因重組。

155溶菌感染重組感染細菌噬菌體圖15-3轉導作用轉導：通過病毒介導發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移及基因重組溶菌感染重組感染細菌噬菌體圖15-3轉156轉導：當病毒從被感染的供體細胞釋放出來，再次感染另一受體細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移及基因重組即為轉導作用轉導(transduction)轉導：當病毒從被感染的供體細胞釋放出來，再次感染另一受體細胞157*轉染(transfection)轉染是轉化的一種特殊形式。由transformation（轉化）和infection（感染）兩詞構成。原指將噬菌體、病毒或以其為載體構建的重組子導入受體細胞的過程。通過感染方式將外來DNA引入宿主細胞，并導致宿主細胞遺傳性狀改變的過程稱為轉染。將任何類型DNA轉移至動物細胞內(nèi)的過程均可叫轉染。*轉染(transfection)轉染是轉化的一種特殊形式。158細菌的細胞融合由于細胞質膜融合導致的基因轉移和重組。（原生質體融合）細菌的細胞融合由于細胞質膜融合導致的基因轉移和重組。159細菌的同源重組的酶學機制1、RecBCD（外切核酸酶Ⅴ）和Chi位點具有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、核酸外切酶活性、

序列特異性的單鏈內(nèi)切酶活性單鏈內(nèi)切酶活性和解旋酶活性使DNA產(chǎn)生具有游離末端的單鏈－－－RecA的作用位點RecBCD有固定切割位點原核生物的重組酶學機制已經(jīng)比較清楚Chi位點出現(xiàn)幾率很高，是RecBCD的靶位點GCTGGTGG細菌的同源重組的酶學機制1、RecBCD（外切核酸酶Ⅴ）和1603‘?RecBCD的識別和切割位點a、RecBCD結合在DNA的平頭末端（產(chǎn)生機制不清楚）b、外切、解鏈、移動（ATP）c、兔耳狀l