藥物蛋白糖基化修飾+課件

藥物蛋白糖基化修飾目錄蛋白類藥物的市場前景糖基化的作用糖蛋白藥物的表達(dá)系統(tǒng)藥物蛋白糖基化的展望蛋白類藥物的市場前景1982年美國Likky公司首先將重組胰島素投放市場，標(biāo)志著第一個重組蛋白質(zhì)藥物的誕生。幾十年來，蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展。全球生物技術(shù)公司總數(shù)已近5000家，上市公司有600余家，銷售總額近400億美元，其中蛋白質(zhì)藥物占總銷售額的70%。從整個產(chǎn)業(yè)的分布情況看，主要集中在歐美，占全球總數(shù)的85%，歐美公司的銷售額占全球生物技術(shù)公司銷售額的97%。目前已批準(zhǔn)近150個蛋白質(zhì)藥物上市，適應(yīng)癥達(dá)220種，使3.25億患者受益.更重要的是目前還有近400種蛋白質(zhì)藥物處于臨床研究階段，約3000種處于臨床前研究階段；預(yù)計到2025年，美國生物技術(shù)市場總額將達(dá)到2萬億美元。1.在糖蛋白藥物代謝動力學(xué)上的作用藥物代謝動力學(xué)很大程度上決定了蛋白質(zhì)藥物的藥效。蛋白質(zhì)的半衰期受許多因素如分子量大小和凈電荷的影響,兩者又受到聚糖結(jié)構(gòu)組成的影響。特別是,唾液酸含量影響凈負(fù)電荷從而改善了糖蛋白藥物(如促紅細(xì)胞生成素EPO)的代謝動力學(xué),糖基化對穩(wěn)定EPO的體內(nèi)活性具有重要作用,若缺乏糖鏈,則EPO在體內(nèi)迅速被水解而失活

。2.聚糖對組織靶向的作用不同的組織對不同的糖基的親和力也是不同的。因此蛋白質(zhì)藥物帶有不同的氮偶聯(lián)聚糖,可以特異性的靶向細(xì)胞或組織。例如：在肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的唾液酸糖蛋白受體可以與含有末端半乳糖或氮乙酰半乳糖胺的糖蛋白結(jié)合。因此,肝受體可以用于完成組織特異性蛋白質(zhì)靶向。3.聚糖在調(diào)節(jié)生物活性上的作用氮偶聯(lián)糖基化通過調(diào)節(jié)和特定受體的相互作用可以影響一些糖蛋白藥物的療效。例如,免疫球蛋白重鏈含有一個單一的氮偶聯(lián)糖基化位點(diǎn),從而導(dǎo)致每個抗體結(jié)合兩個氮聚糖。這個糖基化對于糖蛋白和Fc受體的有效相互作用以及Fc受體介導(dǎo)的效應(yīng)子作用(包括抗體依賴性細(xì)胞毒性ADCC和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性CDC)都是十分重要的。糖基化IgG1大大削弱了ADCC和CDC，可以通過改變氮聚糖的組成來調(diào)節(jié)IgG介導(dǎo)的ADCC。糖蛋白藥物的表達(dá)系統(tǒng)巴氏畢赤酵母巴氏畢赤酵母是最近迅速發(fā)展起來的一種表達(dá)宿主。它以甲醇作為唯一的能源和碳源,應(yīng)用巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因具有以下優(yōu)點(diǎn):1.表達(dá)載體含有特有的乙醇氧化酶(AOX)基因啟動子,通過甲醇誘導(dǎo)AOX1調(diào)控外源基因的表達(dá);2.可以高密度連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng),外源蛋白表達(dá)量高;3.根據(jù)載體類型,外源基因表達(dá)產(chǎn)物既可以在胞內(nèi)積聚又可以被分泌到培養(yǎng)基中,而分泌的外源蛋白占酵母細(xì)胞分泌蛋白的量大,利于工業(yè)生產(chǎn)和分離純化;4.巴氏畢赤酵母能對所分泌的蛋白進(jìn)行N、O糖基化修飾且糖基化程度適中。豬γ干擾素在畢赤酵母中的表達(dá)CHO細(xì)胞系有以下優(yōu)點(diǎn):

1.與這一系統(tǒng)有關(guān)的專門技術(shù)比較成熟;2.過程可以控制;3.表達(dá)的蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然蛋白分子。CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)也有一些不足:

1.成本高;

2.有污染病毒等有害物質(zhì)的可能;

3.不能充分控制氮糖基化。

CHO表達(dá)載體系統(tǒng)

a.啟動子和增強(qiáng)子(P/E);b.內(nèi)含子(INS);c.多克隆位點(diǎn)(MCS);d.多聚腺苷酸加尾信號(pA);e.選擇標(biāo)記基因,如共擴(kuò)增基因二氫葉酸還原酶(DHFR);f.復(fù)制起始區(qū)(ori)和抗性基因(如Ap)組成的載體骨架CHOcellexpressionvector優(yōu)化表達(dá)載體系統(tǒng)的真核調(diào)控元件選擇強(qiáng)啟動子研究表明:EF1-A啟動子是迄今最強(qiáng)的啟動子之一選擇高效多聚腺苷酸加尾信號(pA)研究表明:除去pA后,外源蛋白表達(dá)量降低90%；內(nèi)含子序列研究表明:表達(dá)載體中引入天然或人工合成的內(nèi)含子序列有利于引導(dǎo)外源蛋白前體mRNA的穩(wěn)定性從而增加翻譯效率,提高蛋白質(zhì)的表達(dá)；內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(IRES)研究表明:用IRES構(gòu)建多個順反子表達(dá)載體,可以表達(dá)多亞基蛋白；Polycistronicexpressionvector運(yùn)用共擴(kuò)增基因做選擇標(biāo)記在CHO細(xì)胞表達(dá)載體中有兩類選擇標(biāo)記.一類是非擴(kuò)增基因,這種選擇標(biāo)記對目的基因的拷貝數(shù)沒有影響,主要用于構(gòu)建瞬時表達(dá)載體如NEO(新霉素的抗藥基因)；另一類選擇標(biāo)記具有擴(kuò)增基因的功能,也稱共擴(kuò)增基因，如二氫葉酸還原酶(DHFR)、谷氨酰氨合成酶(GS)等。當(dāng)攜帶共擴(kuò)增基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后,隨著培養(yǎng)基中選擇性藥物濃度的逐漸增加,共擴(kuò)增基因的拷貝數(shù)不斷增加;同時,其側(cè)翼的DNA片段也會相應(yīng)得到擴(kuò)增,使目的基因的拷貝數(shù)增加幾百到幾千倍，從而達(dá)到外源基因的高效表達(dá)。弱化選擇標(biāo)記基因的表達(dá)一種雙順反子載體將選擇基因通過一段寡聚核苷酸連在目的基因的3’端,前體mRNA在翻譯時,位于目的基因3’端下游的共擴(kuò)增基因的翻譯起始的效率大大降低另一種載體則將共擴(kuò)增基因插入到人工合成的內(nèi)含子內(nèi)部,位于剪切的供體(SD)與分支點(diǎn)(BP)之間,目的基因緊接在內(nèi)含子的下游。因DHFR（二氫葉酸還原酶）基因位于內(nèi)含子內(nèi)部,前體mRNA在剪切時,95%的共擴(kuò)增基因的mRNA被剪切掉。重組人促紅細(xì)胞生成素是一種糖蛋白，糖鏈的存在對于EPO合成后的分泌及其體內(nèi)外生物活性均具有重要意義。唾液酸是糖鏈的重要組成成分，是維持EPO體內(nèi)生物效應(yīng)所必需的。為了獲得分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性與天然EPO相似的rhEPO，選用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系，如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、非洲綠猴腎細(xì)胞COS7表達(dá)系統(tǒng)、幼倉鼠腎（BHK）細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。目前主要用CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)用來表達(dá)生產(chǎn)rhEPO。因?yàn)镃HO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能準(zhǔn)確進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后重組蛋白的加工修飾，表達(dá)的糖基化蛋白在分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性方面與天然蛋白十分接近。

重組人促紅細(xì)胞生成素（rhEPO）藥物蛋白糖基化研究展望在分子水平上的蛋白質(zhì)糖基化的研究的主要挑戰(zhàn)是由于目前使用的真核表達(dá)系統(tǒng)的聚糖的非均質(zhì)性，有學(xué)者正在利用大腸桿菌產(chǎn)生的均質(zhì)糖蛋