核酸提取經(jīng)驗及原理課件

核酸提取經(jīng)驗及原理總結

主辦單位：螺旋網(wǎng)主講人：wsuquan時間：2008.4.21主要內(nèi)容一、核酸的發(fā)現(xiàn)、核酸的分類和功能、核酸的理化性質(zhì)二、細胞裂解三、核酸提取四、核酸純化五、核酸檢測六、核酸除雜質(zhì)

核酸的發(fā)現(xiàn)核酸是1869年米歇爾(F.Miescher)在膿液的白細胞中發(fā)現(xiàn)的，他當時稱之為核素。阿爾特曼(R.Altmann)于1889年認識其酸性后，定名為核酸。核酸分為核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)兩大類。核糖核酸（RNA）RNA主要是負責DNA遺傳信息的翻譯和表達，分子量要比DNA小得多。RNA為單鏈分子，根據(jù)RNA的功能，可以分為三種：信使核糖核酸（mRNA）；轉(zhuǎn)運核糖核酸（tRNA）；核蛋白體核糖核酸（rRNA）。核酸的理化性質(zhì)RNA的純品都呈白色粉末或結晶，DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離核酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達40g/L，DNA鈉鹽在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。細胞裂解裂解原理細胞的裂解方法裂解方法的評價樣品與裂解液的比例細胞裂解-裂解原理經(jīng)典的裂解液幾乎都含有去污劑和鹽。鹽的作用，除了提供一個合適的裂解環(huán)境，還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞、維持核酸結構的穩(wěn)定等。去污劑則是通過使蛋白質(zhì)變性，破壞膜結構及解開與核酸相連接的蛋白質(zhì)，從而實現(xiàn)核酸游離在裂解體系中。裂解體系中還可能加入蛋白酶，利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進核酸與蛋白質(zhì)的分開，同時，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。細胞裂解-裂解方法的評價含蛋白酶的裂解方法，可以認為是抽提基因組DNA的首選。高濃度蛋白質(zhì)變性劑(如GIT、GuHCl等)的裂解方法，是抽提RNA的首選。含CTAB的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細菌、植物的基因組DNA抽提的首選裂解方法。SDS堿裂解法是質(zhì)粒抽提的首選裂解方法，具有快速、得率高、幾乎無基因組DNA污染的特點。核酸提取提取是使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程。RNA提取總RNA的試劑盒快速提取

蛋白酶－熱酚法氯化鋰法提取總RNA核酸純化-方法經(jīng)典的使用苯酚/氯仿抽提的純化技術使用離子交換介質(zhì)的純化技術密度梯度離心法使用吸附介質(zhì)的純化技術核酸純化-純化方法評價針對不同的用途，選擇不同的純化方法，任何一種方法他都有其優(yōu)缺點，在試驗中，沒有錯誤的方法，只是選擇的方法不正確。核酸純化-醇的沉淀沉淀的原理目的沉淀劑的選擇沉淀溫度的選擇核酸純化-醇的沉淀-目的目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來，從而實現(xiàn)核酸與其它雜質(zhì)–主要是鹽的分離。核酸純化-醇的沉淀-溫度如果核酸抽提的起始樣品是雜質(zhì)比較多時，原則上不要使用低溫沉淀。低溫沉淀能提高沉淀效率：當核酸濃度很低時，效果明顯；當核酸濃度比較高時，效果不明顯，但卻會導致雜質(zhì)的大大增加。核酸純化-核酸的洗滌洗滌目的方法首先一定要將沉淀懸浮起來；第二就是要控制一定的時間，尤其是當核酸沉淀比較大時(使核酸沉淀最終蓬松)；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。核酸純化-核酸保存核酸在保存中的穩(wěn)定性，與溫度成反比，與濃度成正比。一般的我們選擇，-20℃或70℃保存的穩(wěn)定。如果溫度不合適，保存中核酸發(fā)生降解或者消失，首要原因是酶殘留導致的酶解，第二個原因則是保存核酸溶液的pH值不合適導致的水解。還有一個不為人重視的，就是EP管對核酸的影響。核酸純化-核酸的濃縮應用最廣的核酸濃縮法是乙醇沉淀法。在中等濃度單價陽離子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可經(jīng)離心而回收，甚至對低至pg量的DNA或RNA，也可定量回收。回收的核酸可按所需濃度，再溶于適當?shù)木彌_液中。關于紫外分光光度儀的檢測在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具有獨特的紫外線吸收光譜，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作為核酸及其組份定性和定量測定的依據(jù)。關于電泳檢測觀察瓊脂凝膠中DNA的最簡單方法是利用熒光染料溴化乙錠進行染色。該物質(zhì)含有一個可以嵌入DNA的堆積堿基之間的一個平面基團，這個基團的固定位置及其與堿基的密切接近，導致染料與DNA結合并呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離染料溶液有所增加。核酸中雜質(zhì)的去除肝糖元、淀粉及粘多糖蛋白質(zhì)的除去不同類型核酸的分離同類核酸的分離核酸中除雜質(zhì)-蛋白質(zhì)的除去①加入去污劑如硫酸十二脂鈉，從提取到分離純化各階段均可反復使用此法。去污劑與氯仿法或苯酚法結合使用，效果更加理想。②氯仿-戊醇或辛醇對提取液搖蕩抽提，蛋白質(zhì)在氯仿-水界面形成凝膠，離心后除去，核酸留在水溶液中。此法在分離純化中也常反復使用。③苯酚水溶液抽提，在對氨基水楊酸等陰離子化合物存在下，DNA或RNA都可以進入水相，蛋白質(zhì)則沉淀于酚層，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA，殘余的酚可用葡聚糖凝膠G-10或G-25除去。核酸中除雜質(zhì)-不同類型核酸的分離在RNA制品中除去DNA，苯酚水溶液抽提是較有效和常用的方法。在DNA中加核糖核酸酸酶選擇地破壞RNA，是