離子交換層析法課件

離子交換層析法一、原理：

離子交換層析法（ionexchangechromatography）,簡稱IEC,是從復(fù)雜的混合物中，分離性質(zhì)相似大分子的方法之一，依據(jù)的原理是物質(zhì)的酸堿性、極性，也就是所帶陰陽離子的不同。電荷不同的物質(zhì)，對管柱上的離子交換劑有不同的親和力，改變沖洗液的離子強度和pH值，物質(zhì)就能依次從層析柱中分離出來。離子交換樹脂的交換反應(yīng)是可逆的，遵循化學(xué)平衡的規(guī)律，定量的混合物通過管柱時，離子不斷被交換，濃度逐漸降低，幾乎全部都能被吸附在樹脂上；在沖洗的過程中，由于連續(xù)添加新的交換溶液，所以會朝正反應(yīng)方向移動，因而可以把樹脂上的離子沖洗下來。如果被純化的物質(zhì)是氨基酸類的分子，則分子上的凈電荷取決于氨基酸的等電點和溶液的pH值，所以當(dāng)溶液的pH值較低，氨基酸分子帶正電荷，它將結(jié)合到強酸性的陽離子交換樹脂上；隨著通過的緩沖液pH逐漸增加，氨基酸將逐漸失去正電荷，結(jié)合力減弱，最后被洗下來。由于不同的氨基酸等電點不同，這些氨基酸將依次被洗出：

最先被洗出的是酸性氨基酸，如aparticacid和glutamicacid（在約pH3~4時），隨后是中性氨基酸，如glycine和alanine。堿性氨基酸如arginine和lysine在pH值很高的緩沖液中仍帶有正電荷，因此這些在約pH值高達10~11時才出現(xiàn)。二、反應(yīng)機理

它大致分為五個步驟：1.離子擴散到樹脂表面。

2.離子通過樹脂擴散到交換位置。

3.在交換位置進行離子交換；被交換的分子所帶電荷愈多，它與樹脂的結(jié)合愈緊密，也就愈不容易被其它離子取代。

4.被交換的離子擴散到樹脂表面。

5.沖洗液通過，被交換的離子擴散到外部溶液中1.

陽離子交換樹脂

分為強酸型、中強酸型和弱酸型三類，強酸型樹脂含有－R－SO3H，中強酸型樹脂含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2，弱酸型樹脂含有－COOH或－OH。陽離子交換樹脂進行的反應(yīng)如下：2.

陰離子交換樹脂

分為強堿型、中強堿型和弱堿型三類，含有銨鹽，四級銨鹽[－N+(CH3)3]為強堿型樹脂，三級以下銨鹽[－N(CH3)2]、[－NHCH3]、[－NH2]都屬弱堿型樹脂；同時具有強堿和弱堿型基團的，為中強堿型的樹脂。陰離子交換樹脂進行的反應(yīng)如下：

3.除了樹脂以外，纖維素（cellulose）、葡聚糖凝膠（Sephadexgel）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）也是常用的離子交換材質(zhì)，特性是具有親水性和較大的表面積，對生物活性物質(zhì)而言，是一個較為溫和的環(huán)境，同時也是大分子所適用的分離純化材質(zhì)

。常用的種類如下：四、交換劑的選擇

若被分離物質(zhì)帶正電荷，例如polymyxin、cytochromeC這些堿性蛋白質(zhì)，它們在酸性溶液中較穩(wěn)定，親和力強，故采用陽離子交換劑；其它像heparin、nucleicacid這類酸性物質(zhì)，在堿性溶液中較穩(wěn)定，則使用陰離子交換劑；如果欲分離的物質(zhì)是兩性離子，一般考慮在它穩(wěn)定的pH范圍帶有何種電荷，作為交換劑的選擇。以胰島素（insulin）為例，它的等電點為pH5.3，因此在pH<5.3（酸性）溶液中，采用陽離子交換劑，在pH>5.3的堿性溶液中，使用陰離子交換劑。

簡言之，已知等電點的物質(zhì)，在高于等電點的pH條件下，因帶有負(fù)電荷，應(yīng)采用陰離子交換，在低于等電點的pH下，則采用陽離子交換。未知等電點的物質(zhì)，在一定pH條件下進行電泳，向陽極移動較快的物質(zhì)，在同樣條件下可被陰離子交換劑吸附，向陰極移動較快的物質(zhì)可被陽離子交換劑吸附。

六、離子交換樹脂的前處理

離子交換樹脂使用前，先以蒸餾水除去其內(nèi)之雜質(zhì)，并以NaOH和HCl處理樹脂，使其上的官能基完全露出。陰離子交換樹脂先以15倍于樹脂量的0.5NHCl浸泡30~120分鐘，再以水清洗至pH7.0，之后用0.5NNaOH浸泡30~120分鐘，同樣以水清洗至pH7.0，最后用欲使用的緩沖液浸泡。陽離子交換樹脂用15倍于樹脂量的0.5NNaOH浸泡30~120分鐘，以水清洗至pH7.0，之后用0.5NHCl浸泡30~120分鐘，再以水清洗至pH7.0，最后用欲使用的緩沖液浸泡。洗滌好的樹脂使用前必須平衡至所需的pH和離子強度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時分層，要適當(dāng)加壓裝柱，同時使柱床壓緊，減少死體積，有利于分辨率的提高。柱子裝好后再用起始緩沖液淋洗，直至達到充分平衡方可使用。洗脫時應(yīng)滿足以下要求：①洗脫液體積應(yīng)足夠大，一般要幾十倍于床體積，從而使分離的各峰不至于太擁擠。②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質(zhì)能被洗脫下來。③梯度不要上升太快，要恰好使移動的區(qū)帶在快到柱末端時達到解吸狀態(tài)。目的物的過早解吸，會引起區(qū)帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。八、數(shù)據(jù)分析洗脫餾份的分析按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進行測定，得到層析圖譜。依實驗?zāi)康牡牟煌刹捎眠m宜的檢測方法（生物活性測定、