酶工程 第二節(jié) 酶的結(jié)構(gòu)與催化機制課件

第二節(jié)酶的催化機制

問題：酶何以具有高催化活性？

為什么會有高度專一性？●近年來，有關(guān)酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究進(jìn)展很快，成為現(xiàn)代酶學(xué)與酶工程的一個重要組成部分，也是結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的主要內(nèi)容；●酶蛋白的一級結(jié)構(gòu)決定了酶的空間構(gòu)象，而酶所具有的特定空間構(gòu)象又是酶功能表達(dá)的基礎(chǔ)——決定了酶的高效、專一催化化學(xué)反應(yīng)的能力

實驗現(xiàn)象：在8mol/L尿素存在下，用巰基乙醇處理天然RNase,其二硫鍵全部斷裂，肽鏈松散，活性全部喪失，但當(dāng)用透析法除去尿素、巰基乙醇后，RNase活力全部恢復(fù)，而且復(fù)原后產(chǎn)物其物化性質(zhì)與天然RNase完全相同；然而在隨機情況下，8個HS—形成4個—S—S時，應(yīng)有105種不同方式，但在復(fù)原過程中，走向隨機的RNase肽鏈卻只選擇了其中一種方式（即與天然構(gòu)象完全相同）.

一、酶分子的組成酶按組成分類單純酶：不需輔酶，除蛋白質(zhì)不含其他成分如水解酶類的胃蛋白酶、核酸酶、脲酶等

結(jié)合酶（全酶）蛋白質(zhì)非蛋白部分金屬離子：如羧肽酶含Zn2+小分子物質(zhì)：轉(zhuǎn)氨酶含磷酸吡哆醛

糖蛋白：凝血酶蛋白RNA：RNaseP含RNA等1969年，GutteMerrifield由氨基酸人工合成了具有催化活性的Rnase,進(jìn)一步證實了酶的蛋白質(zhì)本質(zhì)。

蛋白質(zhì)（protein，簡寫pro)

是由20種L-α-氨基酸按一定的序列通過酰胺鍵（肽鍵）縮合而成的，具較穩(wěn)定構(gòu)象并具一定生物功能的生物大分子。

一級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)血紅蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)球蛋白分子：

種類：血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白、球蛋白、酶蛋白、激素蛋白、抗體等。

（二）、酶的活性部位

問題：酶是生物大分子物質(zhì)，分子量都在10000以上，每個酶分子至少由100個以上氨基酸連接而成，而酶的作用底物多為有機小分子。可以想象，只有少數(shù)一些氨基酸殘基和催化活力有關(guān)。后來證實這些特異的氨基酸殘基組成了酶的活性中心。

（2）、從酶與底物的作用推測

令胰凝乳蛋白酶作用于對硝基苯酚乙酸酯：

OCH3CGly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu

中間物用同位素標(biāo)記，然后水解，得含標(biāo)記的乙酰基肽段，其序列與DFP抑制劑的Ser殘基周圍的氨基酸序列一致。所以可以推測，DFP抑制的部位是酶催化的中“關(guān)鍵”部位。2、活性部位的研究方法化學(xué)修飾法動力學(xué)分析法光譜法X線晶體衍射法

化學(xué)修飾法酶分子中可修飾基團(tuán)：羥基、-HS基、氨基、羧基、咪銼基等，可用于化學(xué)修飾的基團(tuán)也不少。

（1）、使用非特異試劑對特殊基團(tuán)的標(biāo)記；

非特異性試劑：不能區(qū)分活性部位內(nèi)和活性部位外基團(tuán)的試劑。

特殊基團(tuán):某些酶的活性部位含有活性部位以外沒有的氨基酸殘基，如（-HS基）。例如：木瓜蛋白酶中有7個半胱氨酸殘基，其中的6個形成三對二硫橋，只有一個殘基以自由巰基形式存在于活性部位，這時就可以用任何一種巰基試劑來標(biāo)記（如碘乙酸）得到巰基修飾與活力喪失相平行的結(jié)果。若是非特殊基團(tuán)，要充分利用活性部位中某一基團(tuán)具有特別高的反應(yīng)性的有利條件進(jìn)行化學(xué)修飾。（如胰凝乳蛋白酶的Ser-195與DFP的作用）+RRR(a)+PP+RRP-PR+R*RR*(b)+x-y

2、動力學(xué)分析法

酶蛋白是帶有許多解離基團(tuán)的兩性蛋白質(zhì)，pH改變必然影響解離基團(tuán)的解離狀態(tài)，處于活性部位的解離基團(tuán)的解離狀態(tài)的改變會直接關(guān)系到酶的催化活性。例如：通過pH-酶催化活力關(guān)系的研究，可能得到與催化直接相關(guān)的某些基團(tuán)的pK值；通過在不同溫度條件下測定V與pH的關(guān)系，可求得有關(guān)基團(tuán)的解離熱H，H的測定有助于補充pK值對活性部位性質(zhì)的判斷。進(jìn)而推斷此基團(tuán)的本質(zhì)。

4、X線衍射法以上方法所得結(jié)果還是較零碎和間接的，只能推斷出構(gòu)成活性部位的氨基酸殘基，而X線衍射還能了解到這些基團(tuán)的相對位置與實際狀態(tài)。

X線衍射法最令人信服，但單靠一種方法往往不能解決問題，需幾種方法證明后才能確定。

3、酶活性中心的概念

酶與其他蛋白質(zhì)的不同之處在于，酶分子在一級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上通過二三級折疊盤繞,形成了各自特定的具有催化功能的活性構(gòu)像區(qū)域，酶分子不是以整個分子，而是在這個區(qū)域內(nèi)參與和底物結(jié)合并對底物進(jìn)行催化反應(yīng)。

前列腺素H2合成酶活性中心活性中心的本質(zhì)活性中心是酶分子中與催化功能直接有關(guān)并在三維結(jié)構(gòu)上相互靠近的少數(shù)幾個aa殘基或其上的某些基團(tuán)按照特定立體構(gòu)象組成的活性結(jié)構(gòu)區(qū)域.（是與底物結(jié)合并催化反應(yīng)的場所）溶菌酶的活性中心活性中心的特點：僅為酶分子的少數(shù)幾個殘基由于肽鏈的盤繞折疊而成；是由特定空間構(gòu)象維持的一個裂隙；活性中心以外的部分對活性中心形成提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

羧肽酶活性中心活性中心包括催化部位和底物結(jié)合部位催化部位：在催化反應(yīng)中直接參與電子授受關(guān)系的部位，直接參與催化，底物敏感鍵在此被切斷或形成新鍵，并形成底物。底物結(jié)合部位：指與底物特異結(jié)合的有關(guān)部位，也叫特異性決定部位。

溶菌酶與(NAG)6

的結(jié)合方式返回

酶活性中心上的基團(tuán)胰蛋白酶Ser-183,His-46枯草桿菌蛋白酶Ser,His,pK8-7的基團(tuán)木瓜蛋白酶CysCys,His,羧基乳酸脫氫酶Cys,His,TyrG6P脫氫酶(酵母)Lys,His,Tyr蘋果酸脫氫酶Tyr核糖核酸酶His12,119,Lys7,Asp121葡萄糖磷酸變位酶一個氨基一些酶活性中心的基團(tuán)

實驗表明：

活性中心上有7種氨基酸的頻率最高，分別是：

Ser,His,Cys,Tyr,Asp,Glu,Lys同類酶活性中心一級結(jié)構(gòu)的氨基酸順序十分相似；

催化各類反應(yīng)的酶，其活性中心的基團(tuán)常有一定的特征；

如：蛋白酶---絲氨酸、組氨酸（胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶）半胱氨酸（胃蛋白酶、木瓜蛋白酶）脫氫酶---絡(luò)氨酸（蘋果酸脫氫酶等）轉(zhuǎn)移酶、脫羧酶或異構(gòu)酶---氨基（轉(zhuǎn)氨酶、某些激酶）

氧化還原酶---Cys二硫鍵

兩個Cys的SH基經(jīng)脫氫連接而成二硫鍵。兩個Cys通常并不相鄰而是間隔若干個氨基酸殘基。對于這一類酶來說，二硫鍵是酶表現(xiàn)活力所必需的，如還原成SH反而喪失活力。而有些酶還通過二硫鍵與SH基互變而表現(xiàn)活力。一些氧化還原酶活性中心二硫鍵附近的氨基酸順序酶順序硫辛酰氨脫氫酶(E.Coli)Leu-Gly-Gly-Val-*Cys-Leu-Asn-Val-Gly-*Cys-Ile-Pro-Ser-Lys硫辛酰氨脫氫酶(豬心）Leu-Gly-Gly-Thr-*Cys-Leu-Asn-Val-Gly-*Cys-Ile-Pro-Ser-Lys谷胱甘肽還原酶（酵母）Leu-Gly-Gly-Thr-*Cys-Val-Asn-Val-Gly-*Cys-Val-Pro-Lys-Val硫氧還蛋白還原酶（E.Coli)Ala-*Cys-Ala-The-*Cys-Asp-Gly-Phe

但是，如何從一級結(jié)構(gòu)預(yù)測其二級、三級結(jié)構(gòu)呢?——生物信息學(xué)或結(jié)構(gòu)生物學(xué)的基本任務(wù)。

非蛋白催化劑（非酶催化劑）的發(fā)現(xiàn)◆1978年耶魯大學(xué)Altmen等發(fā)現(xiàn)大腸桿菌RNaseP是一種不尋常的催化劑?！?982年Cech研究組發(fā)現(xiàn)原生動物四膜蟲核糖體中有一段RNA可以在不存在蛋白質(zhì)酶的條件下將rRNA前體自我剪切。這表明RNA分子本身具有催化性?！鬜ibozyme——具有催化能力的RNACech和他們小組發(fā)現(xiàn)的RNA酶

根據(jù)輔酶（非蛋白部分）與酶蛋白結(jié)合程度輔酶：與酶蛋白結(jié)合不牢，極易分離，在反應(yīng)溶液中與酶蛋白處于可逆的解離狀態(tài)如NAD+、NADP+輔基：與酶蛋白結(jié)合十分牢固而不易分離如細(xì)胞色素氧化酶的鐵卟啉、葡萄糖氧化酶的FAD分子

輔酶的功能：參與和底物分子作用，催化底物反應(yīng)，而且對酶蛋白的穩(wěn)定性起保護(hù)作用.輔酶的分類1、與轉(zhuǎn)移氫（電子）有關(guān)的輔酶（氧化還原反應(yīng)的輔酶）

例:尼克酰胺核苷酸又稱煙酰胺核苷酸——絕大部分脫氫酶的輔酶

尼克酰胺環(huán)是其作用核心，在生物氧化過程中起傳遞氫作用。氧化型尼克酰胺核苷酸（NAD+、NADP+）接受一個質(zhì)子、兩個電子，還原為NADH、NADPH還原性底物+

NAD+氧化性底物+NADH+H+NADP+NADPH

2、與其他基團(tuán)（除氫）轉(zhuǎn)移有關(guān)的輔酶

例:

▲三磷酸腺苷（ATP）與兩類反應(yīng)有關(guān)：一類是ATP分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w，如磷酸激酶催化：ATP+乙酸乙酰磷酸+ADP另一類是ATP釋放能量供另外的反應(yīng)使用

▲焦磷酸硫胺素（TPP）是脫羧酶的輔酶，在以下兩種反應(yīng)中充當(dāng)輔酶：1、丙酮酸等α-酮酸的非氧化脫羧和氧化脫羧2、α-乙酮醇的生成和轉(zhuǎn)移反應(yīng)

▲磷酸吡哆醛（PLP）是轉(zhuǎn)氨酶與氨基酸脫羧酶的輔酶，它對蛋白質(zhì)代謝具有十分重要的意義所有的轉(zhuǎn)氨酶都含磷酸吡哆醛，與酶以牢固非共價鍵相連

PLPTPP▲黃素核苷酸屬輔基類，是黃素酶的輔基，有黃素單核苷酸（FMN）黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）兩種，都含黃素。其催化反應(yīng)的核心是異咯嗪，二者均呈黃色熒光，在還原作用中其熒光消失，氧化后又恢復(fù)FMNFAD

3、金屬

許多酶的催化作用需要金屬參與，這些金屬被稱為活化因子.有的金屬直接關(guān)系到酶的活性，如羧肽酶A中的鋅；也有的金屬主要是維持主體結(jié)構(gòu)，與酶活性有間接關(guān)系，如脂肪酶中的金屬鈣；金屬離子的作用，可能是將酶與底物通過配位鍵連接起來形成如圖所示的復(fù)合物。

底物MCOO-NH2酶蛋白ZincFinger:2His(green)and2Cys(red)

coordinatetheZn++(blue)Zn2+與羧肽酶A緊密結(jié)合，對于該酶的活性頗為重要。Zn2+使底物上（敏感鍵）中的基團(tuán)極化為，同時Glu-270的O-也使的偶極距增多，但并不抵消電子張力的作用，這樣Zn2+在底物中造成的電子張力就大大促進(jìn)了底物水解—C—N—OH—C—O—C+—OC+O-二、酶的作用原理酶與一般化學(xué)催化劑的比較：A.更高的催化效率B.更高的反應(yīng)專一性C.溫和的反應(yīng)條件D.具有調(diào)節(jié)能力E.易變性失活

（一）、酶的高催化效率

就分子比而言，酶催化反應(yīng)速度比非催化反應(yīng)速度高108—1020倍，比非酶催化反應(yīng)高107—1013倍。以轉(zhuǎn)換數(shù)表示，大部分酶為1000左右。

轉(zhuǎn)換數(shù)：每個酶分子每分鐘催化底物轉(zhuǎn)變的分子數(shù)。

用簡單的實驗證明酶的催化效率：2H2O22

H2O+O2鐵屑肝糜肝糜（煮）

酶的催化機理是降低活化能

1946年,諾貝爾獎二次得主美國化學(xué)家LinusPauling提出酶催化反應(yīng)的過渡態(tài)理論：

酶催化化學(xué)反應(yīng)的機制在于酶與高能、短壽命的過渡態(tài)（激發(fā)態(tài)）相結(jié)合，在這個處于反應(yīng)底物和產(chǎn)物之間的過渡態(tài)構(gòu)型中,某些鍵斷裂而另一些鍵形成，從而大大降低了化學(xué)反應(yīng)的活化能。

證明：①人工合成了過渡態(tài)類似物；②用過渡態(tài)類似物制備出抗體酶。

1、中間絡(luò)合物學(xué)說(酶-底物復(fù)合體學(xué)說)

當(dāng)一個酶在起催化作用時,首先要和底物結(jié)合形成一個酶-底物復(fù)合體,然后再催化底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。這是一個專一性決定過程、也是變分子間反應(yīng)為分子內(nèi)反應(yīng)的過程、又是一個誘導(dǎo)挈合過程。

E+S

ES

E+P

學(xué)說認(rèn)為：（1）、當(dāng)酶催化一化學(xué)反應(yīng)時，首先E和S結(jié)合形成中間產(chǎn)物ES，然后它再分解成產(chǎn)物P并釋放酶E。S+E→ES→E+PE-ScomplexsubstrateRNAse_ESES（2）、中間產(chǎn)物比底物需較少的活化能就可分解成產(chǎn)物并放出酶。

（3）、中間絡(luò)合物結(jié)合方式的特點大多通過短程的非共價鍵結(jié)合，反應(yīng)產(chǎn)物易于同酶-底物復(fù)合物分開。從酶作用的立體特異性說明酶和底物的結(jié)合至少有三點，否則就不能產(chǎn)生立體特異性。

（4）、[ES]決定酶促反應(yīng)速度。根據(jù)上述理論提出酶的催化機理學(xué)說

A、底物形變B、鄰近與定向效應(yīng)

C、酸堿催化

D、共價催化

E、微環(huán)境效應(yīng)

底物形變(扭曲、張變）

酶反應(yīng)時,酶活性部位與底物分子結(jié)合,由于酶活性中心關(guān)鍵電荷基團(tuán)使底物某些敏感鍵發(fā)生形變(扭曲、張變)，使底物分子構(gòu)象改變，有關(guān)反應(yīng)鍵削弱，從而使反應(yīng)物從基態(tài)激發(fā)為過渡態(tài)，從而降低了活化能，形成過渡態(tài)絡(luò)合物，加速反應(yīng)進(jìn)行。

鄰近與定向效應(yīng)

鄰近效應(yīng)是指酶與底物結(jié)合形成絡(luò)合物以后，使底物與底物、酶的催化基團(tuán)與底物之間，結(jié)合于同一分子的活性部位上而使活性部位的底物有效濃度得以極大提高，從而反應(yīng)速度大大增大的一種效應(yīng)。定向效應(yīng)是指反應(yīng)物的反應(yīng)基之間，酶的催化基團(tuán)與底物的反應(yīng)基之