金免疫標記技術

任務九

金免疫標記技術知識目標技能目標素質目標1.掌握金免疫標記技術原理和分類2.了解標記物的制備3.了解金免疫檢測的臨床應用1.會金免疫標記物的制備操作2.會熟練操作金免疫檢測過程樹立嚴肅認真、實事求是、高度負責的科學態(tài)度，具有良好的職業(yè)素質和崇高的職業(yè)道德。

任務目標任務對象肺炎支原體抗體檢測

任務過程

復習提問

案例導入

講解與示教學生操作討論分析

評價、考核

課后思考題教學環(huán)節(jié)2′30′2′10′40′5′1′

患兒，女，11歲，間斷發(fā)熱1周，伴咳嗽3天。體溫最高39。1度，病程第2天查血常規(guī)正常，診斷“呼吸道感染”并靜滴“阿奇霉素”3天，無明顯改變，即而出現(xiàn)咳嗽，為陣發(fā)性刺激性咳嗽，少痰，胸片提示：雙肺紋理增粗，右上肺片影。復查血常規(guī)仍正常?；純悍尾扛腥鞠的姆N病原體所致？如何快速診斷？案例導入

斑點金免疫層析法演示

肺炎支原體診斷試劑盒講解與示教

二用采血針采指尖血一洗凈雙手四立即加1-2滴緩沖液

三將1滴指尖血滴入加樣孔操作步驟5：15分鐘讀取結果

？？結果？？結果老師糾正點評

學生操作一位學生操作演示學生分組再操作討論分析膠體金標記技術(Immunogoldlabelingtechnique)

是以膠體金作為示蹤標記物，應用于抗原抗體反應的一種新型免疫標記技術。討論分析膠體金標記技術討論分析（一）金免疫檢測原理膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合，由于這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。膠體金除了與蛋白質結合以外，還可以與許多其它生物大分子結合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。討論分析Geobegan等將膠體金標記抗體用于普通光鏡下檢測B淋巴細腦表面膜免疫球蛋白，建立了光鏡水平的免疫金染色。Faulk和Taylor首創(chuàng)膠體金標記免疫電鏡技術膠體金標記技術進一步發(fā)展應用于免疫轉印、流式細胞術、液相免疫測定、固相斑點金／銀染色及斑點金免疫滲濾測定法等多種標記免疫檢測方法1971年1978年近年來討論分析討論分析枸櫞酸三鈉還原法鞣酸—枸櫞酸鈉還原法根據(jù)不同的還原劑可以制備大小不同的膠體金顆粒。常用來制備膠體金顆粒的方法膠體金的制備

1．枸櫞酸三鈉還原法（1）10nm膠體金粒的制備：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸櫞酸三鈉水溶液3ml，加熱煮沸30min，冷卻至4℃，溶液呈紅色。（2）15nm膠體金顆粒的制備：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸櫞酸三鈉水溶液2ml，加熱煮沸15min～30min，直至顏色變紅。冷卻后加入0.1Mol/LK2CO30.5ml，混勻即可。（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm膠體金顆粒的制備：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加熱煮沸。根據(jù)需要迅速加入1％枸櫞酸三鈉水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，繼續(xù)煮沸約5min，出現(xiàn)橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒則分別為15nm、18～20nm、30nm和50nm討論分析2．鞣酸—枸櫞酸鈉還原法

A液：1％HAuCl4水溶液1ml加入79ml雙餾水中混勻。

B液：1％枸櫞酸三鈉4ml，1％鞣酸0.7ml，0.1Mol/LK2CO3液0.2ml，混合，加入雙餾水至20ml。將A液、B液分別加熱至60℃，在電磁攪拌下迅速將B液加入A液中，溶液變藍，繼續(xù)加熱攪拌至溶液變成亮紅色。此法制得的金顆粒的直徑為5nm。如需要制備其它直徑的金顆粒，則按表15-1所列的數(shù)字調整鞣酸及K2CO3的用量

討論分析（1）玻璃器皿必須徹底清洗，最好是經(jīng)過硅化處理的玻璃器皿，或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性，不能獲得預期大小的金顆粒。（2）試劑配制必須保持嚴格的純凈，所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制，或者在臨用前將配好的試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜（0.45μm）過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質。制備高質量膠體金的注意事項

討論分析（3）配制膠體金溶液的pH以中性（pH7.2）較好。（4）氯金酸的質量要求上乘，雜質少。最好是進口的。（5）氯金酸配成1％水溶液在4℃可保持數(shù)月穩(wěn)定，由于氯金酸易潮解，因此在配制時，最好將整個小包裝一次性溶解。制備高質量膠體金的注意事項討論分析

缺點金標法

優(yōu)點

靈敏度不如酶標技術一般作為定性，不易定量。討論分析自帶質控對照簡便、經(jīng)濟實用符號顯示結果快速：全部檢測過程僅需3-20分鐘。示蹤劑：以膠體金為指示劑，本身形成免疫分析過程后的顏色標記討論分析可單份檢測，穩(wěn)定性好斑點金免疫層析試驗夾心法競爭法雙抗原夾心法雙抗體夾心法討論分析分類

雙抗體夾心法G區(qū)：金標特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：特異性抗體

吸水紙標本討論分析討論分析競爭法標本G區(qū)：金標特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：標準抗原

吸水紙陽性結果討論分析標本G區(qū)：金標特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：標準抗原吸水紙陰性結果討論分析討論分析

斑點金免疫滲濾測定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纖維膜下墊有吸水性強的墊料，即為滲濾裝置。在加抗原（抗體）后，迅速加抗體（抗原），再加金標記第二抗體，由于有滲濾裝置，反應很快，在數(shù)分鐘內即可顯出顏色反應。此方法已成功地應用于人的免疫缺陷病病毒（HIV）的檢查和人血清中甲胎蛋白的檢測。討論分析以雙抗體夾心法HCG