高效液相色譜新

關于高效液相色譜新第1頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六

1．高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法

第2頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六

2．高效液相色譜法與氣相色譜法

缺點：高效液相色譜法的儀器設備費用昂貴，操作嚴格，這是它的主要缺點。第3頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六第二節(jié)高效液相色譜儀

第4頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示意見圖，一般可分為4個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進樣及數(shù)據(jù)處理等。其工作過程如下：首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經(jīng)過進樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當注入欲分離的樣品時，流經(jīng)進樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。一、高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)第5頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六二、高效液相色譜組成系統(tǒng)1．高壓輸液系統(tǒng)

它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流泵又稱機械泵，它又分機械注射泵和機械往復泵兩種，應用最多的是機械往復泵。第6頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六2．進樣系統(tǒng)

高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進樣系統(tǒng)是引起往前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進樣技術要求較嚴。

第7頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六3分離系統(tǒng)——色譜柱

色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。

柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。一般色譜柱長5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3～12mm，制備往內(nèi)徑較大，可達25mm以上。

一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離柱的性能不受影響。柱子裝填得好壞對柱效影響很大。對于細粒度的填料（＜20μm）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。第8頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六4．檢測系統(tǒng)

在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學特性有響應，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學性質(zhì)有響應，屬于這類檢測器的有示差折光，電導檢測器等?，F(xiàn)將常用的檢測器介紹如下:第9頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六

三、高效液相色譜的固定相和流動相

（－）固定相

高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團，就是鍵合固定相，可擴大應用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5×108Pa。固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。

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（1）表面多孔型固定相

它的基體是實心玻璃珠，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酸胺等。這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。

2．全多孔型固定相

它由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。這類固定相由于顆粒很細（5～10μm），孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實現(xiàn)高效、高速。特別適合復雜混合物分離及痕量分析.第11頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六

第12頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六（二）流動相

由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親和力，并參與固定相對組分的競爭。因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。對流動相溶劑的要求是：

（1）溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。

（2）溶劑要與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，應注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。表20-2列出了一些常用溶劑的紫外截止波長。對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動相，以達最高靈敏度。第13頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六（3）高純度。由于高效液相靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長值增加50～IOOnm。（4）化學穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應或聚合的溶劑。(5)低粘度。若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離.第14頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六第四節(jié)高效液相色譜法的主要類型（－）液一液分配色譜法（LLPC）在液-液色譜中,流動相和固定相都是液體,它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。

分離原理：液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。所不同的是液液色譜的分配是在柱中進行的，使這種分配平衡可反復多次進行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復雜組分。第15頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六（二）化學鍵合相色譜法（CBPC）

采用化學鍵合相的液相色譜稱為化學鍵合相色譜法，簡稱鍵合相色譜。由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，適用于梯度淋洗，特別適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。由于鍵合到載體表面的官能團可以是各種極性的，因此它適用于種類繁多樣品的分離。第16頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六3．反相健合相色譜法

此法的固定相是采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠一C18H37、硅膠一苯基等；流動相是采用極性較強的溶劑，如甲醇十、乙睛一水、水和無機鹽的緩沖溶液等。它多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物；若采用含一定比例的甲醇或乙睛的水溶液為流動相，也可用于分離極性化合物；若采用水和無機鹽的緩沖液為流動相，則可分離一些易離解的樣品，如有機酸、有機堿、酚類等。反相鍵合相色譜法具有柱效高，能獲得無拖尾色譜峰的優(yōu)點。

第17頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六關于反相鍵合相色譜的分離機理，可用所謂疏溶劑作用理論來解釋。這種理論把非極性的烷基鍵合相看作一層鍵合在硅膠表面上的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有較強的流水特性。當用極性溶劑為流動相來分離含有極性官能團的有機化合物時，一方面，分子中的非極性部分與固定相表面上的疏水烷基產(chǎn)生締合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動相的作用，促使它離開固定相，并減小其保留作用（見圖20-4）。顯然，兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。第18頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六4.正相鍵合相色譜法

此法是以極性的有機基團，CN、NH2雙羥基等鍵合在硅膠表面，作為固定相；而以非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙臘等）為流動相，分離極性化合物。此時，組分的分配比k值隨其極性的增加而增大，但隨流動相極性的增加而降低。這種色譜方法主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。第19頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六5.離子性鍵合相色譜法

當以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學鍵合各種離子交換基團，如一SO3H一CH2NH2、－C00H、一CH2N（CH3）等時，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相；流動相一般采用緩沖溶液。其分離原理與離子交換色譜類同。鍵合相色譜的最大優(yōu)點是：通過改變流動相的組成和種類，可有效地分離各種類型化合物（非極性、極性和離子型）。據(jù)統(tǒng)計，在高效液相色譜法中，約有8O％的分離問題是用鍵合相色譜法解決。

缺點：不能用于酸、堿度過大或存在氧化劑的緩沖溶液作流動相的體系。第20頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六（三）液一固吸附色譜法(LSAC)

液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進行分離的。1．分離原理當流動相通過固定相（吸附劑）時，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動相分子。同時，當試樣分子（X）被流動相帶入柱內(nèi)，只要它們在固定相有一定程度的保留就要取代數(shù)目相當?shù)囊驯晃降牧鲃酉嗳軇┓钟茫┯谑?，在固定相表面發(fā)生競爭吸附:

X+nSad=Xad+nS第21頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六2．固定相

吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點較多，如線性容量較高，機械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學反應等，因此，以硅膠用得最多。在高效液相色譜法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，它們具有填料均勻、粒度小?？籽\的優(yōu)點，能極大地提高柱效。但表面多孔型由于試樣容量較小，目前最廣泛使用的還是全多孔型微粒填料。第22頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六3

流動相

一般把吸附色譜中流動相稱作洗脫劑。在吸附色譜中對極性大的試樣往往采用極性強的洗脫劑；對極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。洗脫劑的極性強弱可用溶劑強度參數(shù)（ε0）來衡量。ε0越大，表示洗脫劑的極性越強。表20-4列出一些常用溶劑在氧化鋁吸附劑中的ε0值。在硅膠吸附劑中ε0值的順序相同，數(shù)值可換算（ε0硅膠=0·77×ε0氧化鋁）。第23頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六(四）離子交換色譜法（IEC）

此法是利用離子交換原理和液相色譜技術的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進行分離。它不僅適用無機離子混合物的分離，亦可用于有機物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應用范圍較廣。第24頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六1．離子交換原理

離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團和可游離的平衡離子。當待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進行可逆交換，其交換反應通式如下：陽離子交換：陰離子交換：

一般形式：R一A＋B＝R－B＋A第25頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六

2．固定相

作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽離子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有強弱之分（見表20-5）第26頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六

常用的離子交換劑固定相大致可分以下幾種：

（l）多孔型離子交換樹脂

它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直徑約為5～20μm，有微孔型和大孔型之分[見圖20-6中（a）和（b）］。（2）薄膜型離子交換樹脂

它是在直徑約對30μm的固體情性核上，凝聚1～2μm厚的樹脂層，如圖20-6中（c）。（3）表面多孔型離子交換樹脂

它是在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂一層很薄的離子交換樹脂，如圖20-6中（d）所示。（4）離子交換鍵合固定相

它是用化學反應將離子交換基團鍵合到惰性載體表面。它也分為兩種類型。一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。另一種是鍵合微粒載體型，它的載體是多孔微粒硅膠。后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相，它的優(yōu)點是機械性能穩(wěn)定，可使用小粒度固定相和高柱壓來實現(xiàn)快速分離。第27頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六3．流動相

離子交換色譜法所用流動相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強度）的緩沖溶液。通過改變流動相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競爭吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。陰離子的滯留次序為：

檸檬酸離子＞SO42－＞C2O42-＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN-＞

Cl-＞HCOO-＞CH3C00-＞OH-＞F-

所以用檸檬酸離子洗脫要比用氟離子快。

陽離子的滯留次序大為：

Ba2+＞Pb2+＞Ca2+＞Ni2+＞Cd2+＞Cu2+＞Co2+＞Zn2+＞Mg＞Ag+＞Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li十

只要電離度增大，就會使樣品的保留增大。

第28頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六（五）離子色譜法（IC）

離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分離方法。由于離子交換色譜法在無機離子的分析和應用受到限制，在分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導的流動相轉(zhuǎn)變成低背景電導的流動相，從而用電導檢測器可直接檢測各種離子的含量。這種色譜技術稱為離子色譜。若樣品為陽離子，用無機酸作流動相，抑制柱為高容量的強堿性陰離子交換劑。當試樣經(jīng)陽離子交換劑的分離往后，隨流動相進入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個重要反應：第29頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六R+－OH＋H+Cl--→R+－Cl十H2OR+一OH-＋M+Cl--→M+OH－＋R+－Cl-

由反應可見：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼Ш苄〉乃?，消除了流動相本底電導的影響。同時，又將樣品陽離子M+轉(zhuǎn)變成相應的堿，由于OH-離子的淌度為Cl-離子的2．6倍，提高了所測陽離子電導的檢測靈敏度。對于陰離子樣品也有相似的作用機理。在分離柱后加一個抑制柱的離子色譜亦稱為抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過抑制柱后會加寬，降低了分離度。后來，F(xiàn)rits等人提出采用抑制柱的離子色譜體系，而采用了電導率極低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·dm-3苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動相，稱為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。第30頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六（六）離子對色譜法（IPC）

離子對色譜法是分離分析強極性有機酸和有機堿的極好方法。它是離子對革取技術與色譜法相結(jié)合的產(chǎn)物。在20世紀70年代中期，Schill等人首先提出離子對色譜法，后來，這種方法得到十分迅速的發(fā)展。第31頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六離子對色譜法原理

離子對色譜法是將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱對離子或反離子）加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對，從而控制溶質(zhì)離子保留行為的一種色譜法。關于離子對色譜機理，至今仍不十分明確，已提出三種機理：離子對形成機理；離子交換機理；離子相互作用機理。現(xiàn)以離子對形成機理說明之。假如有一離子對色譜體系，固定相為非極性鍵合相，流動相為水溶液，并在其中加入一種電荷與組分離子A-相反的離子B+，B+離子由于靜電引力與帶負電的人組分離子生成離子對化合物A-B+。離子對生成反應式第32頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六（七）尺寸排阻色譜法（SEC）

尺寸排阻色譜法又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離的。尺寸排阻色譜被廣泛應用于大分子的分級，即用來分析大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布。它具有其他液相色譜所沒有的特點：（1）保留時間是分子尺寸的函數(shù)，有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息。(2)保留時間短，譜峰窄，易檢測，可采用靈敏度較低的檢測器（3）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強保留分子，因此柱壽命長。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子質(zhì)量差別必須大于10％才能得以分離。第33頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六

1．分離原理尺寸排阻色譜是按分子大小順序進行分離的一種色譜方法。其固定相為化學情性多孔物質(zhì)——凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其滲透過程模型見圖20-7。第34頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六2．固定相

排阻色譜固定相種類很多，一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。表20-6列出了常用的一些固定相。

所謂凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。

（1）軟性凝膠如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。

（2）半剛性凝膠如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機溶劑作流動相。用于高效液相色譜時，流速不宜大。

（3）剛性凝膠如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑，又可用有機溶劑作流動相，可在較高壓強和較高流速下操作。一般控制壓強小于7MPa，流速＜1cm3·s-1；否則將影響凝膠孔徑，造成不良分離。第35頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六3．流動相

排阻色譜所選用的流動相必須能溶解樣品，并必須與凝膠本身非常相似，這樣才能潤濕凝膠。當采用軟性凝膠時，溶劑也必須能溶脹凝膠。另外，溶劑的粘度要小，因為高粘度溶劑往往限制分子擴散作用而影響分離效果。這對于具有低擴散系數(shù)的大分子物質(zhì)分離，尤需注意。選擇溶劑還必須與檢定器相匹配。常用的流動相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。

以水溶液為流動相的凝膠色譜適用于水溶性樣品，以有機溶劑為流動相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。第36頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六(八)親和色譜法（AC）簡介

親和色譜是利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性親和力，進行選擇性分離的一種方法。它通常是在載體（無機或有機填料）表面先鍵合一種具有一般反應性能的所謂間隔臂（如環(huán)氧、聯(lián)氨等）；隨后，再連接上配基（酶、抗原或激素等）。這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留，沒有這種作用的分子不被保留。圖20-9為親和色譜法示意圖。第37頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六

第38頁，共41頁，2022年，5月20日，18點5分，星期六第五節(jié)分離類型的選擇

1．根據(jù)相對分子質(zhì)量選擇相對分子質(zhì)量十分低的樣品，其揮發(fā)性好，適用于氣相色譜。標準液相色譜類型（液