疾病相關SHP2突變體的相分離是MAPK過度活化的基礎

疾病相關SHP2突變體的相分離是MAPK過度活化的基礎導讀非受體蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）SHP2是由PTPN11編碼的，在正常發(fā)育RAS-有絲分裂原-活化的蛋白激酶（MAPK）信號通路中發(fā)揮重要的作用。令人費解的是PTPN11酶活化和失活的突變體為什么能夠導致具有重疊臨床表現(xiàn)的人類發(fā)育紊亂。在本研究中，研究者發(fā)現(xiàn)一種常見的、在這些疾病相關的SHP2突變體中共有的液-液相分離（LLPS）行為。SHP2LLPS是由保守的、折疊良好的PTP結構域通過多價電子相互作用介導，并且通過構象的改變由一種內在的自體抑制機制調節(jié)。SHP2變構抑制劑能夠減弱SHP2突變體的LLPS，提高SHP2PTP的活性。此外，疾病相關SHP2突變體能夠招募和激活LLPS中的WTSHP2，促進MAPK的活化。這些結果不僅暗示LLPS以一種功能獲得的方式參與SHP2相關人類疾病的發(fā)病機制，也提供證據(jù)說明PTP受LLPS調節(jié)，LLPS可能作為治療的靶向。實驗設計ClosedOpenClosedOSHP2-MutantOSHP2-WTOSHP2-MutantOSHP2-WT結果1疾病相關SHP2突變體在細胞中形成離散的點為了探究疾病相關突變體如何影響SHP2細胞內的功能，研究者在KYSE520細胞中穩(wěn)定表達了6個mEGFP標記的SHP2突變體（1個WT,3個NS/JMML突變體，以及2個NS-ML突變體），該細胞系是一種依賴SHP2的食道癌細胞系。SHP2-mEGFP的表達水平與內源性SHP2具有可比性。重要的是，活細胞熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)所有與疾病相關的SHP2突變體都形成了離散的斑點，而SHP2WT在整個細胞中明顯散布（圖1A）。高內涵成像分析顯示疾病相關SHP2突變體不僅在數(shù)量上，在斑點的平均大小上也超過了SHP2（圖1B）。在SHP2突變體中斑點的數(shù)量與平均斑點大小相關。此外，在一些其他細胞系中，包括HEK293T,A549，以及HUVEC，利用mEGFP-或者mScarlet-標記的SHP2進行的實驗中也觀察到相似的突變體特異的斑點形成。為了排除所觀察到的斑點形成可能是由于外源性SHP2表達導致細胞內蛋白濃度升高，研究者進一步在SHP2敲除的HEK293T細胞中穩(wěn)定表達了mEGFP-標記的SHP2突變體和WT。SHP2-mEGFP蛋白的表達水平與親代HEK293T細胞中SHP2的表達水平相同。研究者再次觀察到SHP2突變體中形成斑點，而SHP2中沒有。值得主要的是，兩個癌細胞系H661和CCF-STTG1都分別含有一個內源性NS相關的SHP2或者NS-ML相關的SHP2突變體，也出現(xiàn)了SHP2斑點，而含有兩個WTSHP2等位基因的KYSE520經(jīng)免疫熒光檢測只是偶爾有SHP2斑點。研究者進一步在更多生理設置的條件下檢測了SHP2斑點的存在，結果發(fā)現(xiàn)在Ptpn11小鼠源性的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)以及Ptpn11小鼠源性的間充質干細胞(MSCs)中SHP2斑點的數(shù)量具有高度的統(tǒng)計學意義，而在WTMEFs或者MSCs中沒有發(fā)現(xiàn)斑點(圖1C、D、E、F)。在分別含有一個SHP2或者一個SHP2突變體的NS病人口腔黏膜細胞中發(fā)現(xiàn)了大量SHP2斑點，但是在兩個健康的捐贈者中卻沒有(圖1G、H)。這些結果清楚的說明在細胞內疾病相關SHP2突變體具有更高的斑點形成傾向。圖1.細胞內疾病相關SHP2突變體形成斑點。(A)KYSE520細胞中SHP2以及SHP2-mEGFP的活細胞成像，標尺為10mm；(B)SHP2以及SHP2-mEGFP斑點高內涵數(shù)據(jù)定量，***p<0.001；(C)Ptpn11以及對照小鼠源系MEF細胞中SHP2免疫熒光成像，標尺10mm；(D)對圖C結果進行定量分析，***p<0.001；(E)Ptpn11以及對照小鼠源系MSCs細胞中SHP2免疫熒光成像，標尺10mm；(F)對圖E結果進行定量分析，***p<0.001；(G)兩個努南綜合征患者和兩個健康個體源系口腔黏膜上皮細胞中SHP2免疫熒光成像，標尺10mm；(H)對圖G結果進行定量分析，***p<0.001。細胞內疾病相關SHP2突變體的斑點表現(xiàn)出液滴樣的特征LLPS已經(jīng)成為許多生物學過程中一種基礎的調節(jié)機制。研究者評估了SHP2突變體斑點是否具有任意液滴樣特征。結果發(fā)現(xiàn)NS/JMML和NS-MLSHP2突變體的確形成斑點，斑點能夠移動并且一旦相遇就自發(fā)融合（圖2A）。光漂白（FRAP）后的熒光恢復實驗說明一旦光漂白，SHP2-mEGFP突變體斑點的免疫熒光在幾分鐘內就恢復（圖2B、2C）。為了證實內源性SHP2突變體形成的斑點在活細胞中是否具有液滴樣的特征，研究者利用CRISPR-Cpf1對H661細胞中帶有mEGFP的內源性SHP2突變體等位基因進行標記，隨后進行單克隆擴增并且通過測序進行驗證。在加工H661細胞的SHP2-mEGFP中觀察到與親代H661細胞內源性SHP2一樣的濃縮形成。在加工H661細胞中內源標記SHP2-mEGFP的斑點通過FRAP實驗也證實具有濃縮的流動性（圖2D）。這些結果提示促進斑點形成的NS/JMML和NS-MLSHP2突變體也表現(xiàn)出動態(tài)的液滴樣行為。圖2.細胞中疾病相關SHP2突變體的斑點表現(xiàn)出液滴樣特征。（A）兩個SHP2-mEGFP斑點的融合，標尺5mm；（B）KYSE520細胞中對SHP2E76K-mEGFP進行FRAP實驗的代表性圖像，標尺5mm；（C）SHP2-mEGFP斑點的FRAP數(shù)據(jù)定量分析；（D）H661（SHP2N58S）細胞中對內源性標記SHP2-mEGFP進行FRAP實驗的代表性圖像，標尺10mm。疾病相關SHP2突變體能夠促進體外SHP2的LLPS研究者進一步探究了體外SHP2是否具有相分離的能力。研究者準備了重組WT和多個疾病相關的SHP2突變體蛋白，結果發(fā)現(xiàn)相較于SHP2WT，NS/JMML和NS-ML突變體形成液滴的能力更強（圖3A、B）。顯著的是，SHP2突變體在體外形成液滴的潛能與細胞內形成斑點的能力相關（圖3C）。SHP2突變體的液滴在一段時間內傾向于結合（圖3D）。此外，F(xiàn)RAP實驗說明當進行光漂白實驗時，SHP2-mEGFP突變體液滴中的熒光能夠有效的恢復（圖3E），進一步證實SHP2突變體在體外進行典型的LLPS。研究者通過進行不同濃度SHP2突變體和氯化鈉的液滴形成實驗建立了SHP2WT和兩個疾病相關突變體SHP2和SHP2的相圖。研究者觀察到在接近細胞內生理鹽水濃度125mMNaCl存在時，SHP2和SHP2能夠從0.25-0.5mM開始進行LLPS，而SHP2WT的LLPS從2-4mM時開始出現(xiàn)（圖3F）。研究者隨后在多個細胞系中檢測了內源性SHP2的蛋白濃度，結果發(fā)現(xiàn)細胞內SHP2蛋白的濃度大約在0.3-0.4mM。假設SHP2突變發(fā)生在PTPN11的一個等位基因上，內源性SHP2突變體的濃度（0.15-0.2mM）接近體外SHP2突變體LLPS所需要的臨界濃度（圖3F）。然而細胞內SHP2WT的蛋白濃度低于體外SHP2WTLLPS所需要的臨界濃度。這一發(fā)現(xiàn)幫助解釋了為什么細胞內SHP2突變體傾向于形成斑點，而SHP2WT并沒有（圖1A）。總之這些結果說明了體外細胞內疾病相關SHP2突變體和SHP2WT差異的LLPS行為。MSJMMLMutationsSHP2MSHP2D61GSHP2E76AshP2E76KNS-MLMutations5HP2-E76K蕓s罡SHP2-RJ98LSHP2-WTP*al#ricon€sfllraliwiiM>

42105Q25Q12S??0000MSJMMLMutationsSHP2MSHP2D61GSHP2E76AshP2E76KNS-MLMutations5HP2-E76K蕓s罡SHP2-RJ98LSHP2-WTP*al#ricon€sfllraliwiiM>

42105Q25Q12S??0000ooooomHB畤痣珞*Jt1-3E^-CQUraitsEB-urazPrettinwftewiraKWii笈42105D2SQ12S闞i一肌體OO-U6儂00O好00O弛。。OO圖3.疾病相關SHP2突變體促進體外SHP2的LLPS。（A）在10%（w/v）PEG335存在時，8mM重組SHP2以及SHP2-mEGFP蛋白液滴形成的代表圖像，標尺5mm；（B）OD600對SHP2以及SHP2mutEGFP的液滴形成進行量化，***p<0.001（C）SHP2以及SHP2細胞內以及體外LLPS能力的相關性；（D）SHP2的融合，標尺5mm；（E）對SHP2-mEGFP液滴的FRAP數(shù)據(jù)進行定量；（F）濃度范圍在0.125-8mM的SHP2、SHP2以及SHP2蛋白在20mMTris（pH8.0）10%（w/v）PEG3350、以及50—500mMNaCl條件下的相圖，藍點表示沒有相分離，紅點表示相分離。不同條件下SHP2的LLPS能力用色條表示。從關閉到開放的構象轉變促進了$皿2的LLPS之前對SHP2WT、NS/JMML突變體以及NS-ML突變體的結構和生物物理分析發(fā)現(xiàn)，開放構象的傾向程度與N-SH2/PTP結構域界面動態(tài)和溶劑曝光增加、以及N-SH2/PTP結構域間由于突變導致的相互作用減低相關（圖4A、B）。有趣的是，基于氫/氘交換的質譜分析結果（H/DX-MS）對SHP2突變體的開放狀態(tài)進行量化，結果發(fā)現(xiàn)SHP2突變體液滴形成LLPS的能力與它們開放構象的傾向相關，無論是NS/JMML還是NS-ML突變體（圖4C、D）。這一結果暗示從關閉到開放構象的轉變能力決定了SHP2LLPS的潛能。為了驗證這一假說，研究者利用了SHP2變構體抑制劑SHP099,該抑制劑能夠在SHP2自體抑制/關閉的構象中穩(wěn)定SHP2（圖4E）。的確，單分子熒光能量共振轉移實驗（smFRET）說明SHP2主要在開放狀態(tài)存在，然而，添加SHP009后能夠戲劇性的重塑SHP2的構象圖譜轉變?yōu)殛P閉的構象（圖4F）。有趣的是，添加SHP009能夠以劑量依賴的方式顯著減弱SHP2突變體的液滴形成（圖4G、H）。與此一致的是，SHP009處理也能減弱細胞中SHP2突變體斑點的形成（圖41、J）。此外，斑點降低的程度與SHP2抑制的程度相關，例如ET070,相較于SHP009具有更大的SHP2變構抑制作用，對于體外SHP2突變體的LLPS具有更強的抑制作用（圖4G、H）,并且細胞內的強度也大于SHP009（圖41、J）。研究者觀察到在Ptpn11MEFs中的SHP2和Ptpn11MSCs中的SHP2液滴的形成在ET070處理后明顯被抑制。相反，當用刺激肽段2P-IRS-1處理時能夠促進具有相對較弱LLPS能力的SHP2的液滴形成（圖4L、M），該刺激肽段包含bipTyr能夠與N-和C-SH2結構域結合，使N-SH2結構域和PTP結構域之間的分子內相互作用打開（圖4K）。研究者接下來檢測了LLPS是否是SHP2的內在特性以及開放的構象能否驅動SHP2進行LLPS。結果發(fā)現(xiàn)2P-IRS-1也能促進體外SHP2凝結形成。顯著的是，用生長因子例如bFGF以及EGF處理KYSE520細胞能夠誘導SHP2-mEGFP斑點的形成，表明當關閉的構象打開時SHP2能夠進行LLPS。NS/JMMLrmulalionsNS^MLmulatians.E76KQ5D6PItesY279CT468MR4&&LE76KSingleMolecdkfrFREISHPOM0-30l一口M5OM一S法CLOSEDO)占豆WKK--&SOMSONS/JMMLrmulalionsNS^MLmulatians.E76KQ5D6PItesY279CT468MR4&&LE76KSingleMolecdkfrFREISHPOM0-30l一口M5OM一S法CLOSEDO)占豆WKK--&SOMSO圖4.開放構象促進SHP2的LLPS。（A）代表性的疾病相關SHP2突變體，NS/JMML突變體（藍色）以及NS-ML（綠色）；（B）代表SHP2和指定SHP2固有開放構象的體系；（C）體外LLPS能力與SHP2突變體開放性的相關性；（D）在10%（w/v）PEG335存在下重組SHP2-mEGFP蛋白液滴的代表性成像，標尺5mm；（E）圖示說明變構抑制劑SHP099將SHP2封鎖在一個關閉的構象中；（F）單分子FRET結果展示SHP099導致SHP2E76A-87/266的構象變化；（G和H）展示利用SHP099和ET070處理SHP2液滴，OD600測定液滴渾濁度的時間軌跡；（I和J）利用SHP099和ET070處理穩(wěn)定表達SHP2-mEGFP的KYSE520細胞，I圖對斑點/核進行定量，J圖展示了SHP2-mEGFP的成像結果；（K）bis-P肽段與SHP2結合的卡通圖；（L）利用w/o有或無）1mMbis-P肽段處理SHP2蛋白，并且測定液滴的渾濁度，***p<0.001（M）DMSO或者1mMbis-P肽段處理SHP2液滴的成像結果，標尺5mm。PTP結構域能夠驅動靜電相互作用介導的SHP2LLPS研究者接下來探究了SHP2相分離的分子基礎，與大多數(shù)進行LLPS的蛋白不同，SHP2并不包含低復雜度的IDRs或者重復的多價模域。為了鑒定負責SHP2LLPS的結構域，研究者準備了重組全長WTSHP2（FL-SHP2以及三個截斷體SHP2（SHP2DC,N/C-SH2,SHP2-PTR）圖5A）。值得注意的是，相對于FL-SHP2和其他突變體，催化的PTP結構域LLPS的能力更強（圖5B、C）。通過融合實驗發(fā)現(xiàn)SHP2-PTP的液滴發(fā)生融合。有趣的是，變構抑制劑SHP009能夠有效的減弱全長SHP2突變體的LLPS，但是不影響SHP2-PTP的液滴形成。因為PTP結構域的表面包含一些負向和正向的補丁，研究者接下來檢測了靜電相互作用是否參與調節(jié)SHP2LLPS。的確，SHP2-PTP的液滴形成對NaCl濃度升高高度敏感（圖5D）。為了進一步查明調節(jié)SHP2-PTPLLPS的關鍵電荷補丁，研究者構建了分布在SHP2-PTP表面不同電荷補丁的17個SHP2突變體，包括16個雙突變和1個單突變。研究者發(fā)現(xiàn)6個突變體（R362E/K364E,E523K/D437K,E447K/E481K,E441K/D437K,E447K/D451K,區(qū)能夠顯著降低SHP2-PTP液滴形成。其中E523/D437,E447/E481,E441/D437,E447/D4突變體分布在兩個負電荷的補丁（NCPs）上，而R362/K364以及R265坐落在兩個正電荷的補?。≒CPs）上。這些結果表明SHP2-PTP蛋白表面的多個NCPs和PCPs調節(jié)SHP2-PTPLLPS分子間靜電相互作用。不同電荷的補丁中，包含R362/K364的補丁可能發(fā)揮主導作用，因為R362E/K364E突變體在不干擾整體結構或者PTP活性的情況下能夠消除SHP2-PTPLLPS的能力（圖5E、F）。重要的是，引入疾病相關SHP2突變體，R362E/K364E突變體能夠整體地消除細胞內不同SHP2突變體的斑點形成（圖5G）。

圖5.PTP結構域驅動靜電相互作用介導的SHP2LLPS。(A)全長圖5.PTP結構域驅動靜電相互作用介導的SHP2LLPS。(A)全長SHP2以及截斷體SHP2(SHP24C,N/C-SH2以及SHP2-PTP)cFOOMQS適丑mwdE口的圖示；(B)在10%(w/v)PEG3350存在時8mMFL-SHP2、SHP24C、SHP2-PTP、N/C-SH2的代表性成像，標尺5mm；(C)在LLPS緩沖液(10%(w/v)PEG3350)中對8mMFL-SHP2、SHP24C、SHP2-PTP、N/C-SH2液滴濁度的定量，***p<0.001；(D)在指定濃度NaCl中SHP2-PTP形成液滴的代表性成像，標尺5mm；(E)圖示說明R362E/K364E突變體在SHP2-PTP(PDB:4DGP)表面將正電荷轉變?yōu)樨撾姾桑?F)PTP和PTPR362E/K364E微鏡圖像，標尺為5mm；(G)KYSE520細胞中特定突變體SHP2-mEGFP的顯微成像，標尺為10mm。LLPS刺激SHP2PTP活性，對于SHP2突變體誘導的ERK1/2過度活化是必不可少的SHP2是RAS-MAPK信號通路中關鍵的正向調節(jié)因子。由PTPN11突變體導致的NS和NS-ML綜合征屬于一個新分類的常染色體顯性綜合征家族，被稱為“RASopathies”。研究者發(fā)現(xiàn)在細胞中穩(wěn)定表達的NS和NSML突變體SHP2,而不是SHP2能夠提高MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平(圖6A)。值得注意的是，盡管LLPS缺陷的R362E/K364E突變體對SHP2PTP活性沒有影響，它們能夠減弱疾病相關SHP2突變體誘導的ERK1/2活化(圖6B、C)，表明疾病相關SHP2突變體的LLPS對于ERK1/2的過度活化是至關重要的。考慮到LLPS能夠在凝結物中局部濃縮分子加速反應，研究者接下來檢測了LLPS是否能夠促進SHP2的PTP活性。的確，酶學實驗發(fā)現(xiàn)在LLPS條件下SHP2突變體的液滴表現(xiàn)出更穩(wěn)健的PTP活性，相較于對應突變體在溶劑條件下(圖6D)。DiFMUP去磷酸化的產(chǎn)物(DiFMU)，是SHP2體外合成的底物，在SHP2液滴中濃縮(圖6E)，提示在相分離的凝集物中SHP2PTP活性升高。圖6.LLPS刺激SHP2PTP的活性并且在SHP2突變體誘導的ERK過度活化中必不可少。（A）對穩(wěn)轉SHP2以及SHP2HEK293T細胞中指定蛋白進行免疫印跡；（B）對穩(wěn)轉指定SHP2突變體HEK293T細胞中指定蛋白進行免疫印跡；（C）對B中pERK/ERK水平進行光密度檢測，*p<0.05;**p<0.01（D）在LLPS條件下，以對硝基苯磷酸鹽（pNPP）為底物的溶液中SHP2以及SHP2的磷酸化活性檢測；（E）DiFMUP底物中SHP2的液滴圖像。標尺為5mm。NS-MLSHP2突變體的LLPS招募并且活化SHP2促進ERK1/2的活化如圖6D所示，LLPS導致NS-ML突變體中的PTP活性升高，但是仍然弱于SHP2，并不能提供證據(jù)證明MAPK信號通路是通過NS-MLSHP2突變體活化的（圖6A、B）?？紤]到NSML患者是基因雜合突變體的攜帶者，研究者接下來探究了NS-ML突變體SHP2表達的細胞中SHP2WT等位基因是否促進ERK1/2的過度活化。研究者在HEK293T細胞中以1:1的比例轉染SHP2和SHP2，結果發(fā)現(xiàn)pERK1/2的水平明顯高于只有等量SHP2或者SHP2表達的細胞（圖7A）。有趣的是，WT和NS-MLSHP2的比例很重要，因為在親代HEK293T或者SHP2KOHEK293T細胞中轉染時SHP2和SHP2的水平大約相等時ERK1/2最大程度的活化（圖7B、C）。此外，研究者構建了Tet誘導的SHP2-mEGFP穩(wěn)轉的KYSE520細胞系，并且用不同濃度的多西環(huán)素對SHP2-mEGFP的表達進行滴定。當SHP2-mEGFP的表達水平與內源性SHP2相同時，pERK1/2的水平到達高點。這些結果表明WT和NS-ML突變體SHP2之間的相互作用是ERK1/2過度活化機制的基礎，正如敲入動物模型和NS-ML患者特異的誘導型多能干細胞（iPSCs）中報道的一樣NS-MLSHP2突變體能夠過度活化RAS-MAPK。研究者隨后探究了NS-ML突變體SHP2是否能夠形成凝集物招募SHP2并且促進ERK1/2的活化。研究者的確觀察到在SHP2自身不足以形成液滴的條件下，SHP2已經(jīng)被分布到NS-ML突變體SHP2液滴中（圖7D）。盡管與單獨的突變體SHP2相比，WT/突變體SHP2混合物整體的液滴形成能力折中，顯著的一部分SHP2s在突變體SHP2液滴中富集。在光漂白后SHP2迅速恢復。值得注意的是，相較于每個蛋白的液滴，包含WT和NS-ML突變體SHP2混合物的液滴具有更強的PTP活性（圖7E）。研究者進一步檢測了SH