(生化工程課件)16-沉淀法

16沉淀法16沉淀法1知識點：鹽析法，等電點沉淀法，有機溶劑沉淀法，非離子型聚合物沉淀法,聚電解質沉淀法,金屬離子沉淀法。重點：上述幾種沉淀方法的概念、原理及其適用范圍；鹽析法的影響因素對沉淀效果的影響，并能根據(jù)實際情況予以靈活應用和選擇。難點：常用沉淀方法的靈活運用。知識點：鹽析法，等電點沉淀法，有機溶劑沉淀法，非離子型聚合2根據(jù)沉淀劑的不同鹽析法等電點沉淀法有機溶劑沉淀法非離子型聚合物沉淀法聚電解質沉淀法高價金屬離子沉淀法根據(jù)沉淀劑的不同3

1．鹽析法多用于各種蛋白質和酶的分離純化。

2．有機溶劑沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸產品的分離純化，有時也用于蛋白質沉淀。

3．等電點沉淀法用于氨基酸、蛋白質及其它兩性物質的沉淀。但此法單獨應用較少，多與其它方法結合使用。

4．非離子多聚體沉淀法用于分離生物大分子。

5．生成鹽復合物沉淀用于多種化合物，特別是小分子物質的沉淀。

6．熱變性及酸堿變性沉淀法用于選擇性的除去某些不耐熱及在一定PH值下易變性的雜蛋白。1．鹽析法多用于各種蛋白質和酶的分離純化。416.1鹽析法定義-向蛋白質溶液中加入高濃度的中性鹽,以破壞蛋白質膠體性質，使蛋白質的溶解度降低而從溶液中析出的現(xiàn)象16.1鹽析法定義-向蛋白質溶液中加入高濃度的中516.1.1Cohn方程式離子強度對鹽析過程的影響Cohn經驗公式S—蛋白質溶解度，mol/L;I—離子強度c:離子濃度；Z：離子化合價M為鹽的摩爾濃度16.1.1Cohn方程式離子強度對鹽析過程的影6(生化工程課件)16--沉淀法7β和Ks的物理意義β—鹽濃度為0時，蛋白質溶解度的對數(shù)值，與蛋白質種類、溫度、pH值有關，與鹽無關；Ks—鹽析常數(shù)，與蛋白質和無機鹽的種類有關，與溫度、pH值無關。β和Ks的物理意義8pH值和溫度的影響β隨pH變化（1）對數(shù)關系（2）等電點附近有極小值β隨溫度變化隨溫度升高減小，熱促失水膜鹽析注意事項：(1)穩(wěn)定pH用磷酸緩沖液（2）硫酸銨加入后體積變大（3）選擇飽和度（4）分步鹽析（5）初始蛋白濃度pH值和溫度的影響β隨pH變化9用鹽析分離蛋白質方法（1）Ks鹽析：固定pH,溫度，改變鹽濃度（2）β鹽析：固定離子強度，改變pH及溫度。用鹽析分離蛋白質方法（1）Ks鹽析：固定pH,溫度，改10陰陽離子鹽析效果陰離子鹽析效果：檸檬酸＞PO43-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-陽離子鹽析效果：NH4+＞K+＞Na+＞高價陽離子硫酸銨：（1）價廉；（2）溶解度大，穩(wěn)定蛋白質；（3）水解變酸；（4）高pH釋氨，腐蝕；（5）殘留產品有影響。陰陽離子鹽析效果陰離子鹽析效果：11(生化工程課件)16--沉淀法1216.1.2pH和溫度的影響16.1.2pH和溫度的影響13β值，Ks溫度β值，Ks溫度1416.1.3(NH4)2SO4

鹽析法實際應用時的注意點幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水）

0℃20℃80℃100℃（NH4）2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.810116.1.3(NH4)2SO4鹽析法實際應用時的注意點15先除去雜蛋白，然后在較高的飽和度下，沉淀目標蛋白，操作步驟如下先除去雜蛋白，然后在較高的飽和度下，沉淀目標蛋白，操作步驟如16

硫酸銨的最終濃度（％飽和）硫酸銨的初始濃度（％）

10202530333540455055606570758090100

1L中應加硫酸銨的量

g05611414417619620924327731335139043047251656166276710

578611813715018321625128832636540644949459269420

2959789112315518922526230034038242452061925

3049619312515819323026730734839048558330

1930629412716219823527331435644954633

12437410714217721425229233342652235

31639412916420023827831941150640

31639713216820524528537546945

32659913417121025033943150

336610113717621430239255

336710314117926435360

346910514322731465

347010719027570

357215323775

3611519880

7715790

硫酸銨的最終濃度（％飽和）硫酸銨的初始濃度（％）102017(生化工程課件)16--沉淀法1816．1.4起始濃度的影響16．1.4起始濃度的影響19(生化工程課件)16--沉淀法2016.1.5鹽析的機理16.1.5鹽析的機理2116.4蛋白質鹽析機理：（1）破壞水化膜，（2）中和電荷鹽析經驗式鹽溶鹽析飽和度

中性鹽的鹽析效果16.4蛋白質鹽析機理：22蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性兩性電解質，由于靜電力的作用，分子間相互排斥，形成穩(wěn)定的分散系蛋白質周圍形成水化膜，保護了蛋白質粒子，避免了相互碰撞蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性兩性電解質，由于靜電力的作用，分子間相23鹽析過程當中性鹽加入蛋白質分散體系時可能出現(xiàn)以下兩種情況：（1）“鹽溶”現(xiàn)象—低鹽濃度下，蛋白質溶解度增大（2）“鹽析”現(xiàn)象—高鹽濃度下，蛋白質溶解度隨之下降，原因如下：無機離子與蛋白質表面電荷中和，形成離子對，部分中和了蛋白質的電性，使蛋白質分子之間的排斥力減弱，從而能夠相互靠攏；中性鹽的親水性大，使蛋白質脫去水化膜，疏水區(qū)暴露，由于疏水區(qū)的相互作用導致沉淀；鹽析過程當中性鹽加入蛋白質分散體系時可能出現(xiàn)以下兩種情況：24(生化工程課件)16--沉淀法25(生化工程課件)16--沉淀法26(生化工程課件)16--沉淀法27

16.2等電點沉淀原理： 蛋白質是兩性電解質，當溶液pH值處于等電點時，分子表面凈電荷為0，雙電層和水化膜結構被破壞，由于分子間引力，形成蛋白質聚集體，進而產生沉淀。概念： 調節(jié)體系pH值，使兩性電解質的溶解度下降，析出的操作稱為等電點沉淀。16.2等電點沉淀原理：28(生化工程課件)16--沉淀法29（1）適用于疏水性強的蛋白（2）中性鹽濃度增大時，等電點向偏酸方向移動，溶解度增大（4）價廉價，無毒（5）蛋白對低pH敏感，易失活（1）適用于疏水性強的蛋白30由于在等電點附近，溶質仍然有一定的溶解度，等電點沉淀法往往不能獲得高的回收率，因此等電點沉淀法通常與鹽析、有機溶劑沉淀法聯(lián)合使用操作時的注意事項：（1）由于無機離子的影響，蛋白質的等電點通常會發(fā)生“漂移”，陽-高，陰-低（2）溶質的穩(wěn)定性（3）鹽析效應由于在等電點附近，溶質仍然有一定的溶解度，等電點沉淀法往往不31

16.3有機溶劑沉淀法概念：在含有溶質的水溶液中加入一定量親水的有機溶劑，降低溶質的溶解度，使其沉淀析出。原理：（1）降低了溶質的介電常數(shù)，使溶質之間的靜電引力增加，從而出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，導致沉淀。（2）由于有機溶劑的水合作用，降低了自由水的濃度，降低了親水溶質表面水化層的厚度，降低了親水性，導致脫水凝聚。16.3有機溶劑沉淀法概念：在含有溶質的水溶液中加入32常用的有機溶劑沉析劑乙醇：沉析作用強，揮發(fā)性適中，無毒常用于蛋白質、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更強，用量省，但毒性大，應用范圍不廣；特點：介電常數(shù)小，60%乙醇的介電常數(shù)是48 丙酮的介電常數(shù)是22容易獲取常用的有機溶劑沉析劑33有機溶劑中的蛋白質沉淀有機溶劑中的蛋白質沉淀34有機溶劑沉淀法的優(yōu)點溶劑易揮發(fā)，適于制備食品蛋白；溶劑密度低，便于離心分離；有機溶劑沉淀法的優(yōu)點易使蛋白質變性易燃易爆，安全要求高有機溶劑沉淀法的優(yōu)點溶劑易揮發(fā)，適于制備食品蛋白；35溶劑選擇介電常數(shù)要小致變性作用要小（甲醇）毒性要小、揮發(fā)性適中水溶性要好溶劑選擇介電常數(shù)要小36有機溶劑沉淀時，應注意點溫度：低溫有利于防止溶質變性；有利于提高收率（溶解度下降）；溶劑的選擇：和水互溶，與蛋白質不反應。乙醇，蛋白質分子量：分子量越大，溶劑量就越少一種蛋白質的溶解度會由于另一種的存在而降低沉淀的蛋白質若不能再溶解，就可能已經變性接近等電點，沉淀所需溶劑量減少溶液pH值：原則是避免目標蛋白與雜質帶有相反的電荷，防止共沉現(xiàn)象。（pI）離子強度:離子強度低有利于沉析，0.01~0.05mol/L樣品濃度:0.5~2%?。喝軇┯昧看螅厥章实?，但共沉淀作用小濃：節(jié)省溶劑用量，共沉作用強，分辨率低金屬離子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+有機溶劑沉淀時，應注意點溫度：低溫有利于防止溶質變性；有利于3716.4非離子型聚合物沉淀法優(yōu)點：a室溫b顆粒大，易于收集c提高蛋白質的穩(wěn)定性dPEG難去除機理：PEG分子從溶劑排斥蛋白質，優(yōu)先水合。16.4非離子型聚合物沉淀法優(yōu)點：a室溫b顆粒大，3816.5聚電解質沉淀機理：靜電與架橋聚丙烯酸（pH2.890%蛋白沉淀）聚甲基丙烯酸聚乙烯亞胺聚苯乙烯季胺鹽（pH10.4,95%蛋白沉淀）16.5聚電解質沉淀機理：靜電與架橋39(生化工程課件)16--沉淀法4016.9金屬離子沉淀Ca2+Zn2+Mg2+16.9金屬離子沉淀Ca2+41Zn離子沉淀尿激酶Zn離子沉淀尿激酶42硫酸銨溶解尿激酶鋅絡合物硫酸銨的選用1)它在低濃度時可能有鹽溶作用，促進沉淀蛋白溶解；2)因為本身有NH4+，與Zn2+有絡合作用，有利于沉淀物溶解；3)硫酸銨為鹽析所用，在最終鹽析中，只需補加規(guī)定量即可，而不引人其他成分。硫酸銨溶解尿激酶鋅絡合物硫酸銨的選用43思考題：1理解概念：硫酸銨飽和度，鹽溶，鹽析2沉淀與結晶有何不同？3有機溶劑沉淀蛋白質的機理什么？用乙醇沉淀蛋白質時應注意哪些事項？思考題：1理解概念：硫酸銨飽和度，鹽溶，鹽析4416沉淀法16沉淀法45知識點：鹽析法，等電點沉淀法，有機溶劑沉淀法，非離子型聚合物沉淀法,聚電解質沉淀法,金屬離子沉淀法。重點：上述幾種沉淀方法的概念、原理及其適用范圍；鹽析法的影響因素對沉淀效果的影響，并能根據(jù)實際情況予以靈活應用和選擇。難點：常用沉淀方法的靈活運用。知識點：鹽析法，等電點沉淀法，有機溶劑沉淀法，非離子型聚合46根據(jù)沉淀劑的不同鹽析法等電點沉淀法有機溶劑沉淀法非離子型聚合物沉淀法聚電解質沉淀法高價金屬離子沉淀法根據(jù)沉淀劑的不同47

1．鹽析法多用于各種蛋白質和酶的分離純化。

2．有機溶劑沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸產品的分離純化，有時也用于蛋白質沉淀。

3．等電點沉淀法用于氨基酸、蛋白質及其它兩性物質的沉淀。但此法單獨應用較少，多與其它方法結合使用。

4．非離子多聚體沉淀法用于分離生物大分子。

5．生成鹽復合物沉淀用于多種化合物，特別是小分子物質的沉淀。

6．熱變性及酸堿變性沉淀法用于選擇性的除去某些不耐熱及在一定PH值下易變性的雜蛋白。1．鹽析法多用于各種蛋白質和酶的分離純化。4816.1鹽析法定義-向蛋白質溶液中加入高濃度的中性鹽,以破壞蛋白質膠體性質，使蛋白質的溶解度降低而從溶液中析出的現(xiàn)象16.1鹽析法定義-向蛋白質溶液中加入高濃度的中4916.1.1Cohn方程式離子強度對鹽析過程的影響Cohn經驗公式S—蛋白質溶解度，mol/L;I—離子強度c:離子濃度；Z：離子化合價M為鹽的摩爾濃度16.1.1Cohn方程式離子強度對鹽析過程的影50(生化工程課件)16--沉淀法51β和Ks的物理意義β—鹽濃度為0時，蛋白質溶解度的對數(shù)值，與蛋白質種類、溫度、pH值有關，與鹽無關；Ks—鹽析常數(shù)，與蛋白質和無機鹽的種類有關，與溫度、pH值無關。β和Ks的物理意義52pH值和溫度的影響β隨pH變化（1）對數(shù)關系（2）等電點附近有極小值β隨溫度變化隨溫度升高減小，熱促失水膜鹽析注意事項：(1)穩(wěn)定pH用磷酸緩沖液（2）硫酸銨加入后體積變大（3）選擇飽和度（4）分步鹽析（5）初始蛋白濃度pH值和溫度的影響β隨pH變化53用鹽析分離蛋白質方法（1）Ks鹽析：固定pH,溫度，改變鹽濃度（2）β鹽析：固定離子強度，改變pH及溫度。用鹽析分離蛋白質方法（1）Ks鹽析：固定pH,溫度，改54陰陽離子鹽析效果陰離子鹽析效果：檸檬酸＞PO43-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-陽離子鹽析效果：NH4+＞K+＞Na+＞高價陽離子硫酸銨：（1）價廉；（2）溶解度大，穩(wěn)定蛋白質；（3）水解變酸；（4）高pH釋氨，腐蝕；（5）殘留產品有影響。陰陽離子鹽析效果陰離子鹽析效果：55(生化工程課件)16--沉淀法5616.1.2pH和溫度的影響16.1.2pH和溫度的影響57β值，Ks溫度β值，Ks溫度5816.1.3(NH4)2SO4

鹽析法實際應用時的注意點幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水）

0℃20℃80℃100℃（NH4）2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.810116.1.3(NH4)2SO4鹽析法實際應用時的注意點59先除去雜蛋白，然后在較高的飽和度下，沉淀目標蛋白，操作步驟如下先除去雜蛋白，然后在較高的飽和度下，沉淀目標蛋白，操作步驟如60

硫酸銨的最終濃度（％飽和）硫酸銨的初始濃度（％）

10202530333540455055606570758090100

1L中應加硫酸銨的量

g05611414417619620924327731335139043047251656166276710

578611813715018321625128832636540644949459269420

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31639713216820524528537546945

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硫酸銨的最終濃度（％飽和）硫酸銨的初始濃度（％）102061(生化工程課件)16--沉淀法6216．1.4起始濃度的影響16．1.4起始濃度的影響63(生化工程課件)16--沉淀法6416.1.5鹽析的機理16.1.5鹽析的機理6516.4蛋白質鹽析機理：（1）破壞水化膜，（2）中和電荷鹽析經驗式鹽溶鹽析飽和度

中性鹽的鹽析效果16.4蛋白質鹽析機理：66蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性兩性電解質，由于靜電力的作用，分子間相互排斥，形成穩(wěn)定的分散系蛋白質周圍形成水化膜，保護了蛋白質粒子，避免了相互碰撞蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性兩性電解質，由于靜電力的作用，分子間相67鹽析過程當中性鹽加入蛋白質分散體系時可能出現(xiàn)以下兩種情況：（1）“鹽溶”現(xiàn)象—低鹽濃度下，蛋白質溶解度增大（2）“鹽析”現(xiàn)象—高鹽濃度下，蛋白質溶解度隨之下降，原因如下：無機離子與蛋白質表面電荷中和，形成離子對，部分中和了蛋白質的電性，使蛋白質分子之間的排斥力減弱，從而能夠相互靠攏；中性鹽的親水性大，使蛋白質脫去水化膜，疏水區(qū)暴露，由于疏水區(qū)的相互作用導致沉淀；鹽析過程當中性鹽加入蛋白質分散體系時可能出現(xiàn)以下兩種情況：68(生化工程課件)16--沉淀法69(生化工程課件)16--沉淀法70(生化工程課件)16--沉淀法71

16.2等電點沉淀原理： 蛋白質是兩性電解質，當溶液pH值處于等電點時，分子表面凈電荷為0，雙電層和水化膜結構被破壞，由于分子間引力，形成蛋白質聚集體，進而產生沉淀。概念： 調節(jié)體系pH值，使兩性電解質的溶解度下降，析出的操作稱為等電點沉淀。16.2等電點沉淀原理：72(生化工程課件)16--沉淀法73（1）適用于疏水性強的蛋白（2）中性鹽濃度增大時，等電點向偏酸方向移動，溶解度增大（4）價廉價，無毒（5）蛋白對低pH敏感，易失活（1）適用于疏水性強的蛋白74由于在等電點附近，溶質仍然有一定的溶解度，等電點沉淀法往往不能獲得高的回收率，因此等電點沉淀法通常與鹽析、有機溶劑沉淀法聯(lián)合使用操作時的注意事項：（1）由于無機離子的影響，蛋白質的等電點通常會發(fā)生“漂移”，陽-高，陰-低（2）溶質的穩(wěn)定性（3）鹽析效應由于在等電點附近，溶質仍然有一定的溶解度，等電點沉淀法往往不75

16.3有機溶劑沉淀法概念：在含有溶質的水溶液中加入一定量親水的有機溶劑，降低溶質的溶解度，使其沉淀析出。原理：（1）降低了溶質的介電常數(shù)，使溶質之間的靜電引力增加，從而出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，導致沉淀。（2）由于有機溶劑的水合作用，降低了自由水的濃度，降低了親水溶質表面水化層的厚度，降低了親水性，導致脫水凝聚。16.3有機溶劑沉淀法概念：在含有溶質的水溶液中加入76常用的有機溶劑沉析劑乙醇：沉析作用強，揮發(fā)性適中，無毒常用于蛋白質、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更強，用量省，但毒性大，應用范圍不廣；特點：介電常數(shù)小，60%乙醇的介電常數(shù)是48 丙酮的介電常數(shù)是22容易獲取常用的有機溶劑沉析劑77有機溶劑中的蛋白質沉淀有機溶劑中的蛋白質沉淀78有機溶劑沉淀法的優(yōu)點溶劑易揮發(fā)，適于制備食品蛋白；溶劑密度低，便于離心分離；有機溶劑沉淀法的