DNA測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用課件

DNA測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用.pptDNA測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用.ppt1234引言第三代測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用與展望第一代測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序技術(shù)51234引言第三代測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用與展望第一代測(cè)序技術(shù)1引言

DNA序列測(cè)定的意義

DNA的序列測(cè)定是分子生物學(xué)研究中的一項(xiàng)非常重要的和關(guān)鍵的內(nèi)容。如在基因的分離、定位、基因結(jié)構(gòu)與功能的研究、基因工程中載體的組建、基因表達(dá)與調(diào)控、基因片段的合成和探針的制備、基因與疾病的關(guān)系等等，都要求對(duì)DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的詳細(xì)了解。1引言DNA序列測(cè)定的意義造福人類(lèi)的HGP

人類(lèi)基因組計(jì)劃（HumanGenomeProject－HGP）于1990年正式啟動(dòng)，其主要目標(biāo)有：識(shí)別人類(lèi)DNA中所有基因（超過(guò)10萬(wàn)個(gè)）；測(cè)定組成人類(lèi)DNA的30億堿基對(duì)的序列；將這些信息儲(chǔ)存到數(shù)據(jù)庫(kù)中；開(kāi)發(fā)出有關(guān)數(shù)據(jù)分析工具；致力于解決該計(jì)劃可能引發(fā)的倫理、法律和社會(huì)問(wèn)題。已于2003年完成。人類(lèi)基因組計(jì)劃是當(dāng)代生命科學(xué)一項(xiàng)偉大的科學(xué)工程，它奠定了21世紀(jì)生命科學(xué)發(fā)展和現(xiàn)代醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)，具有科學(xué)上的巨大意義和商業(yè)上的巨大價(jià)值。造福人類(lèi)的HGP人類(lèi)基因組計(jì)劃（Human

DNA測(cè)序技術(shù)的歷史與發(fā)展測(cè)序技術(shù)最早可以追溯到20世紀(jì)50年代。早在1945年就已經(jīng)出現(xiàn)了關(guān)于早期測(cè)序技術(shù)的報(bào)導(dǎo)，即Whitfeld等用化學(xué)降解的方法測(cè)定多聚核糖核苷酸序列。1977年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學(xué)降解法，標(biāo)志著第一代測(cè)序技術(shù)的誕生。此后在三十幾年的發(fā)展中陸續(xù)產(chǎn)生了第二代測(cè)序技術(shù)，包括Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)。DNA測(cè)序技術(shù)的歷史與發(fā)展測(cè)序技術(shù)最早可以追DNA測(cè)序技術(shù)的歷史與發(fā)展最近，Helicos公司的單分子測(cè)序技術(shù)、PacificBiosciences公司的單分子實(shí)時(shí)(SingleMoleculeRealTime,SMRT)測(cè)序技術(shù)和OxfordNanoporeTechnologies公司正在研究的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)被認(rèn)為是第三代測(cè)序技術(shù)。測(cè)序技術(shù)正在向著高通量、低成本、長(zhǎng)讀取長(zhǎng)度的方向發(fā)展。DNA測(cè)序技術(shù)的歷史與發(fā)展最近，Helicos公司的2.第一代測(cè)序技術(shù)2.第一代測(cè)序技術(shù)

化學(xué)降解法

基本原理：利用特異的選擇性試劑，專(zhuān)一性的隨機(jī)斷裂DNA成不同長(zhǎng)短的片段。根據(jù)試劑的選擇性及片段在高分辨力的聚丙烯酰胺凝膠電泳上的區(qū)帶位置，判斷DNA片段末端核苷酸的種類(lèi)，從而測(cè)出DNA的序列。

化學(xué)降解法

基本原理：利用特異的選擇性試劑，專(zhuān)一性的隨機(jī)斷技術(shù)路線將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂湣總€(gè)單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標(biāo)記,以便顯示DNA條帶↓分別用不同方法處理,獲得只差一個(gè)核苷酸的降解DNA群體↓電泳,讀取DNA的核苷酸順序技術(shù)路線將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂淒NA測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用課件化學(xué)降解法剛問(wèn)世時(shí)，準(zhǔn)確性較好，也容易為普通研究人員所掌握，因此用得較多。而且化學(xué)降解較之鏈終止法具有一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)，即所測(cè)序列來(lái)自原DNA分子而不是酶促合成產(chǎn)生的拷貝，排除了合成時(shí)造成的錯(cuò)誤。但化學(xué)降解法操作過(guò)程較麻煩，且用到放射性物質(zhì)，逐漸被簡(jiǎn)便快速的Sanger法所代替。化學(xué)降解法剛問(wèn)世時(shí)，準(zhǔn)確性較好，也容易為普通研究人員所掌握，雙脫氧鏈終止法又稱(chēng)為Sanger法。原理：利用DNA聚合酶，以待測(cè)單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，設(shè)立四種相互獨(dú)立的測(cè)序反應(yīng)體系，在每個(gè)反應(yīng)體系中加入不同的雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）作為鏈延伸終止劑。在測(cè)序引物引導(dǎo)下，通過(guò)高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測(cè)后，合成鏈序列，由此推知待測(cè)模板鏈的序列。雙脫氧鏈終止法又稱(chēng)為Sanger法。雙脫氧鏈末端終止法測(cè)序原理示意圖雙脫氧鏈末端終止法測(cè)序原理示意圖POHdNTPddNTPPOHOHPPPPOHPOHdNTPddNTPPOHOHPPPPOH

Sanger法因操作簡(jiǎn)便，得到廣泛的應(yīng)用。后來(lái)在此基礎(chǔ)上發(fā)展出多種DNA測(cè)序技術(shù)，其中最重要的是熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)。DNA測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用課件熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)基于Sanger原理，用熒光標(biāo)記代替同位素標(biāo)記，并用成像系統(tǒng)自動(dòng)檢測(cè)，從而大大提高了DNA測(cè)序的速度和準(zhǔn)確性。目前，應(yīng)用最廣泛的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystems，ABI)3730系列自動(dòng)測(cè)序儀即是基于毛細(xì)管電泳和熒光標(biāo)記技術(shù)的DNA測(cè)序儀。熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)基于Sanger原理，用熒光DNA測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用課件3730

全自動(dòng)測(cè)序儀3730

全自動(dòng)測(cè)序儀雜交測(cè)序技術(shù)該方法不同于化學(xué)降解法和Sanger法，是利用DNA雜交原理，將一系列已知序列的單鏈寡核苷酸片段固定在基片上，把待測(cè)的DNA樣品片段變性后與其雜交，根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。雜交測(cè)序技術(shù)該方法不同于化學(xué)降解法和Sanger法，是利用D雜交測(cè)序檢測(cè)速度快，采用標(biāo)準(zhǔn)化的高密度寡核苷酸芯片能夠大幅度降低檢測(cè)的成本，具有部分第二代測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)。但該方法誤差較大，且不能重復(fù)測(cè)定。通過(guò)幾十年的逐步改進(jìn),第1代測(cè)序儀的讀長(zhǎng)可以超過(guò)1000bp,原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率可以高達(dá)99.999%,測(cè)定每千堿基序列的成本是0.5美元,每天的數(shù)據(jù)通量可以達(dá)到600000堿基。雜交測(cè)序檢測(cè)速度快，采用標(biāo)準(zhǔn)化的高密度寡核苷酸芯片能夠大幅度第一代測(cè)序技術(shù)在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮過(guò)重要的作用,如人類(lèi)基因組計(jì)劃(humangenomeproject,HGP)主要基于第一代DNA測(cè)序技術(shù)。目前基于熒光標(biāo)記和Sanger的雙脫氧鏈終止法原理的熒光自動(dòng)測(cè)序儀仍被廣泛地應(yīng)用。第一代測(cè)序技術(shù)在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮過(guò)重要的作用,如2.第二代測(cè)序技術(shù)盡管第一代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類(lèi)基因組草圖等大量的測(cè)序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的測(cè)序方法。隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成，后基因組時(shí)代，即功能基因組時(shí)代已向我們走來(lái)。第一代測(cè)序方法已經(jīng)不能滿(mǎn)足深度測(cè)序和重復(fù)測(cè)序等大規(guī)?；蚪M測(cè)序的需求，這促使了第二代測(cè)序，又稱(chēng)下一代測(cè)序(next—generationsequencing)的誕生。第二代測(cè)序技術(shù)包括：454測(cè)序技術(shù)、Solexa測(cè)序技術(shù)和SOLiD測(cè)序技術(shù)。2.第二代測(cè)序技術(shù)盡管第一代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)幫助人們完成了從噬菌過(guò)程概述基因組DNA

DNA片段（cDNA）構(gòu)建ssDNA文庫(kù)測(cè)序（聚合酶合成測(cè)序，連接酶合成測(cè)序）由于所有的克隆都在同一平面上，這些反應(yīng)就能夠大規(guī)模平行進(jìn)行，每個(gè)延伸反應(yīng)所摻入的熒光標(biāo)記的成像檢測(cè)也能同時(shí)進(jìn)行，從而獲得測(cè)序數(shù)據(jù)。DNA序列延伸和成像檢測(cè)不斷重復(fù)，最后經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)分析就可以獲得完整的DNA序列信息。

限制性?xún)?nèi)切酶酶切片段兩端加上不同的接頭固定，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增過(guò)程概述基因組DNA限制性?xún)?nèi)切酶酶切片段兩端加上不同的接2.1

454測(cè)序技術(shù)原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的作用下，將每一個(gè)dNTP的聚合與一次化學(xué)發(fā)光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的有無(wú)和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)檢測(cè)DNA序列的目的。2.1454測(cè)序技術(shù)原理：原理圖：構(gòu)建文庫(kù)DNA磁珠捕獲與PCR擴(kuò)增測(cè)序焦磷酸測(cè)序聚合酶硫化酶熒光素酶原理圖：構(gòu)建文庫(kù)DNA磁珠捕獲與PCR擴(kuò)增測(cè)序焦磷酸測(cè)序聚合測(cè)序數(shù)據(jù)輸出：測(cè)序數(shù)據(jù)輸出：指示器相機(jī)PTP盒指示器相機(jī)PTP盒454測(cè)序法的突出優(yōu)勢(shì)是較長(zhǎng)的讀長(zhǎng)，目前GSFLX測(cè)序系統(tǒng)的序列讀長(zhǎng)已超過(guò)400bp。雖然454平臺(tái)的測(cè)序成本比其他新一代測(cè)序平臺(tái)要高很多，但對(duì)于那些需要長(zhǎng)讀長(zhǎng)的應(yīng)用，如從頭測(cè)序，它仍是最理想的選擇。缺點(diǎn)是無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)量同聚物的長(zhǎng)度。小結(jié)454測(cè)序法的突出優(yōu)勢(shì)是較長(zhǎng)的讀長(zhǎng)，目前GSFLX2.2Solexa測(cè)序技術(shù)

Illumina公司的新一代測(cè)序儀GenomeAnalyzer最早由Solexa公司研發(fā)，利用合成測(cè)序(SequencingbySynthesis)的原理，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化樣本制備及大規(guī)模平行測(cè)序。原理：將基因組DNA的隨機(jī)片段附著到光學(xué)透明的玻璃表面（即Flowcell），這些DNA片段經(jīng)過(guò)延伸和橋式擴(kuò)增后，在Flowcell上形成了數(shù)以?xún)|Cluster，每個(gè)Cluster是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團(tuán)的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過(guò)可逆性終止的SBS（邊合成邊測(cè)序）技術(shù)對(duì)待測(cè)的模板DNA進(jìn)行測(cè)序。2.2Solexa測(cè)序技術(shù)Illumina公司的新一代原理圖構(gòu)建ssDNA文庫(kù)單鏈DNA與流動(dòng)槽附著B(niǎo)ridgePCRDNA簇線性化測(cè)序原理圖構(gòu)建ssDNA文庫(kù)單鏈DNA與流動(dòng)槽附著B(niǎo)rid測(cè)序過(guò)程：dNTP的3‘羥基被化學(xué)方法保護(hù)每輪合成反應(yīng)只能添加一個(gè)堿基測(cè)序過(guò)程：dNTP的3‘羥基被化學(xué)方法保護(hù)每輪合成反應(yīng)只能添測(cè)序過(guò)程：測(cè)序過(guò)程：

GenomeAnalyzer系統(tǒng)需要的樣品量低至100ng，文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程簡(jiǎn)單，減少了樣品分離和制備的時(shí)間，配對(duì)末端讀長(zhǎng)可達(dá)到2×50bp，每次運(yùn)行后可獲得超過(guò)20GB的高質(zhì)量過(guò)濾數(shù)據(jù)，且運(yùn)行成本較低，是性?xún)r(jià)比較高的新一代測(cè)序技術(shù)。小結(jié)GenomeAnalyzer系統(tǒng)需要的樣品量低至102.3SOLiD技術(shù)

SOLID通過(guò)連接反應(yīng)進(jìn)行測(cè)序。其基本原理是以四色熒光標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行多次連接合成，取代傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)。具體步驟包括：文庫(kù)準(zhǔn)備擴(kuò)增微珠與玻片連接連接測(cè)序與454測(cè)序類(lèi)似2.3SOLiD技術(shù)SOLID通過(guò)連接反應(yīng)進(jìn)行測(cè)SOLiD系統(tǒng)與454測(cè)序系統(tǒng)相比，每張玻片能容納更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實(shí)現(xiàn)更高的通量。SOLiD系統(tǒng)與454測(cè)序系統(tǒng)相比，每張玻片能容納更測(cè)序過(guò)程：連接酶八聚核苷酸模板通用測(cè)序引物n測(cè)序過(guò)程：連接酶八聚核苷酸模板通用測(cè)序引物nDNA測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用課件

超高通量是SOLID系統(tǒng)最突出的特點(diǎn)，目前SOLID3單次運(yùn)行可產(chǎn)生50GB的序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于17倍人類(lèi)基因組覆蓋度。小結(jié)超高通量是SOLID系統(tǒng)最突出的特點(diǎn)，目前SOLID表1三種二代測(cè)序技術(shù)對(duì)比表1三種二代測(cè)序技術(shù)對(duì)比4.第三代DNA測(cè)序技術(shù)第二代的高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)得到了很好的發(fā)展和應(yīng)用,但是由于其測(cè)序速度、成本、準(zhǔn)確度等關(guān)鍵問(wèn)題的解決仍存在困難,研究者們很快將目光轉(zhuǎn)向了更高更新的測(cè)序解決方案。單分子測(cè)序也就應(yīng)運(yùn)而生。

2009年12月,中科院北京基因組研究所與浪潮成立“中科院北京基因組研究所—浪潮基因組科學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室”4.第三代DNA測(cè)序技術(shù)第二代的高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)三代測(cè)序技術(shù)是以單分子測(cè)序?yàn)樘攸c(diǎn)的測(cè)序技術(shù)單分子即時(shí)DNA測(cè)序技術(shù)(SMRT)

HeliScope單分子測(cè)序基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的即時(shí)DNA測(cè)序納米孔單分子測(cè)序技術(shù)三代測(cè)序技術(shù)是以單分子測(cè)序?yàn)樘攸c(diǎn)的測(cè)序技術(shù)第三代測(cè)序技術(shù)1、目前一期的讀取速度為3bp/s2、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的processivity（延續(xù)性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很長(zhǎng)的片段），一個(gè)反應(yīng)就可以測(cè)非常長(zhǎng)的序列。3、它的精度非常高，達(dá)到99.9999%。第三代測(cè)序技術(shù)標(biāo)記熒光基因DNA聚合酶作用

顯微鏡下進(jìn)行熒光探測(cè)

零級(jí)波導(dǎo)的納米結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)即時(shí)觀察和背景熒光干擾4.1

單分子即時(shí)DNA測(cè)序技術(shù)標(biāo)記熒光基因DNA聚合酶作用顯微鏡下進(jìn)行熒光探測(cè)零級(jí)波導(dǎo)零級(jí)波導(dǎo)的納米結(jié)構(gòu)小孔的尺寸低于光的波長(zhǎng)，小孔底部形成消逝波，創(chuàng)造很小體積的檢測(cè)空間DNA鏈周?chē)坞x的熒光標(biāo)記dNTP有限，非常快速進(jìn)出于小孔，穩(wěn)定的背景熒光信號(hào)熒光標(biāo)記dNTP被摻入到DNA合成鏈，其攜帶的特定熒光會(huì)持續(xù)一小段時(shí)間(熒光光曝)DNA聚合酶零級(jí)波導(dǎo)的納米結(jié)構(gòu)DNA聚合酶

4.2

HeliScope單分子測(cè)序

優(yōu)點(diǎn)：采用了一種新的熒光類(lèi)似物和更加靈敏的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，能夠直接記錄到單個(gè)堿基的熒光，從而克服了第二代測(cè)序必須用PCR擴(kuò)增出數(shù)千個(gè)拷貝以增加信號(hào)亮度的缺陷。DNA聚合酶熒光標(biāo)記的dNTP產(chǎn)生熒光CCD記錄發(fā)生了堿基延伸反應(yīng)平面基板模擬圖4.2HeliSco4.3基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的即時(shí)DNA測(cè)序

熒光供體

DNA聚合酶

熒光受體

4種dNTP熒光共振能量轉(zhuǎn)移具體過(guò)程優(yōu)點(diǎn)：游離的dNTP不發(fā)光，只有其摻入到新合成的DNA鏈時(shí)才會(huì)發(fā)光，極大地降低了背景熒光干擾此方法不需要用到持續(xù)的高能量的激發(fā)光照射，因此也能夠極大地減少DNA聚合酶的光損傷作用，進(jìn)一步延長(zhǎng)了測(cè)序長(zhǎng)度。能量4.3基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的即時(shí)DNA測(cè)序能量

DNA分子以一次一個(gè)堿基的速度依次通過(guò)納米小孔,利用核酸外切酶的特性來(lái)識(shí)別出不同的DNA堿基

優(yōu)點(diǎn)：納米孔測(cè)序的優(yōu)勢(shì)在于它不需要對(duì)DNA進(jìn)行標(biāo)記，也就省去了昂貴的熒光試劑和CCD照相機(jī)。4.4

納米孔單分子測(cè)序技術(shù)內(nèi)部：核酸外切酶和環(huán)式糊精由生物分子組成的納米孔DNA分子以一次一個(gè)堿基的速度依次通過(guò)納米小孔,利優(yōu)點(diǎn)：

直接測(cè)RNA序列。既然DNA聚合酶能夠即時(shí)觀測(cè)，那么以RNA為模板復(fù)制DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶也同樣可以應(yīng)用于第三代測(cè)序平臺(tái)。直接測(cè)甲基化的DNA序列。SMRT技術(shù)也可利用甲基化堿基特有的熒光信號(hào)來(lái)識(shí)別模板DNA中的甲基化修飾，如N6·甲基腺苷、5．甲基胞嘧啶或5一羥甲基胞嘧啶優(yōu)點(diǎn)：直接測(cè)RNA序列。表2各種測(cè)序技術(shù)比較表2各種測(cè)序技術(shù)比較5.基因測(cè)序的應(yīng)用未知基因組的測(cè)序全基因組重測(cè)序深度擴(kuò)增子測(cè)序轉(zhuǎn)錄組測(cè)序關(guān)聯(lián)突變的檢測(cè)病毒抗藥性和傳染病源快速檢測(cè)疾病相關(guān)區(qū)域、目標(biāo)區(qū)域測(cè)定環(huán)境基因組學(xué)和微生物多樣性DNA甲基化模式研究全基因組小分子RNA（miRNA)分析染色質(zhì)免疫沉淀表觀遺傳學(xué)考古學(xué)……5.基因測(cè)序的應(yīng)用未知基因組的測(cè)序全基因組重測(cè)序全基因組重測(cè)序是對(duì)已有參考序列（ReferenceSequence）的物種的不同個(gè)體進(jìn)行基因組測(cè)序，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行個(gè)體或群體水平的差異性分析。通過(guò)全基因組重測(cè)序，研究者可以找到大量的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）、拷貝數(shù)變異（CopyNumberVariation，CNV）、插入缺失（InDel，Insertion/Deletion）、結(jié)構(gòu)變異（StructureVariation，SV）等變異位點(diǎn)。這在人類(lèi)疾病及動(dòng)植物育種研究等方面具有重大的指導(dǎo)意義。全基因組重測(cè)序全基因組重測(cè)序是對(duì)已有參考序列（Ref全基因組重測(cè)序完成全基因組測(cè)序的部分的物種全基因組重測(cè)序完成全基因組測(cè)序的部分的物種全基因組重測(cè)序全基因組重測(cè)序全基因組重測(cè)序全基因組重測(cè)序轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（Transcriptomesequencing）

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的研究對(duì)象為特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA的總和，包括mRNA和非編碼RNA。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是指用新一代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)物種或者組織的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測(cè)序并得到相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本信息。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（Transcriptomesequencing轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（Transcriptomesequencing）轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（Transcriptomesequencing新型病源體的快速鑒定新型病源體的快速鑒定艾滋病毒抗藥性HIVsequencing

艾滋病毒抗藥性HIVsequencing外顯子&目標(biāo)區(qū)域測(cè)序外顯子&目標(biāo)區(qū)域測(cè)序是指利用特制的探針對(duì)客戶(hù)感興趣的蛋白編碼區(qū)域DNA或某段特定序列進(jìn)行捕獲，富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的基因組分析方法。該方法能夠獲得指定外顯子&目標(biāo)區(qū)域的遺傳信息，極大的提高了基因組中外顯子區(qū)域的研究效率，顯著降低了研究成本。主要用于識(shí)別和研究與疾病、種群進(jìn)化相關(guān)的編碼區(qū)域內(nèi)的結(jié)構(gòu)變異。結(jié)合大量的公共數(shù)據(jù)庫(kù)提供的外顯子數(shù)據(jù)，有利于更好地解釋所得變異結(jié)構(gòu)之間的關(guān)聯(lián)和致病機(jī)理。外顯子&目標(biāo)區(qū)域測(cè)序外顯子&目標(biāo)區(qū)域測(cè)序是指利用特制的探針對(duì)目標(biāo)外顯子組測(cè)序vs全基因組測(cè)序目標(biāo)外顯子組測(cè)序vs全基因組測(cè)序目標(biāo)外顯子測(cè)序應(yīng)用利用NGSeqCap+GS測(cè)序檢測(cè)白血病突變目標(biāo)外顯子測(cè)序應(yīng)用利用NGSeqCap+GS測(cè)序檢測(cè)白血病基因測(cè)序的展望利用光學(xué)成像技術(shù)設(shè)計(jì)的新型DNA測(cè)序簡(jiǎn)圖基因測(cè)序的展望利用光學(xué)成像技術(shù)設(shè)計(jì)的新型DNA測(cè)序簡(jiǎn)圖光影成像DNA測(cè)序技術(shù)原理：當(dāng)光照在一個(gè)物體上時(shí)，物體離光源越近，離成像面越遠(yuǎn)，則形成的影子越大，當(dāng)DNA被光照后，可在光敏成像板上留下圖像，通過(guò)比對(duì)可直接測(cè)定DNA序列。組件介紹：1.光源需要條形光源，光源與高通透玻璃板之間要有金屬通道，減少光能輻射遞減

2.高通透玻璃板上含有固定DNA的芯片

3.光敏成像板為光敏變色材料

光影成像DNA測(cè)序技術(shù)原理：當(dāng)光照在一個(gè)物體上時(shí)，物體離光源光影成像DNA測(cè)序技術(shù)所面臨的難題：DNA在固定時(shí)要防止斷裂，折疊，扭曲，變形需要找到合適的光源，合適的波長(zhǎng)避免發(fā)生衍射光源與DNA的距離以及DNA與光敏成像板的距離有待探究選取何種光敏材料，選取何種成像技術(shù)數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)需要建立比對(duì)系統(tǒng)光影成像DNA測(cè)序技術(shù)所面臨的難題：DNA測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用.pptDNA測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用.ppt1234引言第三代測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用與展望第一代測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序技術(shù)51234引言第三代測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用與展望第一代測(cè)序技術(shù)1引言

DNA序列測(cè)定的意義

DNA的序列測(cè)定是分子生物學(xué)研究中的一項(xiàng)非常重要的和關(guān)鍵的內(nèi)容。如在基因的分離、定位、基因結(jié)構(gòu)與功能的研究、基因工程中載體的組建、基因表達(dá)與調(diào)控、基因片段的合成和探針的制備、基因與疾病的關(guān)系等等，都要求對(duì)DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的詳細(xì)了解。1引言DNA序列測(cè)定的意義造福人類(lèi)的HGP

人類(lèi)基因組計(jì)劃（HumanGenomeProject－HGP）于1990年正式啟動(dòng)，其主要目標(biāo)有：識(shí)別人類(lèi)DNA中所有基因（超過(guò)10萬(wàn)個(gè)）；測(cè)定組成人類(lèi)DNA的30億堿基對(duì)的序列；將這些信息儲(chǔ)存到數(shù)據(jù)庫(kù)中；開(kāi)發(fā)出有關(guān)數(shù)據(jù)分析工具；致力于解決該計(jì)劃可能引發(fā)的倫理、法律和社會(huì)問(wèn)題。已于2003年完成。人類(lèi)基因組計(jì)劃是當(dāng)代生命科學(xué)一項(xiàng)偉大的科學(xué)工程，它奠定了21世紀(jì)生命科學(xué)發(fā)展和現(xiàn)代醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)，具有科學(xué)上的巨大意義和商業(yè)上的巨大價(jià)值。造福人類(lèi)的HGP人類(lèi)基因組計(jì)劃（Human

DNA測(cè)序技術(shù)的歷史與發(fā)展測(cè)序技術(shù)最早可以追溯到20世紀(jì)50年代。早在1945年就已經(jīng)出現(xiàn)了關(guān)于早期測(cè)序技術(shù)的報(bào)導(dǎo)，即Whitfeld等用化學(xué)降解的方法測(cè)定多聚核糖核苷酸序列。1977年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學(xué)降解法，標(biāo)志著第一代測(cè)序技術(shù)的誕生。此后在三十幾年的發(fā)展中陸續(xù)產(chǎn)生了第二代測(cè)序技術(shù)，包括Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)。DNA測(cè)序技術(shù)的歷史與發(fā)展測(cè)序技術(shù)最早可以追DNA測(cè)序技術(shù)的歷史與發(fā)展最近，Helicos公司的單分子測(cè)序技術(shù)、PacificBiosciences公司的單分子實(shí)時(shí)(SingleMoleculeRealTime,SMRT)測(cè)序技術(shù)和OxfordNanoporeTechnologies公司正在研究的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)被認(rèn)為是第三代測(cè)序技術(shù)。測(cè)序技術(shù)正在向著高通量、低成本、長(zhǎng)讀取長(zhǎng)度的方向發(fā)展。DNA測(cè)序技術(shù)的歷史與發(fā)展最近，Helicos公司的2.第一代測(cè)序技術(shù)2.第一代測(cè)序技術(shù)

化學(xué)降解法

基本原理：利用特異的選擇性試劑，專(zhuān)一性的隨機(jī)斷裂DNA成不同長(zhǎng)短的片段。根據(jù)試劑的選擇性及片段在高分辨力的聚丙烯酰胺凝膠電泳上的區(qū)帶位置，判斷DNA片段末端核苷酸的種類(lèi)，從而測(cè)出DNA的序列。

化學(xué)降解法

基本原理：利用特異的選擇性試劑，專(zhuān)一性的隨機(jī)斷技術(shù)路線將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂湣總€(gè)單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標(biāo)記,以便顯示DNA條帶↓分別用不同方法處理,獲得只差一個(gè)核苷酸的降解DNA群體↓電泳,讀取DNA的核苷酸順序技術(shù)路線將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂淒NA測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用課件化學(xué)降解法剛問(wèn)世時(shí)，準(zhǔn)確性較好，也容易為普通研究人員所掌握，因此用得較多。而且化學(xué)降解較之鏈終止法具有一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)，即所測(cè)序列來(lái)自原DNA分子而不是酶促合成產(chǎn)生的拷貝，排除了合成時(shí)造成的錯(cuò)誤。但化學(xué)降解法操作過(guò)程較麻煩，且用到放射性物質(zhì)，逐漸被簡(jiǎn)便快速的Sanger法所代替?；瘜W(xué)降解法剛問(wèn)世時(shí)，準(zhǔn)確性較好，也容易為普通研究人員所掌握，雙脫氧鏈終止法又稱(chēng)為Sanger法。原理：利用DNA聚合酶，以待測(cè)單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，設(shè)立四種相互獨(dú)立的測(cè)序反應(yīng)體系，在每個(gè)反應(yīng)體系中加入不同的雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）作為鏈延伸終止劑。在測(cè)序引物引導(dǎo)下，通過(guò)高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測(cè)后，合成鏈序列，由此推知待測(cè)模板鏈的序列。雙脫氧鏈終止法又稱(chēng)為Sanger法。雙脫氧鏈末端終止法測(cè)序原理示意圖雙脫氧鏈末端終止法測(cè)序原理示意圖POHdNTPddNTPPOHOHPPPPOHPOHdNTPddNTPPOHOHPPPPOH

Sanger法因操作簡(jiǎn)便，得到廣泛的應(yīng)用。后來(lái)在此基礎(chǔ)上發(fā)展出多種DNA測(cè)序技術(shù)，其中最重要的是熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)。DNA測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用課件熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)基于Sanger原理，用熒光標(biāo)記代替同位素標(biāo)記，并用成像系統(tǒng)自動(dòng)檢測(cè)，從而大大提高了DNA測(cè)序的速度和準(zhǔn)確性。目前，應(yīng)用最廣泛的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystems，ABI)3730系列自動(dòng)測(cè)序儀即是基于毛細(xì)管電泳和熒光標(biāo)記技術(shù)的DNA測(cè)序儀。熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)基于Sanger原理，用熒光DNA測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用課件3730

全自動(dòng)測(cè)序儀3730

全自動(dòng)測(cè)序儀雜交測(cè)序技術(shù)該方法不同于化學(xué)降解法和Sanger法，是利用DNA雜交原理，將一系列已知序列的單鏈寡核苷酸片段固定在基片上，把待測(cè)的DNA樣品片段變性后與其雜交，根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。雜交測(cè)序技術(shù)該方法不同于化學(xué)降解法和Sanger法，是利用D雜交測(cè)序檢測(cè)速度快，采用標(biāo)準(zhǔn)化的高密度寡核苷酸芯片能夠大幅度降低檢測(cè)的成本，具有部分第二代測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)。但該方法誤差較大，且不能重復(fù)測(cè)定。通過(guò)幾十年的逐步改進(jìn),第1代測(cè)序儀的讀長(zhǎng)可以超過(guò)1000bp,原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率可以高達(dá)99.999%,測(cè)定每千堿基序列的成本是0.5美元,每天的數(shù)據(jù)通量可以達(dá)到600000堿基。雜交測(cè)序檢測(cè)速度快，采用標(biāo)準(zhǔn)化的高密度寡核苷酸芯片能夠大幅度第一代測(cè)序技術(shù)在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮過(guò)重要的作用,如人類(lèi)基因組計(jì)劃(humangenomeproject,HGP)主要基于第一代DNA測(cè)序技術(shù)。目前基于熒光標(biāo)記和Sanger的雙脫氧鏈終止法原理的熒光自動(dòng)測(cè)序儀仍被廣泛地應(yīng)用。第一代測(cè)序技術(shù)在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮過(guò)重要的作用,如2.第二代測(cè)序技術(shù)盡管第一代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類(lèi)基因組草圖等大量的測(cè)序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的測(cè)序方法。隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成，后基因組時(shí)代，即功能基因組時(shí)代已向我們走來(lái)。第一代測(cè)序方法已經(jīng)不能滿(mǎn)足深度測(cè)序和重復(fù)測(cè)序等大規(guī)?；蚪M測(cè)序的需求，這促使了第二代測(cè)序，又稱(chēng)下一代測(cè)序(next—generationsequencing)的誕生。第二代測(cè)序技術(shù)包括：454測(cè)序技術(shù)、Solexa測(cè)序技術(shù)和SOLiD測(cè)序技術(shù)。2.第二代測(cè)序技術(shù)盡管第一代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)幫助人們完成了從噬菌過(guò)程概述基因組DNA

DNA片段（cDNA）構(gòu)建ssDNA文庫(kù)測(cè)序（聚合酶合成測(cè)序，連接酶合成測(cè)序）由于所有的克隆都在同一平面上，這些反應(yīng)就能夠大規(guī)模平行進(jìn)行，每個(gè)延伸反應(yīng)所摻入的熒光標(biāo)記的成像檢測(cè)也能同時(shí)進(jìn)行，從而獲得測(cè)序數(shù)據(jù)。DNA序列延伸和成像檢測(cè)不斷重復(fù)，最后經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)分析就可以獲得完整的DNA序列信息。

限制性?xún)?nèi)切酶酶切片段兩端加上不同的接頭固定，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增過(guò)程概述基因組DNA限制性?xún)?nèi)切酶酶切片段兩端加上不同的接2.1

454測(cè)序技術(shù)原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的作用下，將每一個(gè)dNTP的聚合與一次化學(xué)發(fā)光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的有無(wú)和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)檢測(cè)DNA序列的目的。2.1454測(cè)序技術(shù)原理：原理圖：構(gòu)建文庫(kù)DNA磁珠捕獲與PCR擴(kuò)增測(cè)序焦磷酸測(cè)序聚合酶硫化酶熒光素酶原理圖：構(gòu)建文庫(kù)DNA磁珠捕獲與PCR擴(kuò)增測(cè)序焦磷酸測(cè)序聚合測(cè)序數(shù)據(jù)輸出：測(cè)序數(shù)據(jù)輸出：指示器相機(jī)PTP盒指示器相機(jī)PTP盒454測(cè)序法的突出優(yōu)勢(shì)是較長(zhǎng)的讀長(zhǎng)，目前GSFLX測(cè)序系統(tǒng)的序列讀長(zhǎng)已超過(guò)400bp。雖然454平臺(tái)的測(cè)序成本比其他新一代測(cè)序平臺(tái)要高很多，但對(duì)于那些需要長(zhǎng)讀長(zhǎng)的應(yīng)用，如從頭測(cè)序，它仍是最理想的選擇。缺點(diǎn)是無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)量同聚物的長(zhǎng)度。小結(jié)454測(cè)序法的突出優(yōu)勢(shì)是較長(zhǎng)的讀長(zhǎng)，目前GSFLX2.2Solexa測(cè)序技術(shù)

Illumina公司的新一代測(cè)序儀GenomeAnalyzer最早由Solexa公司研發(fā)，利用合成測(cè)序(SequencingbySynthesis)的原理，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化樣本制備及大規(guī)模平行測(cè)序。原理：將基因組DNA的隨機(jī)片段附著到光學(xué)透明的玻璃表面（即Flowcell），這些DNA片段經(jīng)過(guò)延伸和橋式擴(kuò)增后，在Flowcell上形成了數(shù)以?xún)|Cluster，每個(gè)Cluster是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團(tuán)的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過(guò)可逆性終止的SBS（邊合成邊測(cè)序）技術(shù)對(duì)待測(cè)的模板DNA進(jìn)行測(cè)序。2.2Solexa測(cè)序技術(shù)Illumina公司的新一代原理圖構(gòu)建ssDNA文庫(kù)單鏈DNA與流動(dòng)槽附著B(niǎo)ridgePCRDNA簇線性化測(cè)序原理圖構(gòu)建ssDNA文庫(kù)單鏈DNA與流動(dòng)槽附著B(niǎo)rid測(cè)序過(guò)程：dNTP的3‘羥基被化學(xué)方法保護(hù)每輪合成反應(yīng)只能添加一個(gè)堿基測(cè)序過(guò)程：dNTP的3‘羥基被化學(xué)方法保護(hù)每輪合成反應(yīng)只能添測(cè)序過(guò)程：測(cè)序過(guò)程：

GenomeAnalyzer系統(tǒng)需要的樣品量低至100ng，文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程簡(jiǎn)單，減少了樣品分離和制備的時(shí)間，配對(duì)末端讀長(zhǎng)可達(dá)到2×50bp，每次運(yùn)行后可獲得超過(guò)20GB的高質(zhì)量過(guò)濾數(shù)據(jù)，且運(yùn)行成本較低，是性?xún)r(jià)比較高的新一代測(cè)序技術(shù)。小結(jié)GenomeAnalyzer系統(tǒng)需要的樣品量低至102.3SOLiD技術(shù)

SOLID通過(guò)連接反應(yīng)進(jìn)行測(cè)序。其基本原理是以四色熒光標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行多次連接合成，取代傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)。具體步驟包括：文庫(kù)準(zhǔn)備擴(kuò)增微珠與玻片連接連接測(cè)序與454測(cè)序類(lèi)似2.3SOLiD技術(shù)SOLID通過(guò)連接反應(yīng)進(jìn)行測(cè)SOLiD系統(tǒng)與454測(cè)序系統(tǒng)相比，每張玻片能容納更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實(shí)現(xiàn)更高的通量。SOLiD系統(tǒng)與454測(cè)序系統(tǒng)相比，每張玻片能容納更測(cè)序過(guò)程：連接酶八聚核苷酸模板通用測(cè)序引物n測(cè)序過(guò)程：連接酶八聚核苷酸模板通用測(cè)序引物nDNA測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用課件

超高通量是SOLID系統(tǒng)最突出的特點(diǎn)，目前SOLID3單次運(yùn)行可產(chǎn)生50GB的序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于17倍人類(lèi)基因組覆蓋度。小結(jié)超高通量是SOLID系統(tǒng)最突出的特點(diǎn)，目前SOLID表1三種二代測(cè)序技術(shù)對(duì)比表1三種二代測(cè)序技術(shù)對(duì)比4.第三代DNA測(cè)序技術(shù)第二代的高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)得到了很好的發(fā)展和應(yīng)用,但是由于其測(cè)序速度、成本、準(zhǔn)確度等關(guān)鍵問(wèn)題的解決仍存在困難,研究者們很快將目光轉(zhuǎn)向了更高更新的測(cè)序解決方案。單分子測(cè)序也就應(yīng)運(yùn)而生。

2009年12月,中科院北京基因組研究所與浪潮成立“中科院北京基因組研究所—浪潮基因組科學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室”4.第三代DNA測(cè)序技術(shù)第二代的高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)三代測(cè)序技術(shù)是以單分子測(cè)序?yàn)樘攸c(diǎn)的測(cè)序技術(shù)單分子即時(shí)DNA測(cè)序技術(shù)(SMRT)

HeliScope單分子測(cè)序基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的即時(shí)DNA測(cè)序納米孔單分子測(cè)序技術(shù)三代測(cè)序技術(shù)是以單分子測(cè)序?yàn)樘攸c(diǎn)的測(cè)序技術(shù)第三代測(cè)序技術(shù)1、目前一期的讀取速度為3bp/s2、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的processivity（延續(xù)性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很長(zhǎng)的片段），一個(gè)反應(yīng)就可以測(cè)非常長(zhǎng)的序列。3、它的精度非常高，達(dá)到99.9999%。第三代測(cè)序技術(shù)標(biāo)記熒光基因DNA聚合酶作用

顯微鏡下進(jìn)行熒光探測(cè)

零級(jí)波導(dǎo)的納米結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)即時(shí)觀察和背景熒光干擾4.1

單分子即時(shí)DNA測(cè)序技術(shù)標(biāo)記熒光基因DNA聚合酶作用顯微鏡下進(jìn)行熒光探測(cè)零級(jí)波導(dǎo)零級(jí)波導(dǎo)的納米結(jié)構(gòu)小孔的尺寸低于光的波長(zhǎng)，小孔底部形成消逝波，創(chuàng)造很小體積的檢測(cè)空間DNA鏈周?chē)坞x的熒光標(biāo)記dNTP有限，非?？焖龠M(jìn)出于小孔，穩(wěn)定的背景熒光信號(hào)熒光標(biāo)記dNTP被摻入到DNA合成鏈，其攜帶的特定熒光會(huì)持續(xù)一小段時(shí)間(熒光光曝)DNA聚合酶零級(jí)波導(dǎo)的納米結(jié)構(gòu)DNA聚合酶

4.2

HeliScope單分子測(cè)序

優(yōu)點(diǎn)：采用了一種新的熒光類(lèi)似物和更加靈敏的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，能夠直接記錄到單個(gè)堿基的熒光，從而克服了第二代測(cè)序必須用PCR擴(kuò)增出數(shù)千個(gè)拷貝以增加信號(hào)亮度的缺陷。DNA聚合酶熒光標(biāo)記的dNTP產(chǎn)生熒光CCD記錄發(fā)生了堿基延伸反應(yīng)平面基板模擬圖4.2HeliSco4.3基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的即時(shí)DNA測(cè)序

熒光供體

DNA聚合酶

熒光受體

4種dNTP熒光共振能量轉(zhuǎn)移具體過(guò)程優(yōu)點(diǎn)：游離的dNTP不發(fā)光，只有其摻入到新合成的DNA鏈時(shí)才會(huì)發(fā)光，極大地降低了背景熒光干擾此方法不需要用到持續(xù)的高能量的激發(fā)光照射，因此也能夠極大地減少DNA聚合酶的光損傷作用，進(jìn)一步延長(zhǎng)了測(cè)序長(zhǎng)度。能量4.3基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的即時(shí)DNA測(cè)序能量

DNA分子以一次一個(gè)堿基的速度依次通過(guò)納米小孔,利用核酸外切酶的特性來(lái)識(shí)別出不同的DNA堿基

優(yōu)點(diǎn)：納米孔測(cè)序的優(yōu)勢(shì)在于它不需要對(duì)DNA進(jìn)行標(biāo)記，也就省去了昂貴的熒光試劑和CCD照相機(jī)。4.4

納米孔單分子測(cè)序技術(shù)內(nèi)部：核酸外切酶和環(huán)式糊精由生物分子組成的納米孔DNA分子以一次一個(gè)堿基的速度依次通過(guò)納米小孔,利優(yōu)點(diǎn)：

直接測(cè)RNA序列。既然DNA聚合酶能夠即時(shí)觀測(cè)，那么以RNA為模板復(fù)制DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶也同樣可以應(yīng)用于第三代測(cè)序平臺(tái)。直接測(cè)甲基化的DNA序列。SMRT技術(shù)也可利用甲基化堿基特有的熒光信號(hào)來(lái)識(shí)別模板DNA中的甲基化修飾，如N6·甲基腺苷、5．甲基胞嘧啶或5一羥甲基胞嘧啶優(yōu)點(diǎn)：直接測(cè)RNA序列。表2各種測(cè)序技術(shù)比較表2各種測(cè)序技術(shù)比較5.基因測(cè)序的應(yīng)用未知基因組的測(cè)序全基因組重測(cè)序深度擴(kuò)增子測(cè)序轉(zhuǎn)錄