生物制藥技術(shù)課程總結(jié)課件

生物制藥技術(shù)生物工程091班女生組第一章緒論

1、生物制藥是指利用生物體或生物過程生產(chǎn)藥物的技術(shù)。主要闡述生物藥物，特別是生物工程相關(guān)藥物的研制原理，生產(chǎn)工藝及分離技術(shù)、制劑和生物藥品分析技術(shù)的應(yīng)用科學。2、生物技術(shù)藥物狹義：即基因工程產(chǎn)品、抗體工程產(chǎn)品、或細胞工程產(chǎn)品，如用大腸桿菌、酵母、或哺乳動物細胞表達的重組蛋白、用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的治療性抗體。廣義：包括從血液、尿液或組織中提取的生物活性物質(zhì)，用細胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)的減毒滅毒疫苗等。3、生物醫(yī)藥行業(yè)的特征：高技術(shù)、高投入、高風險、長周期、高收益。GLP-藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范GCP-藥物臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范GMP-藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范GCPGLPGMP生產(chǎn)工業(yè)制藥技術(shù)開發(fā)

劑型開發(fā)過程開發(fā)注冊臨床毒理發(fā)現(xiàn)臨床前化學生物中藥制藥工藝：從發(fā)現(xiàn)-藥物上市4、研究對象與內(nèi)容（1）綜合應(yīng)用化學系列、生物系列、機械設(shè)備與工程單元操作等課程的專門知識深化理解并掌握工藝原理，去分析和解決研發(fā)和生產(chǎn)過程的實際問題。從工業(yè)生產(chǎn)角度，改造、設(shè)計和開發(fā)藥物的生產(chǎn)工藝，制定相應(yīng)的操作規(guī)程。（2）實驗室（小試）工藝中試放大工藝在車間生產(chǎn)若干批號后，制定生產(chǎn)工藝規(guī)程主要內(nèi)容5、新藥研究中的兩個重要原理

前藥原理和生物電子等排體原理。前藥是指對現(xiàn)有藥物的顯效基因進封閉，得到的在體外無活性的衍生物，在體內(nèi)經(jīng)酶或非酶作用得到原藥，從而產(chǎn)生生物活性，則稱這種結(jié)構(gòu)修飾后的化合物為原藥的前藥。利用這一原理進行新藥設(shè)計的方法稱為前藥原理。生物電子等排體原理狹義：是指具有相同原子數(shù)及電子總數(shù)，而且電子排布狀態(tài)也相同的不同分子或原子團。廣義：是指具有相同數(shù)目的外層電子（價電子）的不同分子。第二章生物藥物概論

一、生物藥物的來源1.生物藥物的定義生物藥物是指運用生物學、醫(yī)學、生物化學等研究成果,從生物體、生物組織、細胞、體液等,綜合利用物理學、化學、生物化學、生物技術(shù)、藥學等學科的原理和方法制造的一類用于預防、治療和診斷的制品。2.生物藥物的原料來源天然生物材料：動物、植物、微生物等。人工生物材料：免疫法制備的動物原料、基因工程技術(shù)制備的微生物或其它細胞原料。二、生物藥物的特性1.藥理學特性⑴治療的針對性強，治療的生理生化機制合理，療效可靠。細胞色素C：治療缺氧性疾?、扑幚砘钚愿?。ATP直接供能，效果確切、顯著⑶毒副作用小，營養(yǎng)價值高。生物藥物主要有:蛋白質(zhì)、核酸、糖類、脂類⑷生理副作用常有發(fā)生免疫反應(yīng)、過敏反應(yīng)2.在生產(chǎn)的制備中特殊性(1)提取純化工藝復雜(2)穩(wěn)定性差(3)易變質(zhì)腐敗(4)注射用藥要求3.檢驗上的特殊性需理化檢驗指標生物活性指標2、核酸類藥物的分離純化方法主要有：提取法和發(fā)酵法⑴提取法生產(chǎn)DNA和RNA主要技術(shù)是先提取核酸與蛋白質(zhì)復合物,再解離核酸與蛋白質(zhì),然后分離RNA與DNA。⑵發(fā)酵法主要用于生產(chǎn)單核苷酸。3、糖類的分離純化方法因各種糖類的性質(zhì)和原料來源不同沒有統(tǒng)一的提取純化工藝。4、脂類藥物的分離純化方法⑴提取方法：脂類自然狀態(tài)下是以結(jié)合形式存在的。非極性脂是與其它脂質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子的疏水區(qū)相結(jié)合。提取脂質(zhì)藥物就是要破壞這種結(jié)合鍵，將脂質(zhì)溶解出來。溶劑：醇、氯仿等。（2）純化方法：沉淀法、吸附層析法、離子交換層析法。人源性藥物的特點及研究意義1、特點：⑴安全性好⑵效價高療效可靠⑶穩(wěn)定性好2、研究意義：⑴資源有限性：受法律和倫理的制約,僅血液、尿液、胎盤可用作原料。⑵研究的重要意義：對醫(yī)學和藥學有重大意義。3.1基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)3.1.1大腸桿菌表達系統(tǒng)1、大腸桿菌（Eschericliacoli）形態(tài)特征:細胞：G－，單細胞，桿狀。鞭毛，無芽孢，一般無莢膜。裂殖。菌落:白色至黃白色，光滑，直徑2－3mm。2、生化與遺傳特性：能在僅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的無機鹽的極限培養(yǎng)基上生長，發(fā)酵糖，產(chǎn)氣產(chǎn)酸。3、質(zhì)粒載體質(zhì)粒連接表達必須的三個關(guān)鍵位點：復制起始點，選擇標記，多克隆位點。質(zhì)粒類型：嚴緊型質(zhì)粒：在每個宿主細胞只能復制少數(shù)幾個拷貝的質(zhì)粒；松弛型質(zhì)粒：在每個細胞中能復制幾十至幾百個拷貝數(shù)的質(zhì)粒克隆質(zhì)粒：用于克隆和擴增外源基因。測序質(zhì)粒：用于基因測序；整合質(zhì)粒：用于外源基因與宿主染色體整合；穿梭質(zhì)粒：能在兩種宿主細胞存在；表達質(zhì)粒：能表達基因產(chǎn)物4、產(chǎn)物表達形式

不溶性蛋白質(zhì)：細胞質(zhì)內(nèi)形成包涵體；可溶性蛋白質(zhì)：存在于細胞質(zhì)；周質(zhì)表達：外源蛋白被運輸分泌到周質(zhì)，可溶性。有利于分離和減少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸；胞外分泌表達：胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)分泌到胞外的培養(yǎng)液中。大腸桿菌大部分產(chǎn)物以不溶性蛋白質(zhì)存在，在細胞質(zhì)內(nèi)形成包涵體包涵體：一種蛋白質(zhì)不溶性聚集體，包括目標蛋白、菌體蛋白等。目標蛋白一級結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯誤的，所以沒有生物活性。包涵體的形成：大腸桿菌中目標產(chǎn)物的表達水平過高，超過正常代謝水平，過多表達產(chǎn)物聚集在細胞內(nèi)，形成不溶性的包涵體基因工程包涵體的純化方法：收集菌體細胞—細胞破碎—包涵體的洗滌—目標蛋白的變性溶解—目標蛋白的復性3.1.2酵母表達系統(tǒng)1、形態(tài)特征2、生長與遺傳特征孢子萌發(fā)產(chǎn)生單倍體細胞，兩個性別不同的單倍體細胞結(jié)合形成二倍體接合子或營養(yǎng)細胞，進行芽殖。能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖等。生長繁殖迅速，倍增期約2小時。釀酒酵母有17條染色體細胞：單細胞真核生物，球形、橢圓形、卵形。繁殖：芽殖、裂殖。在特定條件下才產(chǎn)生子囊孢子。菌落：乳白色，有光澤，邊沿整齊。3.2.1工程菌構(gòu)建流程目標基因PCR定位克隆PCR(Polymerasechainreaction,PCR)：聚合酶鏈式反應(yīng)：由DNA聚合酶催化下，對特定的DNA序列進行的復制反應(yīng)。本質(zhì)：生物體的DNA復制原理在體外合成基因。轉(zhuǎn)化：某一基因型細胞從周圍介質(zhì)中吸收另一基因型細胞的DNA，使其基因型和表型發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象轉(zhuǎn)染：除去蛋白質(zhì)外殼的病毒核酸感染細胞或原生質(zhì)體的過程.

工程菌發(fā)酵的影響因素1）溫度大腸桿菌和釀酒酵母生長最低溫度為10℃大腸桿菌生長最適溫度為37℃，最高溫度為45℃。釀酒酵母生長最適溫度為30℃，最高溫度為40℃。生長與生產(chǎn)溫度不一致。較高溫度表達包涵體，較低溫度下有利于表達可溶性蛋白質(zhì)。對于熱敏感的蛋白質(zhì)，生產(chǎn)期可采用先高溫，然后低溫，變溫表達，避免蛋白質(zhì)降解。2）pH值細菌喜歡偏堿性：大腸桿菌適宜pH為6.5～7.5，真菌喜歡微酸性：酵母適宜pH為5.0～6.0。影響產(chǎn)物穩(wěn)定性，最適生長和最適生產(chǎn)pH不同。干擾素是在酸性條件下穩(wěn)定，而在堿性條件下容易降解。酸性環(huán)境有利于發(fā)揮菌株生產(chǎn)能力。乙酸的產(chǎn)生使菌體生長速率下降，也抑制基因表達。干擾素的種類概念：（interferon，IFN）機體受到病毒感染時，免疫細胞產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能接近的細胞因子功能：干擾病毒在細胞內(nèi)的繁殖干擾素在酸性條件下穩(wěn)定，而在堿性條件下容易降解天然干擾素分類：I干擾素：IFNα、IFNβ、IFNτ、IFNε、IFNωII干擾素：IFNγ5、雜交瘤技術(shù)原理聚乙二醇（PEG）：細胞融合劑，使免疫的小鼠脾細

胞與小鼠骨髓瘤細胞融合

HAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：反復的免疫學檢測篩選克隆化增殖的雜交瘤

細胞系

單克隆抗體生成：接種雜交瘤

細胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價的單克隆抗體。6、小鼠骨髓瘤細胞不產(chǎn)生Ig的重鏈和輕鏈HGPRT-(次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶);TK-(胸腺嘧啶核苷激酶)與提供淋巴細胞的動物品系相同7、免疫的方法

采用體內(nèi)免疫法和體外免疫法。體內(nèi)免疫法：適用于免疫原性強、抗原量較多時應(yīng)用，一般用8～12周齡雌性鼠。顆粒性抗原（如細菌細胞抗原）的免疫性強，可不加佐劑,直接注入腹腔10個細胞進行初次免疫，間隔1～3周，再追加免疫1～2次。體外免疫法：適用于抗原量少，免疫性弱。8、細胞融合后可產(chǎn)生多種融合

脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤融合細胞。9、HAT選擇培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細胞通過替代途徑合成DNA

第五章動物細胞培養(yǎng)制藥工藝1、蛋白質(zhì)合成場所：粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體

糖基化場所：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成各種糖類，粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)和高爾基體，加工修飾。2、制藥動物細胞的種類分四類:原代細胞系,二倍體細胞系,異倍體細胞系,融合的或重組的工程細胞系。3、細胞系的分類：來源：原代細胞，傳代細胞。壽命：有限細胞系，無限細胞系。染色體數(shù)目：二倍體細胞系，異倍體細胞系。獲得方式：工程細胞系，癌變細胞系。生長特性：貼壁依賴型，非貼壁依賴型細胞系，兼性細胞系。4、原代細胞概念：從動物體內(nèi)直接分離得到的細胞。特點：生長分裂不旺盛，與體內(nèi)細胞相似應(yīng)用：藥物檢測實驗，藥理研究。生產(chǎn)藥品：雞胚細胞，兔或鼠腎細胞、淋巴細胞。5、傳代細胞概念：原代細胞轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)的細胞。特點：細胞分裂增殖旺盛，二倍體核型。二倍體細胞系：原代細胞經(jīng)過傳代、篩選、克隆、純化后，獲得具一定特征的細胞系。6、有限細胞系概念:生長和壽命有限的細胞系。二倍體細胞系特點：多次傳代培養(yǎng)，失去增殖能力，老化死亡。壽命：取決于細胞來源的物種和年齡、器官。7、無限細胞系概念：生長和壽命不受限制的細胞系，能連續(xù)傳代培養(yǎng)。特點：細胞無限分裂,不具有接觸抑制現(xiàn)象，不出現(xiàn)異常染色體。

機體細胞的pH范圍為范圍為6～8，而且在血液和液中，變化范圍很小。11、動物細胞的生產(chǎn)特征生理鹽水：調(diào)節(jié)滲透壓的鹽溶液，0.9%NaCl等滲能力培養(yǎng)用水質(zhì)：電阻率大于或等于14?動物細胞培養(yǎng)用L型氨基酸12、生長基質(zhì)：把改變生長表面特性，促進細胞貼附的物質(zhì)。13、接觸抑制：細胞在生長基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯集成片，當每個細胞與其周圍的細胞互相接觸時，細胞就停止增殖。第六章植物細胞制藥1、植物組織和細胞培養(yǎng)植物組織和細胞培養(yǎng)是指在無菌和人工控制的營養(yǎng)（培養(yǎng)基）及環(huán)境條件（光照、溫度）下，研究植物的細胞、組織和器官及控制其生長發(fā)育的技術(shù)。植物無菌培養(yǎng)包括：植物培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)2、植物材料的準備用于植物組織培養(yǎng)的外植體必須無菌，如果含有其他微生物，在培養(yǎng)基中，其他微生物會大量迅速繁殖從而影響植物組織的培養(yǎng)。常用表面滅菌方法。選用滅菌后易于除去或容易分解的試劑。根據(jù)所處理材料對滅菌試劑的敏感性選擇適當?shù)奶幚頃r間。常用滅菌試劑有次氯酸鈣、次氯酸鈉和氯化汞。

次氯酸鈣為工業(yè)漂白粉過濾后的飽和溶液，適用于草本植物和柔軟組織的滅菌處理，時間為5-30分。

氯化汞滅菌效果好，但不易除去，時間不易過長，以免殺死植物細胞，當其用于休眠種子的滅菌劑最為理想，適用濃度為0.1%，2-10分，種子皮較厚時可延長至20分以上。實驗室有毒的氯化汞如何處理？由于各種價態(tài)汞的毒性都很強，在對含汞廢液處理時，不能將含汞廢液經(jīng)簡單化學處理后直接排入下水道．只能采取將離子態(tài)汞還原為單質(zhì)汞后純化再用的方法。廢液中汞的最高容許排放濃度為0.05mg/L(以Hg計）常用的處理方法有：1.硫化物共沉淀法：含汞鹽的廢液先調(diào)至pH8～10，加入過量硫化鈉，使其生成硫化汞沉淀，再加入共沉淀劑硫酸亞鐵，生成的硫化鐵將水中的懸浮物硫化汞微粒吸附而共沉淀，排出清液，殘渣用焙燒法回收汞、或再制成汞鹽2.還原法：用銅屑、鐵屑、鋅粒、硼氫化鈉等作還原劑，可以直接回收金屬汞。二、植物細胞培養(yǎng)培養(yǎng)基及其組成

1、無機鹽：有大量元素和微量元素，30毫克每升為界限。

大量包括：氮、硫、磷、鉀、鎂、鈣、氯、鈉。

微量包括：鐵、錳、碘、鉬、銅、鋅。

2、植物生長調(diào)節(jié)劑：植物激素是植物代謝過程中形成的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在極低濃度（小于1微摩爾）時即能調(diào)節(jié)植物的生育過程，并能從合成部位轉(zhuǎn)運到作用部位而發(fā)揮作用。

常見的植物激素有生長素、分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯。

植物組織和細胞培養(yǎng)物的生長過程主要取決于生長素和分裂素的比例，比值高可刺激細胞分裂，比值低則刺激細胞生長。

對于植物培養(yǎng)細胞，絕大多數(shù)培養(yǎng)基中都必須加入一定量的生長調(diào)節(jié)劑。

此外，還有碳源，氮源，維生素等。第七章酶工程制藥酶工程制藥主要包括藥用酶的生產(chǎn)好酶法制藥兩方面技術(shù)藥用酶：具有治療和預防疾病功效的酶。酶法制藥：在一定條件下利用酶的催化作用，將底物轉(zhuǎn)化為藥物的技術(shù)過程。固定化酶：限制或固定于特定空間位置的酶，即經(jīng)物理化學方法處理，使酶變成不易隨水流失即運動受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。酶和細胞的固定化方法：1）載體結(jié)合法：物理吸附法、離子結(jié)合法、共價結(jié)合法；2）交聯(lián)法包埋法：網(wǎng)格型、微囊型

二、提高藥用酶產(chǎn)量的措施1、添加誘導物：誘導物可分為三種：酶的作用底物、酶的反應(yīng)產(chǎn)物、酶的底物類似物。2、控制阻遏物濃度：有些酶的合成受到阻遏物的阻遏作用，應(yīng)設(shè)法解除阻遏作用來提高酶的產(chǎn)量。3、添加表面活性劑：可分為離子型和非離子型，離子型對細胞有毒害作用，只能使用非離子型，可聚集在細胞膜上，增加細胞通透性，有利于酶的分泌，可增加酶的產(chǎn)量。4、添加刺激劑：在植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的過程中，添加某些刺激劑可顯著提高次級代謝的物的產(chǎn)量。真菌的細胞壁碎片或其有效成分、微生物胞外酶以及一些小分子物質(zhì)。5、添加產(chǎn)酶促進劑：植酸鈣鎂可是霉菌蛋白酶和橘青霉磷酸二酯酶的產(chǎn)量提高1-20倍。第三節(jié)藥物的酶法生產(chǎn)酶的選擇1、根據(jù)欲生產(chǎn)的藥物的結(jié)構(gòu)特點選擇所需要的酶。如生產(chǎn)L-丙氨酸，可以利用丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，

L-天冬氨酸脫羧酶等多種酶2、根據(jù)底物的特點選擇所需要的酶。如酶法生產(chǎn)L-丙氨酸宜選擇只需一種底物的L-天冬氨酸脫羧酶。3、根據(jù)副產(chǎn)物的特點選擇所需要的酶。4、根據(jù)生產(chǎn)要求確定酶的使用形式。二、反應(yīng)器的選擇依據(jù)⒈根據(jù)固定化酶的形狀來選擇⒉根據(jù)底物的物理性質(zhì)來選擇⒊根據(jù)反應(yīng)的動力學特性來選擇⒋根據(jù)外界環(huán)境對酶的穩(wěn)定性的影響來選擇⒌根據(jù)操作要求及反應(yīng)器費用來選擇固定化酶在生物傳感方面的應(yīng)用

1、生物傳感器：

用生物活性材料(酶、蛋白質(zhì)、DNA、抗體、抗原、生物膜等)與物理化學換能器有機結(jié)合的一門交叉學科，是發(fā)展生物技術(shù)必不可少的一種先進的檢測方法與監(jiān)控方法，也是一種物質(zhì)分子水平的快速、微量的分析方法。2、生物傳感器原理為：待測物質(zhì)經(jīng)擴散作用進入生物活性材料，經(jīng)分子識別，發(fā)生生物學反應(yīng)，產(chǎn)生的信息被相應(yīng)的物理或化學換能器轉(zhuǎn)變成可定量和可處理的電信號，再經(jīng)兩次儀表放大并輸出，便可知道待測物濃度生物傳感器特點：①專一性強，只對特定底物起反應(yīng)，且不受顏色、濁度的影響。②分析速度快，可在1min內(nèi)得到結(jié)果。③準確度高，一般相對誤差可以達到1％。④操作系統(tǒng)比較簡單，容易實現(xiàn)自動分析。⑤成本低，在連續(xù)使用時，每例測定僅需幾分錢。⑥有的生物傳感器能夠可靠地指示微生物培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的供氧狀況和副產(chǎn)物的產(chǎn)生。第八章微生物發(fā)酵制藥工藝

8.1微生物發(fā)酵與制藥概述

發(fā)酵:通過微生物培養(yǎng)而獲得產(chǎn)物的過程初級代謝產(chǎn)物：在初級代謝過程中形成的產(chǎn)物，包括各種小分子前體、單體和多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、核酸等。生長所必須的。幾乎所有生物初級代謝基本相同。氨基酸，核苷酸，有機酸。次級代謝產(chǎn)物：比較復雜的化合物，不

是細胞生長必需的，對生命活動有意義（抗逆境條件）?？股?，毒素，色素發(fā)酵制藥：利用制藥微生物的生長繁殖，通過發(fā)酵，代謝合成藥物，然后從中分離提取、精制純化，獲得藥品的過程。8.2微生物的生長與生產(chǎn)的關(guān)系1，微生物發(fā)酵基本過程特征（1）發(fā)酵前期（菌體生長期）：從接種至菌體達到一定臨界濃度的時間，包括延滯期、對數(shù)生長期和減速期。代謝特征：碳源、氮源等基質(zhì)不斷消耗，減少生長特征：菌體不斷地生長和繁殖，生物量增加。溶氧變化：不斷下降，菌體臨界值時，濃度最低。pH變化：先升后降－先氨基酸作為碳源，釋放出氨，而后氨被利用。先降后升－先用糖作為碳源，釋放出丙酮酸等有機酸，后又被利用。（2）發(fā)酵中期（產(chǎn)物合成生產(chǎn)期）：以次級代謝產(chǎn)物或目標產(chǎn)物的生物合成為主的一段時間。菌體生長恒定就進入產(chǎn)物合成階段。呼吸強度：無明顯變化，不增加菌體數(shù)目產(chǎn)物量：逐漸增加，生產(chǎn)速率加快，直至最大高峰，隨后合成能力衰退。對外界變化敏感：容易影響代謝過程，從而影響整個發(fā)酵進程。（3）發(fā)酵后期（菌體自溶期）：菌體衰老，細胞開始自溶的一段時間合成產(chǎn)物能力衰退，生產(chǎn)速率減慢。氨基氮含有增加，pH上升發(fā)酵必須結(jié)束，否則產(chǎn)物被破壞菌體自溶給過濾和提取等帶來困難。2、微生物的生長動力學菌體生物量與時間的關(guān)系是S形曲線。分為五個階段：3、影響生長動力學的因素（1）基質(zhì)濃度

基質(zhì)濃度對菌體生長的影響菌體生長過程，基質(zhì)逐漸被吸收利用，濃度呈現(xiàn)降低。（2）溫度隨溫度升高而速率增加，超過一定溫度點后，隨溫度升高，速率逐漸下降。（3）pH值pH值對菌體生長速率的影響與溫度的影響類似，在適宜的pH范圍內(nèi)，生長速率最大4、生長與生產(chǎn)關(guān)系的模型

I型：菌體生長與生產(chǎn)偶聯(lián)型菌體生長與產(chǎn)物生成直接關(guān)聯(lián)，生長期與生產(chǎn)期是一致菌體生長、基質(zhì)消耗、能源利用和產(chǎn)物生成動力學曲線幾乎平行，變化趨勢同步，最大值出現(xiàn)的時間接近.產(chǎn)物：初級代謝的直接產(chǎn)物，如乙醇，有機酸，乳酸、醋酸等。rp為,Yp為產(chǎn)物的最大得率,qp為比生產(chǎn)率II型：生長與生產(chǎn)半偶聯(lián)型介于偶聯(lián)和非偶聯(lián)模型之間，產(chǎn)物生成與基質(zhì)消耗、能量利用之間存在間接關(guān)系。生長期期內(nèi)，無產(chǎn)物生成，生長中后期生成大量的產(chǎn)物產(chǎn)物：氨基酸的發(fā)酵，一部分組成型表達的蛋白質(zhì)藥物III型：生長與產(chǎn)物生成非偶聯(lián)型生長期與生產(chǎn)期在獨立的兩個階段先形成物質(zhì)消耗和生長高峰后菌體靜止期，產(chǎn)物大量生成，出現(xiàn)產(chǎn)物高峰?？股氐却渭壌x產(chǎn)物誘導型基因工程菌的生產(chǎn)8.3制藥微生物生產(chǎn)菌種的建立

菌種選育自然選育：不經(jīng)過人工誘變處理，根據(jù)菌種的自然突變而進行的菌種篩選過程。過程：菌種—單孢子—平板分離—單菌落測活—優(yōu)良菌株（效率低,增產(chǎn)幅度?。┱T變育種：人為創(chuàng)造條件（誘變劑處理），使菌種發(fā)生變異，篩選優(yōu)良個體，淘汰劣質(zhì)個體。過程：出發(fā)菌種—單孢子懸液—誘變處理—稀釋涂板—單菌落初篩—高產(chǎn)菌株—復篩—穩(wěn)定性特性—放大中試—投入生產(chǎn)雜交育種：兩個不同基因型的菌株，通過結(jié)合或原生質(zhì)體融合，使遺傳物質(zhì)發(fā)生重新組合，從中分離篩選出具有優(yōu)良性狀的新菌株。此外，還有分子定向育種，組合生物合成等。誘變方案設(shè)計出發(fā)菌種的選擇：較高產(chǎn)，對誘變劑敏感。誘變劑的使用：交叉使用多種，合理組合。中等劑量（80％致死率）。選擇壓：施加一定的選擇壓，獲得耐藥菌株。措施：添加抗生素，提高前體濃度，增加產(chǎn)物濃度。菌種保藏原因：菌種經(jīng)過多次傳代，會發(fā)生遺傳變異，導致退化，從而喪失生產(chǎn)能力甚至菌株死亡。目的：保持菌種原有優(yōu)良特性，延長生命時限，長期存活、不退化。原理：使菌種代謝處于不活躍狀態(tài)，即生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。措施：物理和化學方法（溫度：低溫；水分：干燥；氧氣：缺氧；營養(yǎng)；缺乏）保藏方法低溫斜面保藏：低溫降低新陳代謝。4℃，RH70％以下。短期保藏，1－6個月；易變異石蠟封存：隔絕氧氣，減少蒸發(fā)。4℃，約1年。砂土管保藏：干燥抑制生長。孢子吸附在砂土上，真空抽氣干燥。干燥器于冰箱，數(shù)年。冷凍干燥保藏：保護劑降低菌體細胞冰點，減少冰晶對細胞傷害。低溫避光，中期保藏，5～10年。液氮保藏：培養(yǎng)物與冷凍保護劑混合，密封。液氮（－196℃）罐或－80℃冰箱。低溫、缺氧、避光和營養(yǎng)缺乏環(huán)境。長期保藏。8.4發(fā)酵培養(yǎng)基制備

培養(yǎng)基的成分碳源：包括速效碳源（糖類、有機酸等，菌體生長）和遲效碳源（酪蛋白水解產(chǎn)生的脂肪酸等，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物）氮源無機鹽和微量元素：低濃度促進，高濃度抑制水生長因子：維生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物等。前體與促進劑：前體：加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中的某些化合物，被直接結(jié)合到目標產(chǎn)物分子中，自身的結(jié)構(gòu)無多大的變化。提高抗生素產(chǎn)量，多次少量流加。促進劑：促進產(chǎn)物生成的物質(zhì)，但不是營養(yǎng)物，也不是前體的一類化合物。消泡劑：消除泡沫，防止逃液和染菌按發(fā)酵過程中所處位置和作用培養(yǎng)基可以分為：

固體培養(yǎng)基：細菌和酵母的固體斜面或平板培養(yǎng)基，鏈霉菌和絲狀真菌的孢子培養(yǎng)基。作用：提供菌體的生長繁殖，形成孢子。單細胞培養(yǎng)基：營養(yǎng)豐富，滿足菌體生長迅速，不能引起變異。孢子培養(yǎng)基：基質(zhì)濃度較低，無機鹽濃度適量，以利于孢子形成。營養(yǎng)不宜太豐富，否則不易產(chǎn)生孢子。種子培養(yǎng)基：供孢子發(fā)芽和菌體生長繁殖，搖瓶和種子罐培養(yǎng)基,為液體。作用：使種子擴大培養(yǎng)，增加細胞數(shù)目，生長形成強壯、健康和高活性的種子。要求與質(zhì)量控制：培養(yǎng)基成分必需完全，營養(yǎng)豐富用速效性、容易被利用的碳、氮源和無機鹽等物質(zhì)，但濃度不宜高。種子培養(yǎng)基要與發(fā)酵培養(yǎng)基相適應(yīng)，主要成分接近，不能差異太大。縮短發(fā)酵的延滯期。發(fā)酵培養(yǎng)基：提供微生物生長、目標產(chǎn)物生成的生產(chǎn)用培養(yǎng)基。作用：不僅要滿足菌體的生長和繁殖，還要滿足菌體合成目標產(chǎn)物，是發(fā)酵生產(chǎn)中最關(guān)鍵和最重要的培養(yǎng)基。要求：營養(yǎng)物質(zhì)濃度和粘度適中；組成上豐富完整；不同菌種和不同產(chǎn)物，對培養(yǎng)基的要求差異很大，組成和配方需要優(yōu)化。補料培養(yǎng)基：發(fā)酵過程中添加補充的培養(yǎng)基。作用：穩(wěn)定工藝條件，延長發(fā)酵周期，提高目標產(chǎn)物產(chǎn)量?？刂瓢l(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量：1）控制水質(zhì)

恒定水源和恒定的水質(zhì)。2）控制培養(yǎng)基原料的質(zhì)量

保持穩(wěn)定的原料來源。3）控制培養(yǎng)基的黏度

固體不溶性成分，淀粉、黃豆粉等增加培養(yǎng)基的黏度，酶水解，降低大分子物質(zhì)。4）控制滅菌操作培養(yǎng)基設(shè)計一般原則生物學原則：根據(jù)不同微生物營養(yǎng)和反應(yīng)需求設(shè)計

營養(yǎng)物質(zhì)組成：較豐富，濃度適當。

成分之間比例：恰當，C/N比適宜，有機和無機氮

原料之間：不能產(chǎn)生化學反應(yīng)。適宜的pH和滲透壓工藝原則：不影響通氣攪拌、分離精制和廢物處理過程容易控制。低成本原則：原料來源方便，質(zhì)量穩(wěn)定，質(zhì)優(yōu)價廉高效經(jīng)濟原則：滿足菌體生長和合成產(chǎn)物的需求，最高得率，最小副產(chǎn)物。培養(yǎng)基設(shè)計基本思路起始培養(yǎng)基：根據(jù)他人的經(jīng)驗和使用。單因素實驗：確定最適宜的培養(yǎng)基成分。多因素實驗：各成分之間最佳配比和濃度優(yōu)化。中試放大試驗：搖瓶、小型發(fā)酵罐，到中試，最后放大到生產(chǎn)罐。綜合考慮各種因素，產(chǎn)量、純度、成本等后，確定一個適宜的生產(chǎn)配方。第五節(jié)。滅菌工藝雜菌：除生產(chǎn)菌以外的任何微生物。污染：感染雜菌的培養(yǎng)或發(fā)酵體系。消毒：殺滅或清除病原微生物，達到無害化程度，殺滅率99.9%以上。殺菌：殺滅或清除一切微生物，達到無活微生物存在的過程，殺滅率99.9999%以上。滅菌：微生物殺滅率99.999999%以上。2、培養(yǎng)基滅菌的操作方式(1)分批滅菌操作，間歇滅菌,實罐滅菌：配制好培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐內(nèi)，直接蒸汽加熱，達到滅菌要求的溫度和壓力后維持一段時間，再冷卻至發(fā)酵要求的溫度。（2）連續(xù)滅菌操作，高溫短時滅菌操作，連消培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外經(jīng)過一套滅菌設(shè)備連續(xù)的加熱滅菌，冷卻后送入已滅菌的發(fā)酵罐內(nèi)的工藝過程三路進氣：空氣管道，排料管，取料管排氣：凡是罐上與外界開口的管道不排氣就進氣；在滅菌過程中，所有與外界開口的管道都必須有空氣流動，不進就出。分批操作的滅菌過程加熱升溫：維持滅菌溫度：15－30min，121℃；0.09－0.10MPa冷卻降溫：每段對滅菌的貢獻于取決時間長短。（2）連續(xù)滅菌－操作過程配料：配料罐，配制培養(yǎng)基。預熱罐：定容和預加熱。70－90℃。加熱器：培養(yǎng)基與蒸汽混合，快速升到130－140℃。維持罐：維持滅菌時間,5－7分鐘。冷卻管：培養(yǎng)基經(jīng)過冷卻水管冷卻。40－50℃。輸入滅菌的發(fā)酵罐中?？諝獬僮鞴に?、發(fā)酵對空氣的要求好氧微生物需要氧氣供應(yīng)，通入空氣。連續(xù)一定流量的壓縮無菌空氣?？諝饬髁浚阂话?.1-2.0。壓強：0.2-0.4MPa?？諝赓|(zhì)量：相對濕度小于70％；比培養(yǎng)溫度高10－30℃；潔凈度100級，或失敗率10－3。2、工業(yè)制備大量空氣的方法加熱滅菌：利用空氣壓縮時所產(chǎn)生的熱量除菌，無菌化程度不高的發(fā)酵過程。靜電除菌：通過高壓電流場，帶電粒子被吸附。介質(zhì)過濾：捕集粒子及各種微生物。發(fā)酵工業(yè)采用。3、空氣除菌原理空氣中附著在塵埃上的微生物大小為0.5-5um。離心場作用：顆粒及其微生物沉降直接被截留：顆粒慣性碰撞，相互集聚成大顆粒。氣流速度越大，慣性越大，截留效果越好。靜電引力：有一定作用。5、空氣滅菌工藝過程8.6發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)微生物發(fā)酵工藝過程的三個工段：種子制備、接種、發(fā)酵培養(yǎng)種子的制備：（1）種子的逐級擴大培養(yǎng)過程。（2）獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。接種方式:單種法：一只種子罐接種一只發(fā)酵罐。雙種法：兩只種子罐接種一只發(fā)酵罐。倒種法：從發(fā)酵罐中取出一定量發(fā)酵液，接種到另一個發(fā)酵罐。1．孢子制備

2.生產(chǎn)種子制備種子活化：將保存菌種接種在固體培養(yǎng)基上，在適宜條件下培養(yǎng)，恢復其固有生物特性。放線菌孢子：采用瓊脂斜面培養(yǎng)基。霉菌孢子：大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。細菌：采用碳源有限而氮源豐富的配方。搖瓶種子制備：母瓶、子瓶。種子罐種子制備：一級、二級、三級種子。種子罐級數(shù)：制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)確定種子級數(shù)的因素:1、菌種生長特性及菌體繁殖速度：生長快，少2、發(fā)酵罐的容積：越大，多3、產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模：越大，多4、所選用工藝條件：有利于生長的工藝，少培養(yǎng)技術(shù):1、固體表面培養(yǎng)技術(shù)：Solidsurfaceculture原始，最早采用。2、液體深層培養(yǎng)：Liquidsubmergedculture主要的發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)3、高密度培養(yǎng)highcelldensityculture(1)概念：菌體濃度（干重）至少達到50g/L以上的一種理想培養(yǎng)，發(fā)酵工藝目標和方向明確。(2)優(yōu)點:縮小發(fā)酵體積,增加表達量,成本低，生產(chǎn)率高。發(fā)酵培養(yǎng)的操作方式1、分批式操作：間歇式操作；不連續(xù)操作培養(yǎng)液一次性裝入發(fā)酵罐，一次性接種，經(jīng)過一段時間培養(yǎng)，一次性卸出全部培養(yǎng)物。2、流加式操作：補料－分批式操作；裝入大部分培養(yǎng)液，一次性接種，在培養(yǎng)過程中連續(xù)不斷補充新培養(yǎng)基，但不取出培養(yǎng)液。3、半連續(xù)式操作：反復分批式或換液培養(yǎng)培養(yǎng)液一起裝入發(fā)酵罐，一次性接種；間歇取出部分發(fā)酵培養(yǎng)物，同時補充同等數(shù)量的新培養(yǎng)基；然后繼續(xù)培養(yǎng)，直至發(fā)酵結(jié)束4、連續(xù)式操作：衡態(tài)操作，培養(yǎng)液一起裝入發(fā)酵罐，接種后培養(yǎng)過程中，不斷補充新培養(yǎng)基,同時取出包括培養(yǎng)液和菌體在內(nèi)的發(fā)酵液，直至發(fā)酵結(jié)束。5、灌流式操作：培養(yǎng)液一起裝入發(fā)酵罐，接種后培養(yǎng)過程中，不斷補充新培養(yǎng)基，取出部分符合條件培養(yǎng)基，菌體仍然滯留罐內(nèi)。8.7發(fā)酵培養(yǎng)工藝控制

微生物發(fā)酵生產(chǎn)水平取決于:生產(chǎn)菌種性能與合適的環(huán)境條件，發(fā)酵過程各種參數(shù)處于不斷變化狀態(tài)，關(guān)鍵在于過程檢測與控制。生物學檢測主要的參數(shù)與控制：1.細胞形態(tài)應(yīng)用：是否污染，發(fā)酵過程狀態(tài)，菌種的真實性。2.菌體濃度：單位體積制發(fā)酵培養(yǎng)液內(nèi)菌體細胞的含量，干重或鮮重、細胞數(shù)目表示。應(yīng)用：決定適宜補料量、供氧量等，以得到最佳生產(chǎn)水平。臨界菌體濃度控制：攝氧速率與氧傳遞速率平衡時的菌體濃度菌體遺傳特性與發(fā)酵罐氧傳質(zhì)特性的綜合反映控制策略：中間補料、控制CO2和O2量?；瘜W參數(shù)的檢測與控制基質(zhì)濃度：發(fā)酵液中糖、氮、磷等發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度檢測：在線或離線。補料控制：經(jīng)驗方法和動力學方法。補料時間、數(shù)量和方式：代謝類型pH：發(fā)酵中pH的變化是酸和堿綜合表現(xiàn)。酸的來源：糖類原料中的酸性雜質(zhì)；糖在高溫滅菌中氧化或反應(yīng)生成酸；糖被代謝生成有機酸，分泌到培養(yǎng)液。堿的來源：水解酪蛋白和酵母粉等作為碳源利用。分階段控制：生長最適pH和產(chǎn)物最適pH。緩沖液控制：碳酸鈣和磷酸鹽緩沖液。補加酸或堿進行控制：補料方式控制:流加糖率來控制pH。3.溶解氧的檢測與控制溶解氧：溶于培養(yǎng)液中的氧含量檢測：在線溶氧電極?？刂撇呗裕汗?yīng)量和需要量二個方面考使之需氧不超過設(shè)備的供氧能力。4.廢氣檢測與控制廢氣中的氧含量和細胞的攝氧速率有關(guān)應(yīng)用于計算：細胞的攝氧速率、呼吸速率和發(fā)酵罐的供氧能力。5.其他工藝條件改變培養(yǎng)基粘度液化培養(yǎng)基中間補水添加表面活性劑等間接策略:控制菌體濃度泡沫foam的檢測與控制概念：氣體分散在少量液體中，氣體與液體之間被一層液膜隔開就形成了泡沫。發(fā)泡原因：快速攪拌、滅菌體積太大或不徹底發(fā)泡物質(zhì)：蛋白質(zhì)類、糖類，黃豆餅粉，代謝產(chǎn)物。發(fā)泡影響：減少裝料量，降低氧傳遞。逃液，增加了污染，甚至無法攪拌。菌體呼吸受阻，代謝異?；蜃匀?。2、泡沫控制機械消沫：機械強烈震動或壓力變化使泡沫破裂。優(yōu)點：節(jié)省原料，污染機會低，但效果不理想?；瘜W消沫：用消沫劑消沫。機理：加入消沫劑，降低了泡沫的液膜強度和表面黏度，使泡沫破裂。發(fā)酵終點的判斷原料和發(fā)酵成本的影響因素：產(chǎn)率：單位體積、單位時間內(nèi)的產(chǎn)量得率：轉(zhuǎn)化率，單位原料生產(chǎn)的產(chǎn)物量發(fā)酵系數(shù)：單位發(fā)酵周期內(nèi)發(fā)酵體積生成產(chǎn)物體積產(chǎn)率：發(fā)酵單位除以總發(fā)酵時間判斷依據(jù)：最低成本獲得最大生產(chǎn)能力的時間。1、經(jīng)濟原則：在最大生產(chǎn)率時，終止發(fā)酵。發(fā)酵總生產(chǎn)周期：最短2、產(chǎn)品質(zhì)量原則：產(chǎn)物濃度，過濾速度，菌體形態(tài)，氨基氮，pH，DO，發(fā)酵液的外觀和粘度等。一般自溶前放罐，按照常規(guī)經(jīng)驗計劃進行作業(yè)。特殊因素：染菌、代謝異常等情況。第一節(jié)藥事管理的任務(wù)和性質(zhì)1.藥事包括七個方面:藥學研究與開發(fā),藥品生產(chǎn),藥品經(jīng)營,藥檢驗,藥品使用,藥品管理，藥學教育。2.藥品的特殊性(1).專屬性:處方藥和非處方藥(2).兩重性(3).藥品的質(zhì)量和重要性:(藥品的有效性,毒副作用限定性,穩(wěn)定性,均一性)(4).藥品的時限性(有保質(zhì)期)3.假藥:藥品所含成分與國家藥品標準規(guī)定的成分不符,以非藥品冒充或者用其他種藥品冒充此種藥品。4.劣藥：藥品成分不符合國家藥品標準。5.醫(yī)藥行業(yè)的基本特征和我國醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的特點：（1）醫(yī)藥行業(yè)的基本特點：A.持續(xù)的朝陽產(chǎn)業(yè)B.全球性競爭產(chǎn)業(yè)C.回報豐厚的產(chǎn)業(yè)D.高技術(shù)產(chǎn)業(yè)(2)我國醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的特點:A.醫(yī)藥工業(yè)"一小,二多,三低”B