PCR技術(shù)在乙肝方面的應(yīng)用課件

PCR技術(shù)在乙肝方面的應(yīng)用

TheapplicationofPCRtechniqueinHBV涿州市醫(yī)院檢驗科劉鵬年P(guān)CR技術(shù)在乙肝方面的應(yīng)用

Theapplication1HepatitisBVirus乙型肝炎的病原體在全世界廣泛流行，估計全球半數(shù)以上人口已被HBV感染過。中國：乙肝高發(fā)區(qū)，人群HBsAg的檢出率達(dá)9.8%HepatitisBVirus乙型肝炎的病原體2乙型肝炎病毒感染的現(xiàn)狀全球約有3.5億人感染乙型肝炎病毒，中國有1.2億人感染，其中每年約有1-2%會出現(xiàn)肝硬化或肝癌而死亡。乙型肝炎是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病，它是由乙肝病毒(HBV)感染引起的。全世界乙肝攜帶者達(dá)5億之多，我國是乙肝攜帶者高于人群的10％。急性乙肝中有20%會轉(zhuǎn)為慢性，進(jìn)而可能發(fā)展為肝硬化和肝癌，因此，準(zhǔn)確、迅速診斷對乙肝的治療和預(yù)后顯得極為重要。乙型肝炎病毒感染的現(xiàn)狀全球約有3.5億人感染乙型肝炎病毒，中3PCR技術(shù)在乙肝方面的應(yīng)用課件4乙型肝炎病毒屬嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae），基因組長度3.2kb目前感染人類最小的DNA病毒部分雙鏈環(huán)狀DNA。

乙型肝炎病毒屬嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae5HBV基因及編碼蛋白HBV基因及編碼蛋白6HepatitisBVirusHepatitisBVirus7

PCR技術(shù)在乙肝方面的應(yīng)用課件8乙肝的實驗室診斷

（一）生化學(xué)檢查（二）HBV血清學(xué)檢查（三）HBVDNA、基因型和變異檢查乙肝的實驗室診斷

（一）生化學(xué)檢查9生化學(xué)檢查ALT和AST血清膽紅素凝血酶原時間（PT）及PTA膽堿酯酶血清白蛋白甲胎蛋白（AFP）生化學(xué)檢查ALT和AST10生化檢測的局限性敏感度有限代表肝細(xì)胞損害，水平高低不能代表肝儲備能力關(guān)于“膽酶分離”現(xiàn)象生化檢測的局限性敏感度有限11HBV血清學(xué)檢查項目：HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc以及抗-HBcIgM方法ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay，最常用，定性)發(fā)光免疫分析(定量)HBV血清學(xué)檢查12HBsAg–感染的標(biāo)志Anti-HBs–既往感染/接種疫苗Anti-HBcIgM–急性感染標(biāo)志Anti-HBcIgG–既往或慢性感染HBeAg–急性病毒復(fù)制，有傳染性

Anti-HBe–病毒不再復(fù)制HBV-DNA–急性病毒復(fù)制，比HBeAg更準(zhǔn)確；主要用于監(jiān)測治療反應(yīng)HBsAg–感染的標(biāo)志13血清學(xué)檢測的臨床意義HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc臨床意義

急性或慢性感染(大三陽)+-+-++++乙肝后期或慢性感染(小三陽)--++---潛伏期或急性乙肝早期--+++痊愈或恢復(fù)期,有免疫力-----+++--痊愈,有免疫力疫苗接種或曾經(jīng)感染過,有免疫力血清學(xué)檢測的臨床意義HBsAg抗-HBsHBeAg抗-14血清學(xué)檢測的局限性HBV具有“檢測窗口期”假陰性結(jié)果無法檢測突變株及抗體血清學(xué)檢測的局限性HBV具有“檢測窗口期”15SymptomsHBeAganti-HBeIgGanti-HBcIgManti-HBcanti-HBsHBsAg0481216202428323652100AcuteHBVInfectionwithRecoveryTypicalSerologicCourseWeeksafterExposureTitreSymptomsHBeAganti-HBeIgGanti-16IgManti-HBcIgGanti-HBcHBsAgAcute(6months)HBeAgChronic(Years)anti-HBe0481216202428323652YearsWeeksafterExposureTitreProgressiontoChronicHBVInfectionTypicalSerologicCourseIgManti-HBcIgGanti-HBcHBsAgA17PCR技術(shù)在乙肝方面的應(yīng)用課件18PCR技術(shù)檢測HBVDNAPCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)于1983年由美國Cetus公司的K.Mullis建立，并和定點突變的發(fā)明者M(jìn).Smith一起榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎，為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究開創(chuàng)了嶄新時代。PCR技術(shù)檢測HBVDNA19PCR概念

PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。是一項DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA。PCR技術(shù)在乙肝方面的應(yīng)用課件20PCR反應(yīng)的特點特異性強(qiáng)引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實性靈敏度高指數(shù)增長，從pg(10-12)可擴(kuò)增至mg(10-6)水平簡便、快速2小時完成擴(kuò)增對標(biāo)本的純度要求低DNA粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板PCR反應(yīng)的特點特異性強(qiáng)21PCR反應(yīng)過程DNA的體外復(fù)制包括3個步驟：變性（denaturation）:94C

30s

退火（annealing）:55C30s延伸（extension）:72C30-60s

3個步驟作為PCR的一個循環(huán)，每當(dāng)完成一個循環(huán)，一個分子的模板被復(fù)制為二個，產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長。PCR反應(yīng)過程DNA的體外復(fù)制包括3個步驟：22PCR技術(shù)在乙肝方面的應(yīng)用課件23

24普通PCR技術(shù)的缺點普通PCR臨床檢測技術(shù)雖然解決了檢出率低、周期長的問題，但由于假陽性率高，不能正確指導(dǎo)臨床實踐。因此國家衛(wèi)生部曾在1997年行文禁止將普通PCR技術(shù)用于臨床診斷。

普通PCR技術(shù)的缺點普通PCR臨床檢測技術(shù)雖然解決了檢出率低25定量PCR的特點

采用閉管檢測，不需PCR后處理，并采用dUTP-UNG酶的防污染系統(tǒng)，擴(kuò)增和檢測一次同時完成。不需開蓋，不產(chǎn)生污染。避免了假陽性。探針與被檢DNA序列特異雜交，增強(qiáng)了特異性。定量PCR的特點26定量PCR的特點可定量結(jié)果，準(zhǔn)確靈敏地反應(yīng)了病原體的感染和治療恢復(fù)情況。光譜分析儀直讀結(jié)果，自動分析，增強(qiáng)了靈敏性和客觀性。定量PCR的特點可定量結(jié)果，準(zhǔn)確靈敏地反應(yīng)了病原體的感染和治27HBVDNA檢測方法的比較

斑點雜交PCR定量PCR敏感性低

較高

高特異性高稍低高重復(fù)性好稍差好定量范圍466簡便較繁瑣簡便簡便安全性好稍差好設(shè)備便宜稍貴昂貴技術(shù)要求低高高檢測價格低中高HBVDNA檢測方法的比較斑點雜交28

為什么建議每個病人都要進(jìn)行HBVDNA檢測？

29

HBVDNA檢測的臨床意義⒈診斷方面：⑴HBVDNA是HBV存在最直接的依據(jù)⑵HBVDNA是HBV復(fù)制的標(biāo)志⑶HBVDNA是患者具有傳染性的標(biāo)志HBVDNA檢測的臨床意義30HBVDNA檢測的臨床意義

⑷對HBV-M起補(bǔ)充作用：①HBeAg(﹣)/抗HBe(﹢)乙型肝炎（前C區(qū)變異）②HBsAg(﹣)乙型肝炎（S區(qū)變異）③低水平感染單項抗HBc(﹢)乙型肝炎

HBVDNA檢測的臨床意義⑷對HBV-M起補(bǔ)充作31HBV基因及編碼蛋白HBV基因及編碼蛋白32HBVDNA檢測的臨床意義

⒉療效判斷：HBVDNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標(biāo)

⒊預(yù)后判斷HBVDNA水平與病情有一定的關(guān)系HBVDNA檢測的臨床意義⒉療效判斷：33

HBV-M與HBVDNA關(guān)系

廣東四川湖南解放軍南方醫(yī)院

“大三陽”86.2﹡85.087.394.3893.4“小三陽”35.120.325.627.323.8“小二陽”40.727.648.838.5630.5抗HBc11.510.819.3抗HBs3.609.70三抗體陽5.01.110.0全陰04.0調(diào)查總例數(shù)14742828814838773＊HBVDNA陽性率HBV-M與HBVDNA關(guān)系

34HBVDNA檢測的臨床意義

調(diào)查表明并不是所有“大三陽”的病人都處于HBV復(fù)制期，具有傳染性；也不是所有“小三陽”的病人HBV都無復(fù)制。因此，要準(zhǔn)確知道HBV是否處于復(fù)制狀態(tài)，最準(zhǔn)確的方法還是通過檢測HBVDNA來決定。HBVDNA檢測的臨床意義調(diào)查表明并不是35HBV-DNA定量檢測的臨床應(yīng)用慢性乙肝診斷治療監(jiān)測和療效評價跟蹤隨訪預(yù)后判斷HBV-DNA定量檢測的臨床應(yīng)用慢性乙肝診斷36HBV-DNA定量—

慢性乙肝的診斷HBsAg陽性六個月以上ALT持續(xù)升高或反復(fù)升高HBV-DNA大于105拷貝/毫升（HBeAg陽性）或104拷貝/毫升（HBeAg陰性）HBV-DNA定量—

慢性乙肝的診斷HBs37HBV-DNA定量—

慢性乙肝的治療監(jiān)測治療前檢測患者的基線水平（ALT、HBV-DNA）治療開始后前三個月每月一次、以后每三個月一次檢測ALT、HBV-DNA，對于HBeAg陽性患者，還需檢測HBeAg如果治療期間HBV-DNA水平降低兩個數(shù)量級，可以認(rèn)為治療有效HBV-DNA定量—

慢性乙肝的治療監(jiān)測治38HBV-DNA定量—

治療后的隨訪無論有否治療應(yīng)答，都應(yīng)對患者定期隨訪。建議停藥后的前3個月每月1次、以后每3～6個月1次檢測ALT、AST、HBV血清標(biāo)志物和HBVDNA，以及臨床表現(xiàn)和不良反應(yīng)。隨訪至少6-12個月。如病情有變化，可隨時隨訪。HBV-DNA定量—

治療后的隨訪無論有否39HBV拉米夫定耐藥雖然拉米夫定治療慢性乙肝療效顯著，但長期使用拉米夫定會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象使用一年、二年、三年、四年的耐藥比率為：15-32%、38%、56%、67%一旦出現(xiàn)拉米夫定耐藥突變（YMDD變異），大多數(shù)患者會在2-4個月之內(nèi)出現(xiàn)HBV-DNA和ALT反彈HBV拉米夫定耐藥雖然拉米夫定治療慢性乙肝療效顯著，但長期使40

YMDD變異YMDD酪氨酸－蛋氨酸－天門冬氨酸－天門冬氨酸。如發(fā)生YMDD變異，則其中的蛋氨酸（M）突變?yōu)楫惲涟彼幔╥soleucine，I）或纈氨酸（valine，V）形成YIDD變異株或YVDD變異株

。YMDD位于HBV多聚酶的關(guān)鍵功能區(qū)。YMDD變異YMDD41YMDD變異檢測采用實時熒光定量PCR方法，不僅能夠檢測出現(xiàn)的突變類型（YVDD或YIDD），而且能夠確定突變株所占比例，對及時調(diào)整治療方案具有非常重要的意義能夠準(zhǔn)確穩(wěn)定的檢測到1%的突變株，能夠更早發(fā)現(xiàn)耐藥突變，盡早調(diào)整治療方案YMDD變異檢測采用實時熒光定量PCR方法，不僅能夠檢測出現(xiàn)42HBV拉米夫定耐藥突變檢測原理PrimerFPrimer

FPrimer

FProbeProbeProbePrimer

HBVPrimer

YIDDPrimer

YVDDHBV檢測I突變檢測V突變檢測HBV拉米夫定耐藥突變檢測原理PrimerFPrimer43什么時候開始檢測YMDD變異

拉米夫定治療過程中YMDD變異情況治療時間HBVDNA大于104copies/ml例數(shù)YMDD變異例數(shù)*<6個月 6 1（17%）6~12個月 26 14（54%）12~24個月 38 26（68%）24~36個月 38 38（100%）*各組之間兩兩比較均有顯著差異（P<0.05）。什么時候開始檢測YMDD變異

拉米夫定治療過程中YMDD變異44YMDD變異株的動態(tài)變化YMDD變異株的動態(tài)變化45YMDD變異株的動態(tài)變化YMDD變異株的動態(tài)變化46YMDD檢測應(yīng)用方法對接受拉米夫定治療的慢性乙肝患者進(jìn)行耐藥監(jiān)測治療前檢測一次（約有10-20%的人在治療前就有YMDD變異）治療開始后第七個月開始，每三個月檢測一次YMDD檢測應(yīng)用方法對接受拉米夫定治療的慢性乙肝患者進(jìn)行耐藥47慢性乙肝的基因分型乙肝病毒分八個基因型：根據(jù)基因組序列的差異可以分為A～H八種亞型，我國以B型（41%）和C型（53%）為主不同基因型病毒感染的病程和后果不同：C型對肝的損傷比B型嚴(yán)重，基因型C比基因型B更容易發(fā)展成為肝硬化不同的基因型對藥物的應(yīng)答也不一樣：基因型B比基因型C對干擾素治療更敏感慢性乙肝的基因分型乙肝病毒分八個基因型：根據(jù)基因組序列的差異48共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)檢測HBVcccDNA是乙肝病毒前基因組RNA復(fù)制的原始模板只有徹底清除了cccDNA，乙肝的治療才能算真正有效HBVcccDNA可作為評價抗病毒治療效果新的有效指標(biāo)共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)檢測HBVcccDNA49HBV基因及編碼蛋白HBV基因及編碼蛋白50阿德福韋治療乙型肝炎阿德福韋為5’-單磷酸脫氧阿糖腺苷類似物，可明顯抑制HBVDNA復(fù)制HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者，1、2、3年時的耐藥發(fā)生率分別為0%、1.6%、3.1%HBeAg陰性者1、2、3年的耐藥發(fā)生率分別為0%、3.0%、5.9%~11%

阿德福韋治療乙型肝炎阿德福韋為5’-單磷酸脫氧阿糖腺苷類似物511896突變的診療意義G1896A點突變，形成終止密碼子(TAG)，不表達(dá)HBeAg；由于e抗原不能合成，血清中檢測不到HBeAg，但乙肝病毒仍處于復(fù)制狀態(tài)；此類HBeAg陰性乙肝患者更容易發(fā)生嚴(yán)重的肝臟疾病，需接受更為長期的抗病毒治療。

1896突變的診療意義G1896A點突變，形成終止密碼子(52基因檢測在乙肝診療各階段的應(yīng)用藥物治療方案的確定（用藥：干擾素、拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋）藥物治療（療效評價）前C區(qū)1896位點突變檢測跟蹤隨訪乙肝病毒定量檢測確診病毒學(xué)分析乙肝病毒分型檢測拉米夫定耐藥檢測阿德福韋耐藥檢測共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)檢測恩替卡韋耐藥檢測基因檢測在乙肝診療各階段的應(yīng)用藥物治療方案的確定藥物治療前C53謝謝謝謝54PCR技術(shù)在乙肝方面的應(yīng)用

TheapplicationofPCRtechniqueinHBV涿州市醫(yī)院檢驗科劉鵬年P(guān)CR技術(shù)在乙肝方面的應(yīng)用

Theapplication55HepatitisBVirus乙型肝炎的病原體在全世界廣泛流行，估計全球半數(shù)以上人口已被HBV感染過。中國：乙肝高發(fā)區(qū)，人群HBsAg的檢出率達(dá)9.8%HepatitisBVirus乙型肝炎的病原體56乙型肝炎病毒感染的現(xiàn)狀全球約有3.5億人感染乙型肝炎病毒，中國有1.2億人感染，其中每年約有1-2%會出現(xiàn)肝硬化或肝癌而死亡。乙型肝炎是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病，它是由乙肝病毒(HBV)感染引起的。全世界乙肝攜帶者達(dá)5億之多，我國是乙肝攜帶者高于人群的10％。急性乙肝中有20%會轉(zhuǎn)為慢性，進(jìn)而可能發(fā)展為肝硬化和肝癌，因此，準(zhǔn)確、迅速診斷對乙肝的治療和預(yù)后顯得極為重要。乙型肝炎病毒感染的現(xiàn)狀全球約有3.5億人感染乙型肝炎病毒，中57PCR技術(shù)在乙肝方面的應(yīng)用課件58乙型肝炎病毒屬嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae），基因組長度3.2kb目前感染人類最小的DNA病毒部分雙鏈環(huán)狀DNA。

乙型肝炎病毒屬嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae59HBV基因及編碼蛋白HBV基因及編碼蛋白60HepatitisBVirusHepatitisBVirus61

PCR技術(shù)在乙肝方面的應(yīng)用課件62乙肝的實驗室診斷

（一）生化學(xué)檢查（二）HBV血清學(xué)檢查（三）HBVDNA、基因型和變異檢查乙肝的實驗室診斷

（一）生化學(xué)檢查63生化學(xué)檢查ALT和AST血清膽紅素凝血酶原時間（PT）及PTA膽堿酯酶血清白蛋白甲胎蛋白（AFP）生化學(xué)檢查ALT和AST64生化檢測的局限性敏感度有限代表肝細(xì)胞損害，水平高低不能代表肝儲備能力關(guān)于“膽酶分離”現(xiàn)象生化檢測的局限性敏感度有限65HBV血清學(xué)檢查項目：HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc以及抗-HBcIgM方法ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay，最常用，定性)發(fā)光免疫分析(定量)HBV血清學(xué)檢查66HBsAg–感染的標(biāo)志Anti-HBs–既往感染/接種疫苗Anti-HBcIgM–急性感染標(biāo)志Anti-HBcIgG–既往或慢性感染HBeAg–急性病毒復(fù)制，有傳染性

Anti-HBe–病毒不再復(fù)制HBV-DNA–急性病毒復(fù)制，比HBeAg更準(zhǔn)確；主要用于監(jiān)測治療反應(yīng)HBsAg–感染的標(biāo)志67血清學(xué)檢測的臨床意義HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc臨床意義

急性或慢性感染(大三陽)+-+-++++乙肝后期或慢性感染(小三陽)--++---潛伏期或急性乙肝早期--+++痊愈或恢復(fù)期,有免疫力-----+++--痊愈,有免疫力疫苗接種或曾經(jīng)感染過,有免疫力血清學(xué)檢測的臨床意義HBsAg抗-HBsHBeAg抗-68血清學(xué)檢測的局限性HBV具有“檢測窗口期”假陰性結(jié)果無法檢測突變株及抗體血清學(xué)檢測的局限性HBV具有“檢測窗口期”69SymptomsHBeAganti-HBeIgGanti-HBcIgManti-HBcanti-HBsHBsAg0481216202428323652100AcuteHBVInfectionwithRecoveryTypicalSerologicCourseWeeksafterExposureTitreSymptomsHBeAganti-HBeIgGanti-70IgManti-HBcIgGanti-HBcHBsAgAcute(6months)HBeAgChronic(Years)anti-HBe0481216202428323652YearsWeeksafterExposureTitreProgressiontoChronicHBVInfectionTypicalSerologicCourseIgManti-HBcIgGanti-HBcHBsAgA71PCR技術(shù)在乙肝方面的應(yīng)用課件72PCR技術(shù)檢測HBVDNAPCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)于1983年由美國Cetus公司的K.Mullis建立，并和定點突變的發(fā)明者M(jìn).Smith一起榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎，為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究開創(chuàng)了嶄新時代。PCR技術(shù)檢測HBVDNA73PCR概念

PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。是一項DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA。PCR技術(shù)在乙肝方面的應(yīng)用課件74PCR反應(yīng)的特點特異性強(qiáng)引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實性靈敏度高指數(shù)增長，從pg(10-12)可擴(kuò)增至mg(10-6)水平簡便、快速2小時完成擴(kuò)增對標(biāo)本的純度要求低DNA粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板PCR反應(yīng)的特點特異性強(qiáng)75PCR反應(yīng)過程DNA的體外復(fù)制包括3個步驟：變性（denaturation）:94C

30s

退火（annealing）:55C30s延伸（extension）:72C30-60s

3個步驟作為PCR的一個循環(huán)，每當(dāng)完成一個循環(huán)，一個分子的模板被復(fù)制為二個，產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長。PCR反應(yīng)過程DNA的體外復(fù)制包括3個步驟：76PCR技術(shù)在乙肝方面的應(yīng)用課件77

78普通PCR技術(shù)的缺點普通PCR臨床檢測技術(shù)雖然解決了檢出率低、周期長的問題，但由于假陽性率高，不能正確指導(dǎo)臨床實踐。因此國家衛(wèi)生部曾在1997年行文禁止將普通PCR技術(shù)用于臨床診斷。

普通PCR技術(shù)的缺點普通PCR臨床檢測技術(shù)雖然解決了檢出率低79定量PCR的特點

采用閉管檢測，不需PCR后處理，并采用dUTP-UNG酶的防污染系統(tǒng)，擴(kuò)增和檢測一次同時完成。不需開蓋，不產(chǎn)生污染。避免了假陽性。探針與被檢DNA序列特異雜交，增強(qiáng)了特異性。定量PCR的特點80定量PCR的特點可定量結(jié)果，準(zhǔn)確靈敏地反應(yīng)了病原體的感染和治療恢復(fù)情況。光譜分析儀直讀結(jié)果，自動分析，增強(qiáng)了靈敏性和客觀性。定量PCR的特點可定量結(jié)果，準(zhǔn)確靈敏地反應(yīng)了病原體的感染和治81HBVDNA檢測方法的比較

斑點雜交PCR定量PCR敏感性低

較高

高特異性高稍低高重復(fù)性好稍差好定量范圍466簡便較繁瑣簡便簡便安全性好稍差好設(shè)備便宜稍貴昂貴技術(shù)要求低高高檢測價格低中高HBVDNA檢測方法的比較斑點雜交82

為什么建議每個病人都要進(jìn)行HBVDNA檢測？

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HBVDNA檢測的臨床意義⒈診斷方面：⑴HBVDNA是HBV存在最直接的依據(jù)⑵HBVDNA是HBV復(fù)制的標(biāo)志⑶HBVDNA是患者具有傳染性的標(biāo)志HBVDNA檢測的臨床意義84HBVDNA檢測的臨床意義

⑷對HBV-M起補(bǔ)充作用：①HBeAg(﹣)/抗HBe(﹢)乙型肝炎（前C區(qū)變異）②HBsAg(﹣)乙型肝炎（S區(qū)變異）③低水平感染單項抗HBc(﹢)乙型肝炎

HBVDNA檢測的臨床意義⑷對HBV-M起補(bǔ)充作85HBV基因及編碼蛋白HBV基因及編碼蛋白86HBVDNA檢測的臨床意義

⒉療效判斷：HBVDNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標(biāo)

⒊預(yù)后判斷HBVDNA水平與病情有一定的關(guān)系HBVDNA檢測的臨床意義⒉療效判斷：87

HBV-M與HBVDNA關(guān)系

廣東四川湖南解放軍南方醫(yī)院

“大三陽”86.2﹡85.087.394.3893.4“小三陽”35.120.325.627.323.8“小二陽”40.727.648.838.5630.5抗HBc11.510.819.3抗HBs3.609.70三抗體陽5.01.110.0全陰04.0調(diào)查總例數(shù)14742828814838773＊HBVDNA陽性率HBV-M與HBVDNA關(guān)系

88HBVDNA檢測的臨床意義

調(diào)查表明并不是所有“大三陽”的病人都處于HBV復(fù)制期，具有傳染性；也不是所有“小三陽”的病人HBV都無復(fù)制。因此，要準(zhǔn)確知道HBV是否處于復(fù)制狀態(tài)，最準(zhǔn)確的方法還是通過檢測HBVDNA來決定。HBVDNA檢測的臨床意義調(diào)查表明并不是89HBV-DNA定量檢測的臨床應(yīng)用慢性乙肝診斷治療監(jiān)測和療效評價跟蹤隨訪預(yù)后判斷HBV-DNA定量檢測的臨床應(yīng)用慢性乙肝診斷90HBV-DNA定量—

慢性乙肝的診斷HBsAg陽性六個月以上ALT持續(xù)升高或反復(fù)升高HBV-DNA大于105拷貝/毫升（HBeAg陽性）或104拷貝/毫升（HBeAg陰性）HBV-DNA定量—

慢性乙肝的診斷HBs91HBV-DNA定量—

慢性乙肝的治療監(jiān)測治療前檢測患者的基線水平（ALT、HBV-DNA）治療開始后前三個月每月一次、以后每三個月一次檢測ALT、HBV-DNA，對于HBeAg陽性患者，還需檢測HBeAg如果治療期間HBV-DNA水平降低兩個數(shù)量級，可以認(rèn)為治療有效HBV-DNA定量—

慢性乙肝的治療監(jiān)測治92HBV-DNA定量—

治療后的隨訪無論有否治療應(yīng)答，都應(yīng)對患者定期隨訪。建議停藥后的前3個月每月1次、以后每3～6個月1次檢測ALT、AST、HBV血清標(biāo)志物和HBVDNA，以及臨床表現(xiàn)和不良反應(yīng)。隨訪至少6-12個月。如病情有變化，可隨時隨訪。HBV-DNA定量—

治療后的隨訪無論有否93HBV拉米夫定耐藥雖然拉米夫定治療慢性乙肝療效顯著，但長期使用拉米夫定會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象使用一年、二年、三年、四年的耐藥比率為：15-32%、38%、56%、67%一旦出現(xiàn)拉米夫定耐藥突變（YMDD變異），大多數(shù)患者會在2-4個月之內(nèi)出現(xiàn)HBV-DNA和ALT反彈HBV拉米夫定耐藥雖然拉米夫定治療慢性乙肝療效顯著，但長期使94

YMDD變異YMDD酪氨酸－蛋氨酸－天門冬氨酸－天門冬氨酸。如發(fā)生YMDD變異，則其中的蛋氨酸（M）突變?yōu)楫惲涟彼幔╥soleucine，I）或纈氨酸（valine，V）形成YIDD變異株或YVDD變異株

。YMDD位于HBV多聚酶的關(guān)鍵功能區(qū)。YMDD變異YMDD95YMDD變異檢測采用實時熒光定量PCR方法，不僅能夠檢測出現(xiàn)的突變類型（YVDD或YIDD），而且能夠確定突變株所占比例，對及時調(diào)整治療方案具有非常重要的意義能夠準(zhǔn)確穩(wěn)定的檢測到1%的突變株，能夠更早發(fā)現(xiàn)耐藥突變，盡早調(diào)整治療方案YMDD變異檢測采用實時熒光定量PCR方法，不僅能夠檢測出現(xiàn)96HBV拉米夫定耐藥突變檢測原理Pr