SRY基因檢測及在性別鑒定中的應(yīng)用 山東大學(xué)

科曰遺傳學(xué)實驗題目SRY基因檢測及在性別鑒定中的應(yīng)用SRY基因檢測及在性別鑒定中的應(yīng)用摘要SRY基因是人類的性別決定因子，該基因決定雄性的性別。為了驗證SRY基因決定人類的性別表型，我們通過磁珠法分別提前男性和女性發(fā)根細胞中的基因組DNA，設(shè)計符合SRY基因擴增的引物，利用PCR擴增的方法獲得大量SRY基因擴增產(chǎn)物，再通過瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測SRY基因。1.引言SRY基因（sex-determiningregionofY-chromosome,全稱：Y染色體性別決定區(qū)）是決定人類雄性性別的基因，該基因是決定男性睪丸發(fā)育的主要基因。人的SRY基因位于Yp11.3（Y染色體短臂末端），只含有一個外顯子，沒有內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄單位長約1.1kb，編碼一個204氨基酸的蛋白質(zhì)。SRY基因是由Sinclair在1990年發(fā)現(xiàn)的。該基因比較特別。它的序列在不同男性體內(nèi)驚人地相似。研究證明，它的序列幾乎沒有任何突變，從大約20萬年以前人類最后一個共同祖先到現(xiàn)在，它一直沒有變化。受精卵中的X染色體上有決定卵巢發(fā)育的基因，如果SRY基因沒有及時啟動的話，原始性腺就會自然而然地向卵巢方向發(fā)育。當(dāng)SRY基因啟動后，其基因編碼的蛋白質(zhì)需要先進入細胞核，繼而啟動一系列基因的表達，促進胎兒的原始性腺向睪丸方向發(fā)育。然后，這個最初的微小睪丸開始分泌睪酮。睪酮的出現(xiàn)，是SRY基因作為“幕后推手”最重要的價值體現(xiàn)。SRY基因是目前認為的唯一一個性別決定基因。因此在血液，精液樣本中可以通過尋找該基因片斷，達到判斷測試者的性別的目的。通常采用的方法是，先使用PCR技術(shù)擴增該基因上某個片斷，再利用凝膠電泳判斷樣本中是否含有該基因。若測試者是男性，樣本中存在該基因，測試為陽性。女性測試者將會相應(yīng)得到陰性結(jié)果。磁珠法提取基因組DNA原理：磁珠法中的細胞裂解液是一種蛋白變性劑，可使動植物的細胞裂解并使與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)變性、DNA游離釋放，磁珠可以特異性地吸附DNA，通過洗滌去除DNA以外的RNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再用洗脫液解離吸附在磁珠上的DNA，得到純度和濃度均很高的DNA，可用于PCR擴增、酶切、分子雜交等。PCR擴增原理：PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火一延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93°C左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板一引物結(jié)合物在72C、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性一退火一延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2?4分鐘，2?3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。科曰遺傳學(xué)實驗題目SRY基因檢測及在性別鑒定中的應(yīng)用2.材料和方法2.1實驗材料材料：男生和女生的含毛囊的頭發(fā)或口腔脫落的細胞；試劑和儀器：磁珠法提取DNA試劑盒，70%乙醇溶液，TE緩沖液，EB染液，瓊脂糖，6X上樣緩沖液（0.25%漠酚藍，0.25%二甲苯青，30%甘油于水中，4°C貯存），TAE緩沖，PCR擴增儀，加樣器，紫外成像儀，電泳槽；PCR檢測材料：上下游引物、10XPCR緩沖液，25mMMgCl2，2.5mmol/LdNTP原液，1U/plTaq酶溶液，ddH2O。2.2實驗方法2.2.1第一周（5月23日）：獲取實驗材料：分別拔取三根男生和女生的帶有毛囊的頭發(fā)，用清水輕輕沖洗。提取發(fā)根細胞中的基因組DNA：（為了使實驗進行的較快，我們組采用了磁珠法提取DNA的方法）磁珠法：1、向1.5ml離心管加入380MBufferMGL和20MProteinaseK從毛發(fā)根部取1cm長的含毛囊的毛發(fā)加入上述離心管中2、將上述離心管振蕩混勻，65°C水浴20min，間或混勻，使樣品充分裂解。3、向充分裂解的樣品加入400MBufferMA和10MMagicmagbeads，振蕩混勻10s.4、將離心管置于磁力架上，待Magicmagbeads完全吸至管壁上之后，吸棄上清，從磁力架取出離心管。5、加入700M70%乙醇，振蕩混勻10s.將離心管置于磁力架上1min，待Magicmagbeads完全吸至管壁上之后，吸棄上清，從磁力架取出離心管。6、重復(fù)步驟5，室溫開蓋干燥15min至管內(nèi)無殘液。7、加入15-25MTEBuffer,65C水浴20min，間或混勻，離心2min，8、將離心管置于磁力架上1min，待Magicmagbeads完全吸至管壁上之后，吸取上清至新的離心管，即獲得基因組DNA。堿裂解法：1、在一個200ulPCR管中加20pl的0.2mol/LNaOH溶液。剪下帶毛囊的發(fā)根部分，放入管中并蓋上管蓋，放入有熱蓋的PCR儀中，75C溫育30min，以避免水分蒸發(fā)。2、加入50pl的0.04mol/LHCl中和。3、12000r/min離心5min去除未溶解的沉淀物，上清轉(zhuǎn)入1個新管，DNA就在水溶液中。2.2.2第二周（5月30日）設(shè)計引物：根據(jù)人的SRY基因的序列，擴增其基因的序列為：SRY1：5’-TGGGACTGGTGACAATTGTC-3'SRY2：5’-GAGTACAGGTGTGCAGCTCT-3'PCR反應(yīng)：1、按照設(shè)計的反應(yīng)體系，分別在0.2ml離心管中（22pl/管）中加入下列試劑:試劑名稱加入試劑的量/pl（終濃度）10XPCR緩沖液2.525mMMgCl22(2mM)2.5mmol/LdNTP2(0.2mmol/L)科曰遺傳學(xué)實驗題目SRY基因檢測及在性別鑒定中的應(yīng)用10umol/LSRY引物11(0.4umol/L)10umol/LSRY引物21(0.4umol/L)1U/plTaq酶溶液0.5(2U/100pl)ddH2O13男生/女生的DNA3體系總量252、混勻，瞬時離心。3、PCR擴增：變性94C3min變性94C30s復(fù)性50C30s循環(huán)35次延伸72C30s延伸72C5min保溫10C84、擴增產(chǎn)物冷卻至室溫可于4C保存。2.2.3第三周（6月6日）電泳檢測：1、制備2%的瓊脂糖凝膠：稱取8.0g瓊脂糖粉末，放到一錐形瓶中，加入40ml的1XTAE電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至完全溶化，溶液透明。稍搖勻，得膠液。靜置放置冷卻至60r左右。取有機玻璃制膠板槽，水平放置膠槽，在一端插好梳子，在槽內(nèi)緩慢倒入已冷至60°C左右的膠液，使之形成均勻水平的膠面。待膠凝固后，小心拔起梳子，使加樣孔端置陰極段放進電泳槽內(nèi)。在槽內(nèi)加入1XTAE電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面。2、電泳：取8plPCR產(chǎn)物，加2ul上樣緩沖液，混勻，點樣，同時點DNA分子量marker。在5V/cm的電壓下電泳。3、染色及紫外成像：電泳結(jié)束后用EB染色20min，紫外檢測觀察并導(dǎo)出圖像。3.結(jié)果3.1電泳結(jié)果科曰遺傳學(xué)實驗題目SRY基因檢測及在性別鑒定中的應(yīng)用膠板23.2結(jié)果分析Marker:ADNA/HindIII；膠板1第3泳道：本組女生頭發(fā)實驗組；膠板2第15泳道：本組男生頭發(fā)實驗組。理論結(jié)果：男性樣品可以見到一條約239bp的陽性擴增片段。女性樣品為陰性擴增片段。實際結(jié)果：女性樣品中出現(xiàn)一條約2000bp左右的片段。男性樣品中也有一條比較模糊的2000bp左右的條帶。證明沒有擴增出SRY基因。觀察其他組的實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)男性和女性的樣品都沒有擴增出SRY基因，而且好幾組出現(xiàn)了明顯的多條帶，即非特異性擴增條帶。我們認為實際結(jié)果與理論不符合的原因可能有：①引物設(shè)計的不合理，沒有擴增出特異性片段；②樣品濃度太低，導(dǎo)致特異性擴增片段量太少顏色過淺無法觀察出來；③凝膠做的不好。理論上2%的瓊脂糖凝膠應(yīng)該可以分離出0.1-3kb的DNA片段，但實際電泳結(jié)果中ADNA/HindIIIMarker的564bp和125bp的小片段條帶也沒有出現(xiàn)。所以我們認為可能與膠板有關(guān)。4.討論4.1注意事項及改進之處：在樣本選擇上，可以換用外周血或唾液來重新檢測，發(fā)囊細胞中提取出來的基因組DNA比較少。在磁珠法提取基因組DNA時，一定要注意不要把磁珠吸出來，磁珠上吸附有DNA，吸出磁珠即意味著DNA的損失。可以查閱相關(guān)資料后，再設(shè)計新的一對合適的引物和PCR反應(yīng)，重新檢測SRY基因。4.2擴展知識1.SRY基因PCR擴增檢測性別的方法可對一滴血、一根毛發(fā)、多年的尸塊、胎兒、有爭議的性別等進行性別鑒定?？梢詮V泛應(yīng)用于法醫(yī)鑒定、無創(chuàng)孕期胎兒性別鑒定以預(yù)防乂連鎖隱性遺傳病患兒的出生以及對有性別爭議的運動員體檢等方面。2.最新的研究也發(fā)現(xiàn)，SRY基因不僅在決定性別方面起著決定作用，對調(diào)節(jié)大腦功能也具有重要意義。神經(jīng)物質(zhì)多巴胺被認為與帕金森氏癥有重要關(guān)聯(lián)，而美國科學(xué)家近日首次發(fā)現(xiàn)