食源性致病菌檢驗(yàn)技術(shù)及質(zhì)量控制課件

食源性致病菌檢驗(yàn)技術(shù)

及質(zhì)量控制

食源性致病菌檢驗(yàn)技術(shù)

及質(zhì)量控制1內(nèi)容1.創(chuàng)傷弧菌檢驗(yàn)2.大腸菌群檢驗(yàn)3.沙門氏菌檢驗(yàn)4.大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn)5.副溶血弧菌檢驗(yàn)6.空腸彎曲菌檢驗(yàn)7.金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)8.單核細(xì)胞增生李斯特菌檢驗(yàn)9.阪崎腸桿菌檢驗(yàn)10.質(zhì)量控制內(nèi)容1.創(chuàng)傷弧菌檢驗(yàn)2創(chuàng)傷弧菌檢驗(yàn)創(chuàng)傷弧菌檢驗(yàn)3沒(méi)有國(guó)標(biāo)食物中毒診斷國(guó)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)美國(guó)FDABAM網(wǎng)絡(luò)版第9章弧菌2004NMKL食品中致病性弧菌的檢驗(yàn)1997加拿大魚(yú)和海產(chǎn)品創(chuàng)傷弧菌的分離計(jì)數(shù)MFLP-731995日本食品衛(wèi)生檢查指征2004沒(méi)有國(guó)標(biāo)4選擇性增菌液堿性蛋白胨水選擇性分離培養(yǎng)基

硫代硫酸鹽－檸檬酸鹽－膽鹽－蔗糖（TCBS）瓊脂改良纖維二糖-多粘菌素B-多粘菌素E（mCPC）瓊脂和纖維二糖-多粘菌素E（CC）瓊脂平板

―探針克隆雜交顯示，兩種平板上均有95％以上的可疑菌落為創(chuàng)傷弧菌選擇性增菌液5引起胃腸炎、傷口感染和原發(fā)性敗血癥人類感染是因?yàn)槭秤蒙虬肷氖芪廴竞．a(chǎn)品,或是因?yàn)閭诮佑|了帶菌的海水或海洋動(dòng)物罹患肝病、血色病的個(gè)體易感者及免疫功能低下者,一旦感染創(chuàng)傷弧菌,更容易發(fā)生致命的傷口感染和原發(fā)性敗血癥,后者的病死率超過(guò)50％創(chuàng)傷弧菌是美國(guó)海產(chǎn)品消費(fèi)引起死亡的首要原因,美國(guó)州際貝類衛(wèi)生委員會(huì)規(guī)定,收獲后經(jīng)處理的牡蠣中創(chuàng)傷弧菌限量不超過(guò)30CFU/g。估計(jì)日本每年創(chuàng)傷弧菌敗血癥病例數(shù)約為425例。大陸沿海地區(qū)也時(shí)有創(chuàng)傷弧菌散發(fā)感染的報(bào)告引起胃腸炎、傷口感染和原發(fā)性敗血癥6創(chuàng)傷弧菌（Vibriovulnificus）1976年首次發(fā)現(xiàn)引起傷口感染致死性的原發(fā)性敗血癥胃腸道感染曾稱為乳糖陽(yáng)性弧菌革蘭氏陰性嗜鹽菌兼性厭氧3個(gè)生物型創(chuàng)傷弧菌（Vibriovulnificus）1976年首次736℃±1℃，18h～24h39℃～40℃或36℃±1℃，18h～24h36℃±1℃，12h～16h樣品25g（mL）+225mL3％氯化鈉堿性蛋白胨水3％氯化鈉堿性蛋白胨水3管×3個(gè)合適的稀釋度如果進(jìn)行定性檢測(cè)，則不需要進(jìn)行此步驟挑取可疑菌落，接種于3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂生化試驗(yàn)或選用API20E生化鑒定試劑盒結(jié)果報(bào)告改良纖維二糖-多粘菌素B-多粘菌素E瓊脂或纖維二糖-多粘菌素E瓊脂劃線分離篩選試驗(yàn)氧化酶試驗(yàn)，革蘭氏染色，3％氯化鈉三糖鐵瓊脂，嗜鹽性試驗(yàn)36℃±1℃，18h～24h39℃～40℃或368樣品制備非冷凍樣品采集后應(yīng)立即置7℃～10℃冰箱保存，盡可能及早檢驗(yàn)；冷凍樣品應(yīng)在45℃以下不超過(guò)15min或在2℃～5℃不超過(guò)18h解凍；如果樣品需要冷凍貯存，應(yīng)在樣品中加等量緩沖甘油-氯化鈉溶液（液體樣品應(yīng)加雙料），推薦貯存溫度為-70℃以下。魚(yú)類和頭足類動(dòng)物取表面組織、腸或鰓。貝類取全部?jī)?nèi)容物，包括貝肉和體液；甲殼類取整個(gè)動(dòng)物，或者動(dòng)物的中心部分，包括腸和鰓。如為帶殼貝類或甲殼類，則應(yīng)先在自來(lái)水中洗刷外殼并甩干表面水分，然后以無(wú)菌操作打開(kāi)外殼，按上述要求取相應(yīng)部分。樣品制備非冷凍樣品采集后應(yīng)立即置7℃～10℃冰箱保存，盡可能9以無(wú)菌操作取檢樣25g（mL），加入3％氯化鈉堿性蛋白胨水225mL，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以8000r/min均質(zhì)1min，或拍擊式均質(zhì)器拍擊2min，制備成1:10的均勻稀釋液。如無(wú)均質(zhì)器，則將樣品放入無(wú)菌乳缽中磨碎，然后放在500mL的滅菌容器內(nèi)，加225mL3％氯化鈉堿性蛋白胨水，并充分振蕩。以無(wú)菌操作取檢樣25g（mL），加入3％氯化鈉堿性蛋白胨水10增菌定性檢測(cè)將上述1:10稀釋液于36℃±1℃培養(yǎng)12h～16h。增菌定性檢測(cè)11定量檢測(cè)用滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL，注入含有9mL3％氯化鈉堿性蛋白胨水的試管內(nèi)，充分混勻，制備1:100的稀釋液。另取1mL滅菌吸管，按上條操作依次制備10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管。根據(jù)對(duì)檢樣污染情況的估計(jì)，選擇三個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三支含有9mL3％氯化鈉堿性蛋白胨水的試管，每管接種1mL。置36℃±1℃恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)12h～16h。定量檢測(cè)12分離對(duì)所有顯示生長(zhǎng)的增菌液，用接種環(huán)在距離液面以下1cm內(nèi)沾取一環(huán)，于mCPC或CC平板上劃線分離。一支試管劃線一塊平板。于39℃～40℃或36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。分離對(duì)所有顯示生長(zhǎng)的增菌液，用接種環(huán)在距離液面以下1cm內(nèi)13分離平板——mCPC和CC典型的創(chuàng)傷弧菌在mCPC和CC平板上呈現(xiàn)為圓的、扁平的、中心不透明邊緣透明的黃色菌落，直徑1mm～2mm。分離平板——mCPC和CC典型的創(chuàng)傷弧菌在mCPC和C14純培養(yǎng)挑取三個(gè)或以上的可疑菌落，劃線3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。純培養(yǎng)挑取三個(gè)或以上的可疑菌落，劃線3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊15初步鑒定氧化酶試驗(yàn)：挑選純培養(yǎng)的單個(gè)菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，創(chuàng)傷弧菌為氧化酶陽(yáng)性。涂片鏡檢：將可疑菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察形態(tài)。創(chuàng)傷弧菌為革蘭氏陰性，呈棒狀或弧狀。挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，轉(zhuǎn)種3％氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層，36℃±1℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。創(chuàng)傷弧菌在3％氯化鈉三糖鐵瓊脂中的反應(yīng)為底層變黃不變黑，無(wú)氣泡，斜面顏色不變或紅色加深，偶爾斜面變黃。初步鑒定氧化酶試驗(yàn)：挑選純培養(yǎng)的單個(gè)菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，創(chuàng)傷16V-P試驗(yàn)：以接種針由3％氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面挑取少許培養(yǎng)物穿刺3％氯化鈉MR-VP培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)24h，在加V-P試劑前應(yīng)先觀察動(dòng)力。沿穿刺線周圍呈擴(kuò)散性生長(zhǎng)為動(dòng)力陽(yáng)性。嗜鹽性試驗(yàn)：挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，分別接種于不同氯化鈉濃度的胰胨水，36℃±1℃培養(yǎng)24h，觀察液體混濁情況。創(chuàng)傷弧菌在無(wú)氯化鈉、8％氯化鈉和10％氯化鈉的胰胨水中不生長(zhǎng)，在6％氯化鈉的胰胨水中生長(zhǎng)旺盛。V-P試驗(yàn)：以接種針由3％氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面挑取少許培養(yǎng)物17確定鑒定生化試驗(yàn)：取純培養(yǎng)物分別接種含3％氯化鈉的賴氨酸培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h后觀察結(jié)果。隔夜培養(yǎng)物進(jìn)行ONPG試驗(yàn)。API20E生化鑒定試劑盒：刮取3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上的單個(gè)菌落，用3％氯化鈉溶液制備成濁度適當(dāng)?shù)募?xì)菌懸浮液，使用API20E生化鑒定試劑盒鑒定。確定鑒定生化試驗(yàn)：取純培養(yǎng)物分別接種含3％氯化鈉的賴氨酸培養(yǎng)18創(chuàng)傷弧菌的生化性狀試驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果革蘭氏染色鏡檢陰性，棒狀或弧狀氧化酶＋動(dòng)力＋D-纖維二糖＋蔗糖－葡萄糖＋分解葡萄糖產(chǎn)氣－乳糖＋，或遲緩＋硫化氫－賴氨酸脫羧酶＋V-P－ONPG＋注：＋陽(yáng)性；－陰性。創(chuàng)傷弧菌的生化性狀試驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果革蘭氏染色鏡檢陰性，棒狀或弧狀19報(bào)告當(dāng)檢出的可疑菌落生化性狀符合表1要求時(shí)，報(bào)告25g（mL）樣品中檢出創(chuàng)傷弧菌。如果進(jìn)行定量檢測(cè)，根據(jù)證實(shí)為創(chuàng)傷弧菌陽(yáng)性的試管管數(shù)，查最可能數(shù)（MPN）檢索表，報(bào)告每g（mL）創(chuàng)傷弧菌的MPN值。報(bào)告當(dāng)檢出的可疑菌落生化性狀符合表1要求時(shí)，報(bào)告25g（m20大腸菌群檢驗(yàn)大腸菌群檢驗(yàn)21大腸菌群定義：一群在36℃條件下培養(yǎng)24~48小時(shí)能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。衛(wèi)生學(xué)概念，包括埃希氏菌屬，克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬和檸檬酸桿菌屬等的細(xì)菌檢驗(yàn)比較簡(jiǎn)單，所以被廣泛用做水源的衛(wèi)生指標(biāo)和食品加工衛(wèi)生狀況的通用指標(biāo)大腸菌群定義：一群在36℃條件下培養(yǎng)24~48小時(shí)能發(fā)酵乳糖22大腸菌群計(jì)數(shù)第一法MPN法第二法平板計(jì)數(shù)法第三法Petrifilm測(cè)試片法大腸菌群計(jì)數(shù)第一法MPN法23第一法MPN法與原4789.3的不同操作步驟不同原方法：初發(fā)酵→EMB分離培養(yǎng)→染色，復(fù)發(fā)酵→報(bào)告現(xiàn)方法：LST初發(fā)酵→BGLB驗(yàn)證→報(bào)告第一法MPN法與原4789.3的不同24初發(fā)酵培養(yǎng)基不同原方法：乳糖膽鹽肉湯現(xiàn)方法：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯LST肉湯是國(guó)際上通用的培養(yǎng)基。與乳糖膽鹽肉湯的作用和意義相同，但具有更多的優(yōu)越性，LST中的選擇性抑菌劑是月桂基硫酸鹽，相對(duì)于膽鹽穩(wěn)定性更好些。還有就是LST更容易觀察。初發(fā)酵培養(yǎng)基不同25結(jié)果報(bào)告單位不同原方法：MPN/100g(mL)現(xiàn)方法：MPN/g(mL)結(jié)果報(bào)告單位不同26食源性致病菌檢驗(yàn)技術(shù)及質(zhì)量控制課件27大腸菌群PetrifilmTM測(cè)試片法PetrifilmTM大腸菌群測(cè)試片是一種預(yù)先制備好的培養(yǎng)基系統(tǒng)，含有VRB培養(yǎng)基，冷水可溶性凝膠和TTC指示劑，可增強(qiáng)菌落計(jì)數(shù)效果。表面覆蓋的膠膜，可截留發(fā)酵乳糖的大腸菌群產(chǎn)生的氣體。培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)數(shù)紅點(diǎn)周圍有氣泡的菌落為大腸菌群數(shù)。

大腸菌群PetrifilmTM測(cè)試片法PetrifilmTM28檢樣25g(ml)樣品＋225ml稀釋液,均質(zhì)↓稀釋↓接種PetrifilmTM大腸菌群測(cè)試片↓培養(yǎng)↓

361C24h2h

計(jì)數(shù)紅色帶氣泡的菌落↓計(jì)算菌落總數(shù)↓報(bào)告檢樣↓稀釋↓接種PetrifilmTM大腸菌群測(cè)試片↓培養(yǎng)↓29樣品制備按大腸菌群MPN法的樣品制備方法進(jìn)行。樣品pH的調(diào)節(jié)同大腸菌群MPN法中樣品pH的調(diào)節(jié)。即樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5～7.5之間，pH值過(guò)低或過(guò)高時(shí)分別用1MNaOH或1MHCl予以調(diào)節(jié)。樣品制備按大腸菌群MPN法的樣品制備方法進(jìn)行。30樣品的接種與培養(yǎng)將待檢樣品選取適宜的2~3個(gè)連續(xù)稀釋度,每個(gè)稀釋度接種2張測(cè)試片。將PetrifilmTM大腸菌群測(cè)試片置于平坦實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，揭開(kāi)上層膜，用吸管吸取1mL樣液垂直滴加在測(cè)試片的中央，將上層膜緩慢蓋下，避免氣泡產(chǎn)生和上層膜直接落下，把壓板（平面底朝下）放置在上層膜中央，輕輕地壓下，使樣液均勻覆蓋于圓形的培養(yǎng)面積上，切勿扭轉(zhuǎn)壓板。拿起壓板，靜置至少1分鐘以使培養(yǎng)基凝固。將測(cè)試片的透明面朝上置于培養(yǎng)箱內(nèi)，堆疊片數(shù)不超過(guò)20片，36C±1C培養(yǎng)24h2h。樣品的接種與培養(yǎng)將待檢樣品選取適宜的2~3個(gè)連續(xù)稀釋度,每31判讀培養(yǎng)24h2h后應(yīng)立即計(jì)數(shù)，可目測(cè)、用標(biāo)準(zhǔn)菌落計(jì)數(shù)器、顯微鏡、或PetrifilmTM自動(dòng)判讀儀來(lái)計(jì)數(shù)。紅色有氣泡的菌落確認(rèn)為大腸菌群數(shù)。培養(yǎng)圓形面積邊緣上及邊緣以外的菌落不作計(jì)數(shù)。當(dāng)培養(yǎng)區(qū)域出現(xiàn)大量氣泡，大量不明顯小菌落或培養(yǎng)區(qū)呈暗紅色三種情況，表明大腸菌群的濃度較高，需要進(jìn)一步稀釋樣品來(lái)獲得準(zhǔn)確的讀數(shù)。判讀培養(yǎng)24h2h后應(yīng)立即計(jì)數(shù)，可目測(cè)、用標(biāo)準(zhǔn)菌落計(jì)數(shù)32結(jié)果報(bào)告1)選取菌落數(shù)在15~150之間的測(cè)試片作為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn);2)選擇菌落數(shù)在15~150之間的稀釋度，平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之；3)如果所有稀釋度測(cè)試片上的菌落數(shù)都小于15,則計(jì)數(shù)稀釋度最低的測(cè)試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之；4)如果所有稀釋度的測(cè)試片上均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以(<)1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之；5)如果最高稀釋度的菌落數(shù)大于150個(gè)時(shí)，計(jì)數(shù)最高稀釋度的測(cè)試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之；6)計(jì)數(shù)菌落數(shù)大于150個(gè)的測(cè)試片時(shí)，可計(jì)數(shù)一個(gè)或兩個(gè)具有代表性的方格內(nèi)的菌落數(shù)，換算成單個(gè)方格內(nèi)的菌落數(shù)后乘以20即為測(cè)試片上估算的菌落數(shù)(圓形生長(zhǎng)面積為20cm2)。7)最終菌落濃度的單位以“cfu/g(mL)”表示。結(jié)果報(bào)告1)選取菌落數(shù)在15~150之間的測(cè)試片作為計(jì)數(shù)標(biāo)33沙門氏菌檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)34沙門氏菌腸道傳染病人類沙門氏菌病分為兩大類:1、傷寒與副傷寒:在世界范圍內(nèi)顯著下降,我國(guó)仍有散在發(fā)生,時(shí)有局部暴發(fā)流行.2、

沙門氏菌急性胃腸炎:在世界,在我國(guó)呈上升趨勢(shì),通過(guò)動(dòng)物廣泛分布,家禽和豬是主要的儲(chǔ)存宿主,在食品和許多動(dòng)物制品中發(fā)現(xiàn),是傳播的主要原因.

沙門氏菌腸道傳染病人類沙門氏菌病分為兩大類:35沙門氏菌食物中毒引起食物中毒最常見(jiàn)的沙門氏菌：鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌易引起沙門氏菌中毒的食品：肉、蛋、乳類食品中毒原因：1、食用病畜禽的肉制品食品2、病畜禽、帶菌人和動(dòng)物使食品受污染3、用不潔凈水外理食品沙門氏菌食物中毒引起食物中毒最常見(jiàn)的沙門氏菌：鼠傷寒沙門36沙門氏菌檢驗(yàn)流程前增菌：用無(wú)選擇性的培養(yǎng)基使處于瀕死狀態(tài)的細(xì)菌恢復(fù)活力;BPW選擇性增菌：使沙門氏菌優(yōu)勢(shì)繁殖，其它細(xì)菌受到抑制;SC+TTB選擇性平板分離培養(yǎng)：BS+XLD/HE/顯色培基生化試驗(yàn)：鑒定分離出來(lái)的細(xì)菌是否符合沙門氏菌的生化譜，可采用API20E等成套生化試劑血清學(xué)鑒定：特異性診斷血清鑒定到種。沙門氏菌檢驗(yàn)流程前增菌：用無(wú)選擇性的培養(yǎng)基使處于瀕死狀態(tài)的細(xì)37沙門氏菌的分類學(xué)地位歸于腸桿菌科沙門氏菌屬下設(shè)6個(gè)亞屬：I、II、IV、V、VI及III（原亞利桑那菌屬）常見(jiàn)的種：雞沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌形態(tài)與染色：革蘭氏染色陰性，無(wú)莢膜，無(wú)芽胞，多數(shù)有鞭毛，有動(dòng)力，短小桿菌。培養(yǎng)特性：需氧或兼性厭氧，最適溫度37℃，7.2-7.4營(yíng)養(yǎng)要求：不高，普通培養(yǎng)基生長(zhǎng)良好。沙門氏菌的分類學(xué)地位歸于腸桿菌科沙門氏菌屬38沙門氏菌檢驗(yàn)方法的步驟沙門氏菌檢驗(yàn)方法的步驟是：增菌培養(yǎng)接種鑒別培養(yǎng)基，分離菌落生化試驗(yàn)，鑒定到屬和種；也可以用噬菌體試驗(yàn)鑒定到屬血清學(xué)分型沙門氏菌檢驗(yàn)方法的步驟沙門氏菌檢驗(yàn)方法的步驟是：39增菌培養(yǎng)首先是增菌培養(yǎng)基的靈敏度。關(guān)于食品中是否帶有沙門氏菌，各個(gè)國(guó)家的標(biāo)準(zhǔn)基本上是一樣的，即：25克無(wú)。過(guò)去的理解是25克食品中不能檢出沙門氏菌，但是沒(méi)有提出要測(cè)定增菌液的靈敏度。自從PCR試驗(yàn)技術(shù)推廣應(yīng)用以后，認(rèn)為此項(xiàng)技術(shù)能夠在·含有5~10個(gè)細(xì)菌的標(biāo)本內(nèi)獲得陽(yáng)性結(jié)果。才使我們理解到25克無(wú)是應(yīng)該在25克食品中不能帶有1個(gè)沙門氏菌。增菌培養(yǎng)首先是增菌培養(yǎng)基的靈敏度。40增菌培養(yǎng)國(guó)際上常用的沙門氏菌增菌培養(yǎng)基有3種，即：(1)亞硒酸鹽增菌液或亞硒酸鹽胱氨酸增菌液，(2)四硫磺酸鹽增菌液或四硫磺酸鹽孔雀綠增菌液，(3)氯化鎂孔雀綠增菌液?，F(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用了(1)亞硒酸鹽胱氨酸增菌液，和(2)四硫磺酸鹽孔雀綠增菌液。增菌培養(yǎng)國(guó)際上常用的沙門氏菌增菌培養(yǎng)基有3種，即：(1)亞硒41沙門氏菌屬和有關(guān)細(xì)菌的鑒別1沙門氏菌是賴氨酸陽(yáng)性、氰化鉀和pH7.2尿素酶陰性的；而弗勞地氏檸檬酸桿菌群則是賴氨酸陰性、氰化鉀和pH7.2尿素酶陽(yáng)性的。不過(guò)，甲型副傷寒血清型是賴氨酸陰性的，沙門氏菌IV和V是氰化鉀陽(yáng)性的。在弗勞地氏檸檬酸桿菌群里，氰化鉀和尿素酶也不是100%陽(yáng)性，而且也偶爾出現(xiàn)賴氨酸陽(yáng)性的菌株。沙門氏菌屬和有關(guān)細(xì)菌的鑒別1沙門氏菌是賴氨酸陽(yáng)性、氰化鉀和p42沙門氏菌屬和有關(guān)細(xì)菌的鑒別2不過(guò)，沙門氏菌和大腸埃希氏菌的鑒別有一點(diǎn)例外，因?yàn)樵谏抽T氏菌屬內(nèi)有硫化氫陰性的菌株，偶爾也有靛基質(zhì)陽(yáng)性的菌株；在大腸埃希氏菌種內(nèi)，也有少數(shù)靛基質(zhì)陰性的菌株，偶爾也有硫化氫陽(yáng)性的菌株。沙門氏菌屬和有關(guān)細(xì)菌的鑒別2不過(guò)，沙門氏菌和大腸埃希氏菌的鑒43生化鑒別試驗(yàn)根據(jù)以上所述，可將以上五項(xiàng)生化試驗(yàn)編制成一份腸桿菌科常見(jiàn)屬、種生化試驗(yàn)簡(jiǎn)化診斷表。主要用于沙門氏菌的鑒定，根據(jù)情況再補(bǔ)充幾項(xiàng)試驗(yàn)，可以準(zhǔn)確地鑒定腸桿菌科中最常見(jiàn)的12個(gè)屬。生化鑒別試驗(yàn)根據(jù)以上所述，可將以上五項(xiàng)生化試驗(yàn)編制成一份腸桿44腸桿菌科常見(jiàn)細(xì)菌簡(jiǎn)化診斷表序號(hào)硫化氫靛基質(zhì)賴氨酸氰化鉀尿素酶判定結(jié)果(pH7.2)A1+

-+--沙門氏菌屬A2+

+

--

+沙門氏菌屬，緩慢愛(ài)德華氏菌A3+

-+

+97

-94弗氏檸檬酸菌群，奇異變形菌A4

+

+

+

+

-普通變形菌B1----+/-大腸埃希氏菌，沙門氏菌屬，志賀氏菌屬B2-

+

--

+/-大腸埃希氏菌，志賀氏菌屬B3--+/-+

-/+克雷伯氏菌族(注)B4-+

+/-

+

-普羅菲登斯菌屬，摩根氏菌屬注：包括克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬、哈夫尼亞菌屬、沙雷氏菌屬，另做補(bǔ)充試驗(yàn)鑒定。腸桿菌科常見(jiàn)細(xì)菌簡(jiǎn)化診斷表序號(hào)硫化氫靛基質(zhì)賴氨酸45附表使用說(shuō)明A1尿素氰化鉀賴氨酸判斷結(jié)果---甲副-++沙門氏菌Ⅳ和Ⅴ+-+沙門氏菌個(gè)別變體A2甘露醇山梨醇判斷結(jié)果++沙門氏菌靛+--緩慢愛(ài)德華氏菌B1ONPG-沙門氏菌屬ONPG+大腸埃希氏菌屬附表使用說(shuō)明A1尿素氰化鉀賴氨酸46腸桿菌科細(xì)菌生化特性近一百年以來(lái)，有許多學(xué)者，為積累腸桿菌科細(xì)菌的生化特性資料，付出了辛勤的勞動(dòng)。特別是美國(guó)學(xué)者法默（Farmer,III）于1986年提出了包括腸桿菌科細(xì)菌近100個(gè)種的47項(xiàng)生化特性?！恫苁舷到y(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)第二版》于2005年出版，法默應(yīng)邀作為該書中《腸桿菌科》的作者。腸桿菌科細(xì)菌生化特性近一百年以來(lái)，有許多學(xué)者，為積累腸桿菌科47微生物分析儀微生物分析儀是細(xì)菌分類鑒定的工具。該儀器對(duì)細(xì)菌作出的分類鑒定應(yīng)該是按照權(quán)威的細(xì)菌生化特性表作出的。按理，商家應(yīng)當(dāng)向雇主提供《細(xì)菌鑒定編碼表》，該表的內(nèi)容應(yīng)當(dāng)與細(xì)菌的生化特性表一致。使用者應(yīng)該對(duì)該表進(jìn)行審查，認(rèn)為編碼表的數(shù)據(jù)可信。不過(guò)，由于生產(chǎn)工藝和試驗(yàn)條件的限制，有幾項(xiàng)重要的生化試驗(yàn)項(xiàng)目未能列入微生物分析儀中。其中對(duì)腸桿菌科細(xì)菌鑒定重要的試驗(yàn)有：氰化鉀、pH7.2尿素酶和靛基質(zhì)試驗(yàn)。微生物分析儀微生物分析儀是細(xì)菌分類鑒定的工具。該儀器對(duì)細(xì)菌作48補(bǔ)充生化試驗(yàn)試驗(yàn)者對(duì)于所獲得的生化試驗(yàn)結(jié)果有懷疑時(shí)，可用手工方法進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)，直至認(rèn)為試驗(yàn)結(jié)果可信為止。補(bǔ)充生化試驗(yàn)試驗(yàn)者對(duì)于所獲得的生化試驗(yàn)結(jié)果有懷疑時(shí)，可用手工49血清學(xué)分型沙門氏菌具有O抗原、K抗原和H抗原。沙門氏菌的血清學(xué)分型就是按照這些抗原的成分進(jìn)行分型。一般先按照O抗原分群，然后。再按照H抗原分型。如果這個(gè)血清型具有K抗原，一般在O抗原分群以后再檢查。血清學(xué)分型沙門氏菌具有O抗原、K抗原和H抗原。沙門氏菌的50血清學(xué)分型的注意事項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)菌株和實(shí)驗(yàn)室保存的菌株做血清型鑒定的時(shí)候，往往比較順利，新分離的菌株做血清分型往往不順利。一是因?yàn)橐蜃友宓男r(jià)不高，難以覆蓋所試驗(yàn)的菌株。應(yīng)當(dāng)不要用灼熱的接種環(huán)去挑取血清。二是因?yàn)榫甑目乖园l(fā)育不良，特別是H抗原?？梢越臃N在半固體瓊脂上，促使H抗原的發(fā)育。沙門氏菌抗原的研究已有近一百年的歷史，實(shí)驗(yàn)者應(yīng)當(dāng)熟悉抗原的相關(guān)理論。血清學(xué)分型的注意事項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)菌株和實(shí)驗(yàn)室保存的菌株做血清型鑒定的51驗(yàn)證菌株鑒定的結(jié)果沙門氏菌的鑒定結(jié)果應(yīng)當(dāng)具有完整的血清學(xué)分型結(jié)果。如果只鑒定到O群，沒(méi)有得出抗原的分型結(jié)果，往往不是沙門氏菌。只H有在屬和種的鑒定結(jié)果是完全可靠的情況下，才能做出沙門氏菌未定型的鑒定結(jié)論。驗(yàn)證菌株鑒定的結(jié)果沙門氏菌的鑒定結(jié)果應(yīng)當(dāng)具有完整的血清學(xué)分型52大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn)大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn)53一、常規(guī)方法檢樣↓25g(mL)+改良EC肉湯(mEC+n）225ml快速篩選陰性36±1℃18～24h陽(yáng)性報(bào)告CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157顯色瓊脂平板36±1℃↓18～24h挑取可疑菌落5～10個(gè),氧化酶陰性,革蘭氏陰性桿菌接種TSI↓MUG-LST36±1℃18～24h

陽(yáng)性陰性↓↓非O157菌血清學(xué)試驗(yàn)↓生化試驗(yàn)

↓報(bào)告一、常規(guī)方法檢樣54操作步驟1增菌以無(wú)菌操作取檢樣25g(mL)加入到含有225mLmEC+n肉湯的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1～2min。于36±1℃培養(yǎng)18～24h。同時(shí)做陽(yáng)性及陰性對(duì)照。操作步驟1增菌552.分離取增菌后或篩選試驗(yàn)陽(yáng)性的mEC+n肉湯，分別劃線或適當(dāng)稀釋后取0.1mL涂布接種于CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157顯色瓊脂平板上，于36±1℃培養(yǎng)18～24h，觀察菌落。必要時(shí)將混合菌落分純。在CT-SMAC平板上，發(fā)酵山梨醇的菌落為紅色；典型菌落為不發(fā)酵山梨醇的圓形、光滑、較小的無(wú)色菌落，中心呈現(xiàn)較暗的灰褐色，用接種針挑起時(shí)無(wú)拉絲現(xiàn)象。在改良CHROMagarO157顯色瓊脂平板上為圓形、較小的菌落，中心呈淡紫色-紫紅色，邊緣無(wú)色或淺灰色。2.分離取增菌后或篩選試驗(yàn)陽(yáng)性的mEC+n肉湯，分別劃線56增菌后的肉湯在取樣前，應(yīng)輕微搖晃混勻。劃線時(shí)應(yīng)多次往返，保證分離效果。涂布時(shí)應(yīng)適當(dāng)稀釋。注意區(qū)分典型菌落，必要時(shí)分純。大部分非O157E.coli發(fā)酵山梨醇，仍有6%不發(fā)酵山梨醇，它們與摩根氏菌和哈夫尼亞菌一樣在TC-SMAC上表現(xiàn)為與O157相同的菌落特征。增菌后的肉湯在取樣前，應(yīng)輕微搖晃混勻。573.初步生化試驗(yàn)在CT-SMAC和改良CHROMagarO157顯色瓊脂平板上挑取5～10個(gè)典型或可疑菌落，分別接種TSI瓊脂，同時(shí)接種MUG-LST肉湯，于36±1℃培養(yǎng)18～24h。必要時(shí)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。在TSI瓊脂中，典型菌株為斜面與底層均呈陽(yáng)性反應(yīng)呈黃色，產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣，不產(chǎn)生H2S。置LST-MUG肉湯管于長(zhǎng)波紫外燈下觀察，陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)無(wú)熒光產(chǎn)生，陰性對(duì)照應(yīng)有熒光；對(duì)分解乳糖且無(wú)熒光的菌株，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分純，于36±1℃培養(yǎng)18～24h，并進(jìn)行下列鑒定。3.初步生化試驗(yàn)在CT-SMAC和改良CHROMagar584.鑒定4.1血清學(xué)試驗(yàn)在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取分純的菌落，用O157:H7標(biāo)準(zhǔn)血清或O157乳膠凝集試劑作玻片凝集試驗(yàn)。血清凝集試驗(yàn)應(yīng)做生理鹽水對(duì)照。對(duì)于H7因子血清不凝集者，應(yīng)穿刺接種半固體瓊脂管，檢查動(dòng)力，經(jīng)連續(xù)傳代3次，動(dòng)力試驗(yàn)陰性，H7因子血清凝集陰性者，確定為無(wú)動(dòng)力株。CCP:先做O157血清凝集，后做H7因子凝集，注意自凝菌，用生理鹽水做對(duì)照。4.鑒定4.1血清學(xué)試驗(yàn)594.2生化試驗(yàn)用API20E或VITEK-GNI+或其它腸桿菌科生化鑒定試劑盒，按照生產(chǎn)商提供的使用說(shuō)明進(jìn)行。進(jìn)行生化試驗(yàn)時(shí)應(yīng)是用新鮮培養(yǎng)物（24h）。菌液的稀釋應(yīng)注意無(wú)菌操作，濁度應(yīng)達(dá)到使用說(shuō)明的要求。4.2生化試驗(yàn)60二、免疫磁珠捕獲法操作步驟1.增菌：同常規(guī)法。2.磁珠分離：2.1將Eppendorff管按樣品和質(zhì)控菌株進(jìn)行編號(hào)，每個(gè)樣品使用1只Eppendorff管，然后插入到磁板架上。在漩渦混合器上輕輕振蕩E.coliO157免疫磁珠溶液后，用開(kāi)蓋器打開(kāi)每個(gè)Eppendorff管的蓋子，每管加入20μLE.coliO157免疫磁珠懸液。二、免疫磁珠捕獲法操作步驟61磁珠在加入前在混旋器上短暫混勻，不可劇烈震蕩，避免產(chǎn)生泡沫。

2.2取mEC+n肉湯增菌培養(yǎng)物1mL，加入到Eppendorff管中，蓋上蓋子，然后輕微振蕩10s。每個(gè)樣品更換1只加樣吸頭，質(zhì)控菌株必須與樣品分開(kāi)進(jìn)行，避免交叉污染取樣前混勻，避開(kāi)脂肪層與雜質(zhì)，必要時(shí)使用濾網(wǎng)。加樣后立即混勻。對(duì)照同時(shí)做。磁珠在加入前在混旋器上短暫混勻，不可劇烈震蕩，避免產(chǎn)生泡沫。622.3結(jié)合：在18～30℃環(huán)境中，將上述Eppendorff管連同磁板架放在適合的裝置上轉(zhuǎn)動(dòng)或用手輕微轉(zhuǎn)動(dòng)10min，使E.coliO157與免疫磁珠充分接觸。注意室內(nèi)溫度，保證結(jié)合時(shí)間。結(jié)合時(shí)不要將磁鐵插入到磁板架中。用手轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)應(yīng)輕輕顛倒Eppendorff管架，不可劇烈搖動(dòng)。保證磁珠與O157的結(jié)合。2.3結(jié)合：在18～30℃環(huán)境中，將上述Eppendor632.4捕獲：將磁板插入到磁板架中濃縮磁珠。在3min內(nèi)不斷地傾斜磁板架，確保懸液中和蓋子上的免疫磁珠全部被收集起來(lái)，此時(shí)，在Eppendorff管壁中間明顯可見(jiàn)的圓形或橢圓形棕色聚物。2.5吸取上清液：取1支滅菌的加長(zhǎng)吸管，從免疫磁珠聚集物對(duì)側(cè)深入液面，輕輕吸走上清液。當(dāng)吸到液面通過(guò)免疫磁珠積聚物時(shí)，應(yīng)放慢速度，以確保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液內(nèi)含有磁珠，則應(yīng)將其放回到Eppendorff管中，并重復(fù)2.4步驟。每個(gè)樣品換用1支加長(zhǎng)吸管。2.4捕獲：將磁板插入到磁板架中濃縮磁珠。在3min內(nèi)不斷64免疫磁珠的滑落：某些樣品特別是那些富含脂肪的樣品，其磁珠積聚物易于滑落到管底。在吸取上清液時(shí)，很難做到不丟失磁珠，在這種情況下，可保留50～100μL上清液于Eppendorff管中。如果在后續(xù)的洗滌過(guò)程中也這樣做的話，脂肪的影響將減小，也可達(dá)到充分捕獲的目的。2.6洗滌：從磁板架上移走磁板，在每個(gè)Eppendorff中加入1mLPBS-Tween20洗液，轉(zhuǎn)動(dòng)磁板架3次以上，洗滌免疫磁珠混合物。重復(fù)上述步驟2.4～2.6。免疫磁珠的滑落：某些樣品特別是那些富含脂肪的樣品，其磁珠積聚652.7重復(fù)上述步驟2.4～2.5洗滌共3次，動(dòng)作要輕柔。吸取上清液至磁珠聚集物處時(shí)，應(yīng)放慢速度。上清液的吸取應(yīng)盡量完全。使用多塊磁珠分離裝置時(shí)，磁鐵與磁鐵應(yīng)遠(yuǎn)離放置。2.8免疫磁珠懸浮：移走磁板，將免疫磁珠重新懸浮在100μLPBS-Tween20洗液中。2.7重復(fù)上述步驟2.4～2.5662.9涂布平板用漩渦混合器將免疫磁珠混勻，用加樣器各取50μL免疫磁珠懸液分別轉(zhuǎn)移至CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157顯色瓊脂平板一側(cè)，然后用涂布棒將免疫磁珠涂布平板的一半，再用接種環(huán)劃線接種平板的另一半。待瓊脂表面水分完全吸收后，翻轉(zhuǎn)平板，于36±1℃培養(yǎng)18～24h。注意，若CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157顯色瓊脂平板表面水分過(guò)多時(shí)，應(yīng)在37℃下干燥10～20min，涂布時(shí)避免將免疫磁珠涂布到平板的邊緣。2.9涂布平板672.10菌落識(shí)別、初步生化試驗(yàn)、鑒定同常規(guī)法。2.10菌落識(shí)別、初步生化試驗(yàn)、鑒定同常規(guī)法。68不同培養(yǎng)基分離效果CT-SMAC：菌落較大，存在較多的山梨醇發(fā)酵陰性的細(xì)菌菌落生長(zhǎng)，干擾O157的檢出。CHROMagarO157：較多的非O157菌落生長(zhǎng)，菌落較大，影響O157菌的檢出改良CHROMagarO157：非O157細(xì)菌生長(zhǎng)較少且菌落相對(duì)局限，O157菌落特征性明顯。不同培養(yǎng)基分離效果CT-SMAC：菌落較大，存在較多的山梨醇69副溶血弧菌檢驗(yàn)副溶血弧菌檢驗(yàn)70概況副溶血性弧菌于1950年從日本一次暴發(fā)性食物中毒中分離發(fā)現(xiàn)。該菌存在于近海的海水、海底沉積物和魚(yú)類、貝殼等海產(chǎn)品中。在37℃、pH7.7、含氯化鈉3～4%的環(huán)境中生長(zhǎng)最好。主要引起食物中毒，尤以日本、東南亞、美國(guó)及我國(guó)臺(tái)北地區(qū)多見(jiàn)，也是我國(guó)大陸沿海地區(qū)食物中毒中最常見(jiàn)的一種病原菌。概況副溶血性弧菌于1950年從71本菌嗜鹽畏酸，在無(wú)鹽培養(yǎng)基上，不能生長(zhǎng)，3%～6%食鹽水繁殖迅速，每8～9分鐘為1周期，低于0.5%或高于8%鹽水中停止生長(zhǎng)。對(duì)酸敏感，在2%醋酸中或50%的食醋中1分鐘即可死亡。不耐熱，56℃、5分鐘即可殺死，90℃、1分鐘滅活。對(duì)低溫及高濃度氯代鈉抵抗力甚強(qiáng)。本菌嗜鹽畏酸，在無(wú)鹽培養(yǎng)基上，不能生長(zhǎng)，72主要修改將選擇性增菌液由氯化鈉結(jié)晶紫增菌液改為3％氯化鈉堿性蛋白胨水；將選擇性分離培養(yǎng)基由氯化鈉蔗糖瓊脂和嗜鹽菌選擇性瓊脂改為硫代硫酸鹽－檸檬酸鹽－膽鹽－蔗糖瓊脂和科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基；增加API20E診斷試劑條及全自動(dòng)細(xì)菌生化鑒定儀VITEK；增加血清學(xué)分型；將動(dòng)物試驗(yàn)改為神奈川試驗(yàn)；增加最可能數(shù)檢索表。主要修改將選擇性增菌液由氯化鈉結(jié)晶紫增菌液改為373樣品制備冷凍樣品應(yīng)在45℃以下不超過(guò)15min或在2℃～5℃不超過(guò)18h解凍，若不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)放于－15℃左右保存；非冷凍而易腐的樣品應(yīng)盡可能及時(shí)檢驗(yàn)，若不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)置2℃～5℃冰箱保存，在24h內(nèi)檢驗(yàn)。樣品制備冷凍樣品應(yīng)在45℃以下不超過(guò)1574魚(yú)類和頭足類動(dòng)物取表面組織、腸或鰓。貝類取全部?jī)?nèi)容物，包括貝肉和體液；甲殼類取整個(gè)動(dòng)物，或者動(dòng)物的中心部分，包括腸和鰓。如為帶殼貝類或甲殼類，則應(yīng)先在符合生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的流水中洗刷外殼并甩干表面水分，然后以無(wú)菌操作打開(kāi)外殼，按上述要求取相應(yīng)部分。魚(yú)類和頭足類動(dòng)物取表面組織、腸或鰓。75以無(wú)菌操作取檢樣25g（mL），加入3％氯化鈉堿性蛋白胨水225mL，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以8000r/min均質(zhì)1min，或拍擊式均質(zhì)器拍擊2min，制備成1:10的均勻稀釋液。如無(wú)均質(zhì)器，則將樣品放入無(wú)菌乳缽中磨碎，然后放在500mL的滅菌容器內(nèi)，加225mL3％氯化鈉堿性蛋白胨水，并充分振蕩。以無(wú)菌操作取檢樣25g（mL），加入3％氯化鈉堿性蛋白胨水76增菌定性檢測(cè)將上述1:10稀釋液于36℃±1℃培養(yǎng)8h～18h。增菌定性檢測(cè)77定量檢測(cè)用滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL，注入含有9mL3％氯化鈉堿性蛋白胨水的試管內(nèi)，振搖試管混勻，制備1:100的稀釋液。另取1mL滅菌吸管，按上條操作依次制備10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管。根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇三個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3支含有9mL3％氯化鈉堿性蛋白胨水的試管，每管接種1mL。置36℃±1℃恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)8h～18h。定量檢測(cè)78分離在所有顯示生長(zhǎng)的試管或增菌液中用接種環(huán)沾取一環(huán)，于TCBS平板或科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基平板上劃線分離。一支試管劃線一塊平板。于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。分離在所有顯示生長(zhǎng)的試管或增菌液中用接種環(huán)沾取一環(huán)，于TCB79典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈現(xiàn)為圓的、半透明的、表面光滑的綠色菌落，用接種環(huán)輕觸，有類似口香糖的質(zhì)感，直徑2mm～3mm。從培養(yǎng)箱取TCBS平板后，應(yīng)盡快（不超過(guò)1h）挑取菌落或標(biāo)記要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)為圓的、半透明的、表面光滑的粉紫色菌落，直徑2mm～3mm。典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈現(xiàn)為圓的、半透明的、表面光滑80TCBS瓊脂上面的副溶血性弧菌TCBS瓊脂上面的副溶血性弧菌81TCBS瓊脂上面的副溶血性弧菌TCBS瓊脂上面的副溶血性弧菌82可以直接計(jì)數(shù)的副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基可以直83純培養(yǎng)挑取3個(gè)或以上的可疑菌落，劃線3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。純培養(yǎng)84初步鑒定氧化酶試驗(yàn)：挑選純培養(yǎng)的單個(gè)菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，副溶血性弧菌為氧化酶陽(yáng)性。涂片鏡檢：將可疑菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察形態(tài)。副溶血性弧菌為革蘭氏陰性，呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，無(wú)芽胞，有鞭毛。初步鑒定氧化酶試驗(yàn)：挑選純培養(yǎng)的單個(gè)菌落進(jìn)85挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，轉(zhuǎn)種3％氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層，36℃±1℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。副溶血性弧菌在3％氯化鈉三糖鐵瓊脂中的反應(yīng)為底層變黃不變黑，無(wú)氣泡，斜面顏色不變或紅色加深，有動(dòng)力。挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，轉(zhuǎn)種3％氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺86嗜鹽性試驗(yàn)：挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，分別接種于不同氯化鈉濃度的胰胨水，36℃±1℃培養(yǎng)24h，觀察液體混濁情況。副溶血性弧菌在無(wú)氯化鈉和10％氯化鈉的胰胨水中不生長(zhǎng)或微弱生長(zhǎng)，在7％氯化鈉的胰胨水中生長(zhǎng)旺盛。嗜鹽性試驗(yàn)：挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，分別接種于不同氯化鈉濃87確定鑒定生化試驗(yàn)：分別接種含3％氯化鈉的甘露醇、賴氨酸、MR-VP培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h后觀察結(jié)果。隔夜培養(yǎng)物進(jìn)行ONPG試驗(yàn)。API20E生化鑒定試劑盒或VITEK：刮取3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上的單個(gè)菌落，用生理鹽水制備成濁度適當(dāng)?shù)募?xì)胞懸浮液，使用API20E生化鑒定試劑盒或VITEK鑒定。確定鑒定生化試驗(yàn)：分別接種含3％氯化鈉的甘露醇、賴氨酸、MR88生化特性1、分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖、、蔗糖。2、H２S（－）、V-P（－）、動(dòng)力（＋）3、甘露醇（＋）、賴氨酸（＋）、ONPG（－）生化特性1、分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖、89報(bào)告當(dāng)檢出的可疑菌落生化學(xué)性狀符合表1要求時(shí)，可以報(bào)告檢出副溶血性弧菌。如果進(jìn)行定量檢測(cè)，根據(jù)證實(shí)為副溶血性弧菌陽(yáng)性的試管管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每g（mL）副溶血性弧菌的MPN值。報(bào)告當(dāng)檢出的可疑菌落生化學(xué)性狀符合表1要90空腸彎曲菌檢驗(yàn)空腸彎曲菌檢驗(yàn)91空腸彎曲菌分類地位螺菌科彎曲菌屬空腸彎曲菌芬奈爾彎曲菌豬彎曲菌結(jié)腸彎曲菌同性戀?gòu)澢虝簭澢簭澢ｚt彎曲菌胎兒亞種口腔亞種等等13個(gè)種空腸彎曲菌分類地位螺菌科空腸芬奈爾豬結(jié)腸同性戀短暫胎兒海鷗胎92形態(tài)與染色革蘭陰性彎曲小桿菌，多種形態(tài)，有螺旋形、彎曲桿狀、S形、逗點(diǎn)狀、飛翔的海鷗形，陳舊培養(yǎng)物中可變成球形。無(wú)芽孢、無(wú)莢膜，有鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑，似飛箭樣、穿梭樣翻滾運(yùn)動(dòng)。

形態(tài)與染色革蘭陰性彎曲小桿菌，多種形態(tài)，有螺旋形、彎曲桿狀、93培養(yǎng)特性微需氧：5％氧氣、10％二氧化碳、85％氮?dú)?；最適生長(zhǎng)溫度：42～43℃；營(yíng)養(yǎng)要求高，含血液和血清的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，液體培養(yǎng)基混濁生長(zhǎng)。培養(yǎng)特性微需氧：5％氧氣、10％二氧化碳、85％氮?dú)猓?4生化特性不酵解不氧化碳水化合物；氧化酶、觸酶陽(yáng)性；

生化特性不酵解不氧化碳水化合物；95抗原結(jié)構(gòu)和血清分型菌體抗原（O）抗原：可分成45個(gè)以上血清型，第11、12和18血清型最為常見(jiàn)；鞭毛抗原（H)抗原；包膜抗原（K）抗原。

抗原結(jié)構(gòu)和血清分型菌體抗原（O）抗原：可分成45個(gè)以上血清型96抵抗力不強(qiáng)，直射陽(yáng)光、干燥可殺滅；60℃5min滅活；紫外線照射5min可滅活；一般消毒劑均可殺滅。抵抗力不強(qiáng)，直射陽(yáng)光、干燥可殺滅；97實(shí)驗(yàn)室需具備的條件冰箱恒溫培養(yǎng)箱：25℃、36℃、42℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱微需氧培養(yǎng)裝置顯微鏡：有相差功能高速離心機(jī)均質(zhì)器電子天平實(shí)驗(yàn)室需具備的條件冰箱98空腸彎曲菌檢驗(yàn)程序24h～48h圖1空腸彎曲菌檢驗(yàn)程序樣品處理預(yù)增菌接種Skirrow與mCCDA瓊脂平板增菌鏡檢動(dòng)力試驗(yàn)微需氧25℃±1℃生長(zhǎng)試驗(yàn)有氧42℃±1℃生長(zhǎng)試驗(yàn)氧化酶試驗(yàn)彎曲菌屬過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)萘啶酮酸敏感試驗(yàn)馬尿酸鈉水解試驗(yàn)吲哚乙酸脂水解試驗(yàn)空腸彎曲菌報(bào)告挑取可疑菌落，接種哥倫比亞瓊脂平板頭孢菌素敏感試驗(yàn)36℃±1℃4h42℃±1℃42℃±1℃24h～48h42℃±1℃24h～48h空腸彎曲菌檢驗(yàn)程序24h～48h圖1空腸彎曲菌檢驗(yàn)程序99樣品處理25g+100mlBolton，均質(zhì)1～2min，取濾液進(jìn)行培養(yǎng)；樣品處理25g+100mlBolton，均質(zhì)1～2min，100空腸彎曲菌對(duì)下列因素非常敏感在空氣中的暴露；干燥；低pH；加熱；冷凍；鹽；長(zhǎng)期的貯存。空腸彎曲菌對(duì)下列因素非常敏感在空氣中的暴露；101預(yù)增菌、增菌和分離程序平板上雜菌較多微需氧42℃±1℃、24～48h平板上雜菌較少繼續(xù)培養(yǎng)100r/min微需氧振蕩，42℃±1℃、24h100r/min微需氧振蕩，36℃±1℃、4h接種mCCDA和Skirrow平板或CFA顯色平板100r/min振蕩微需氧，42℃±1℃、24h微需氧42℃±1℃培養(yǎng)24h，觀察菌落生長(zhǎng)情況48h增菌液與1:50稀釋液劃線接種mCCDA和Skirrow平板或CFA顯色平板48h增菌液劃線接種mCCDA和Skirrow平板或CFA顯色平板轉(zhuǎn)種挑取mCCDA和Skirrow平板或CFA顯色平板上的可疑菌落哥倫比亞血平板或Skirrow無(wú)抗生素血平板樣品處理預(yù)增菌、增菌和分離程序平板上雜菌較多微需氧42℃±1℃、102培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度42±1℃；時(shí)間24,48h;如果振蕩培養(yǎng)24小時(shí)即可；如果靜置培養(yǎng)需48小時(shí)；振蕩幅度100rpm;微需氧條件：5%O210%CO285N2培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度42±1℃；103彎曲菌在Bolton肉湯中培養(yǎng)均勻混濁，微紅，不臭。彎曲菌在Bolton肉湯中培養(yǎng)均勻混濁，微紅，不臭。104預(yù)增菌起始培養(yǎng)溫度要低一些對(duì)于一些細(xì)菌細(xì)胞受到損傷的冷凍長(zhǎng)期貯存(≥10天)36±1℃4～5h預(yù)增菌起始培養(yǎng)溫度要低一些105分離mCCDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分；中和代謝產(chǎn)物，維持生長(zhǎng)環(huán)境的成分；木炭抗生素頭孢哌酮鈉32mg3代頭孢，廣泛抗菌兩性霉素B10mg抑制霉菌、酵母菌利福平10mg廣譜抗菌藥主要用于抗結(jié)核分離mCCDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基106分離Skirrow基礎(chǔ)培養(yǎng)基FBP溶液丙酮酸鈉焦亞硫酸鈉硫酸鈉鐵抗生素溶液頭孢哌酮兩性霉素Ｂ利福平無(wú)菌脫纖維綿羊血分離Skirrow基礎(chǔ)培養(yǎng)基107分離培養(yǎng)基CFA瓊脂為法國(guó)梅里埃產(chǎn)品僅有成品平板出售購(gòu)買周期太長(zhǎng)（下訂單現(xiàn)做，然后發(fā)貨，一般要2個(gè)月）保質(zhì)期短，一般收到平板就快過(guò)期了。分離培養(yǎng)基CFA瓊脂為法國(guó)梅里埃產(chǎn)品108鑒定革蘭氏染色形態(tài)觀察直接相差鏡檢有氧42℃±1℃生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)氧化酶試驗(yàn)結(jié)果相符合者，確定為彎曲菌屬過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)萘啶酮酸敏感試驗(yàn)頭孢菌素敏感試驗(yàn)馬尿酸鹽水解試驗(yàn)結(jié)果相符者為空腸彎曲菌報(bào)告可疑菌落微需氧25℃±1℃生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)吲哚乙酸脂水解試驗(yàn)鑒定革蘭氏染色形態(tài)觀察有氧42℃±1℃氧化酶109彎曲菌屬的鑒定項(xiàng)目彎曲菌屬特征形態(tài)觀察陰性彎曲小桿菌，多種形態(tài)，有螺旋形、彎曲桿狀、S形、逗點(diǎn)狀、飛翔的海鷗形a。動(dòng)力觀察螺旋狀運(yùn)動(dòng)b氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性微需氧25℃生長(zhǎng)試驗(yàn)不生長(zhǎng)有氧42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)不生長(zhǎng)a有些菌株形態(tài)不典型；b有些菌株運(yùn)動(dòng)不明顯彎曲菌屬的鑒定項(xiàng)目彎曲菌屬特征形態(tài)觀察陰性彎曲小桿菌，多種形110空腸彎曲菌的鑒定特征空腸彎曲菌結(jié)腸彎曲菌紅嘴鷗彎曲菌烏普薩拉彎曲菌過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)＋＋＋－或微弱馬尿酸鈉水解試驗(yàn)＋－－－吲哚乙酸酯水解試驗(yàn)＋＋－+頭孢菌素敏感試驗(yàn)RRRS萘啶酮酸敏感試驗(yàn)SaSaR/SbS注：＋陽(yáng)性；－陰性；R抗性；S敏感a空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌對(duì)萘啶酮酸的耐藥性呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。b海鷗彎曲菌的不同菌株，分別表現(xiàn)為敏感或抗性?？漳c彎曲菌的鑒定特征空腸彎曲菌結(jié)腸彎曲菌紅嘴鷗彎曲菌111空彎菌株的保存分離已經(jīng)鑒定的菌株應(yīng)在血平板上經(jīng)2次純化，立即保存于20％甘油的布氏肉湯菌種保存管中，置于－80℃保存；冷凍干燥保存?？諒澗甑谋４娣蛛x已經(jīng)鑒定的菌株應(yīng)在血平板上經(jīng)2次純化，立即112結(jié)果報(bào)告檢樣單位中檢出或未檢出空腸彎曲菌。結(jié)果報(bào)告檢樣單位中檢出或未檢出空腸彎曲菌。113阪崎腸桿菌檢驗(yàn)程序阪崎腸桿菌檢驗(yàn)阪崎腸桿菌檢驗(yàn)程序阪崎腸桿菌檢驗(yàn)114阪崎腸桿菌檢驗(yàn)程序報(bào)告生化鑒定挑取黃色菌落DFI瓊脂36℃±1℃，24h±2h挑取藍(lán)綠色菌落1mL+mLST-Vm10mL44℃±0.5℃，24h±2h檢樣100g/mL+稀釋液900mL36℃±1℃，18h±2h前增菌選擇性增菌選擇性分離生化鑒定TSA25℃±1℃，48h±4h阪崎腸桿菌檢驗(yàn)程序阪崎腸桿菌檢驗(yàn)程序報(bào)告生化鑒定挑取黃色菌落DFI瓊脂挑取115前增菌和增菌mLST-Vm，即在大腸菌群增菌肉湯LST中另加入適量的NaCl和Vm。研究證明與其他腸桿菌科細(xì)菌（如沙門菌屬、大腸埃希氏菌等）相比，ES具有較高的耐滲透壓能力。加入0.5M的NaCl在保證ES良好生長(zhǎng)的同時(shí)，可以有效地抑制上述其他細(xì)菌的生長(zhǎng)。Vm可有效地抑制G+菌的生長(zhǎng)。而較高的生長(zhǎng)溫度可以進(jìn)一步抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)。前增菌和增菌mLST-Vm，即在大腸菌群增菌肉湯LST中另加116分離顯色培養(yǎng)基的基本原理相似，二者都是根據(jù)ES能產(chǎn)生α-葡萄糖苷酶，分解底物XaGlc產(chǎn)生有色菌落。分離顯色培養(yǎng)基的基本原理相似，二者都是根據(jù)ES能產(chǎn)生α-葡萄117顯色培養(yǎng)基對(duì)ES的選擇性較好，ES形成的特征性菌落易于辨認(rèn)，以DFI為例：硫化氫指示劑可以區(qū)分ES和產(chǎn)生少量α-葡萄糖苷酶但H2S陽(yáng)性菌株（如普通變形桿菌）。ES都可以在該平板上生長(zhǎng)并產(chǎn)生藍(lán)綠色菌落其他常見(jiàn)菌在DFI平板的菌落顏色白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌、大腸埃希氏菌、泛菌屬的多種菌等黃色菌落：赫氏埃希氏菌黑褐色、粉色或中心藍(lán)綠菌落：少量菌種ESIA:藍(lán)色，1-3mm國(guó)產(chǎn)顯色培養(yǎng)基顯色培養(yǎng)基對(duì)ES的選擇性較好，ES形成的特征性菌落易于辨認(rèn)，11836℃±1℃

24h±2hTSA：25℃培養(yǎng)后典型ES：黃色陰性對(duì)照E.coliATCC25922：白色菌落36℃±1℃24h±2h119鑒定（生化反應(yīng)）生化試驗(yàn)特征黃色素產(chǎn)生＋氧化酶－L-賴氨酸脫羧酶－L-鳥(niǎo)氨酸脫羧酶（＋）L-精氨酸雙水解酶＋檸檬酸水解(＋)發(fā)酵：D-山梨醇（－）L-鼠李糖＋D-蔗糖＋D-蜜二糖＋苦杏仁甙＋注：＋＞99%陽(yáng)性；－＞99%陰性；（＋）90%－99%陽(yáng)性；（－）90%-99%陰性。鑒定（生化反應(yīng)）生化試驗(yàn)特征黃色素產(chǎn)生＋氧化酶－L-賴氨酸脫120商業(yè)生化鑒定系統(tǒng)的應(yīng)用推薦使用的ES生化鑒定方法有很多，主要有API20E，ID32E，BiologGN2MicroPlate，VITEKGNI+等。上述方法都比較成熟，穩(wěn)定性較好，已被許多國(guó)家和組織的標(biāo)準(zhǔn)采用。在腸桿菌的生化鑒定中使用最廣泛的是API20E和VitekGNI+。商業(yè)生化鑒定系統(tǒng)的應(yīng)用推薦使用的ES生化鑒定方法有很多，主要121質(zhì)量控制質(zhì)量控制122參加衛(wèi)生部及有關(guān)部門組織的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力培訓(xùn)、驗(yàn)證、比對(duì)及考核接受衛(wèi)生部及有關(guān)部門對(duì)我省監(jiān)測(cè)工作的督導(dǎo)檢查衛(wèi)生廳制定我省質(zhì)量控制考核辦法，并組織實(shí)施省疾病預(yù)防控制中心負(fù)責(zé)進(jìn)行檢驗(yàn)技術(shù)和數(shù)據(jù)上報(bào)的培訓(xùn)參加衛(wèi)生部及有關(guān)部門組織的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力培訓(xùn)、驗(yàn)證、比對(duì)及考123質(zhì)控考核發(fā)給未知樣品，在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)，在室內(nèi)質(zhì)控的基礎(chǔ)上，考核實(shí)驗(yàn)室真實(shí)的技術(shù)水平和熟練程度，按時(shí)上報(bào)結(jié)果?？偨Y(jié)分析檢測(cè)結(jié)果，以達(dá)到促進(jìn)提高檢驗(yàn)人員的理論和檢驗(yàn)技術(shù)水平，并對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行綜和評(píng)價(jià)的目的。質(zhì)控考核發(fā)給未知樣品，在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)，在室內(nèi)質(zhì)控的基礎(chǔ)上，考124背景為了保證全國(guó)食源性致病菌監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，提高監(jiān)測(cè)工作質(zhì)量，設(shè)計(jì)此次質(zhì)量控制考核。本次質(zhì)控范圍為承擔(dān)2010年全國(guó)食源性致病菌監(jiān)測(cè)工作任務(wù)的全國(guó)31個(gè)省、直轄市、自治區(qū)以及新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)。此次考核由中國(guó)CDC營(yíng)養(yǎng)食品所組織并制訂考核實(shí)施方案，通過(guò)發(fā)放統(tǒng)一制備的質(zhì)控樣品進(jìn)行考核，由中國(guó)CDC營(yíng)養(yǎng)食品所負(fù)責(zé)對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)一評(píng)價(jià)。背景為了保證全國(guó)食源性致病菌監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，提高監(jiān)測(cè)工125質(zhì)控樣品制備1.質(zhì)控樣品是用經(jīng)輻照滅菌的奶粉（需經(jīng)檢驗(yàn)確認(rèn)奶粉中無(wú)本底細(xì)菌）做原料，再混合足量的1-4種細(xì)菌純培養(yǎng)物。2.細(xì)菌純培養(yǎng)物為常見(jiàn)食源性致病菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株，其背景信息清楚，并檢驗(yàn)確認(rèn)。3.質(zhì)控樣品應(yīng)經(jīng)過(guò)穩(wěn)定性測(cè)試，于2℃-5℃放置，分別于1周、2周、1個(gè)月后，隨機(jī)抽取5種質(zhì)控樣品檢驗(yàn)確認(rèn)，經(jīng)驗(yàn)證樣品中所含食源性致病菌種類在放置前后沒(méi)有變化才可作為質(zhì)控樣品。質(zhì)控樣品制備1.質(zhì)控樣品是用經(jīng)輻照滅菌的奶粉（需經(jīng)檢驗(yàn)確認(rèn)1264.15種質(zhì)控樣品應(yīng)盡量覆蓋各個(gè)省，省內(nèi)各個(gè)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的質(zhì)控樣品應(yīng)盡量做到互不相同。每個(gè)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)一個(gè)編號(hào)，編號(hào)由省市代碼加阿拉伯?dāng)?shù)字組成，每個(gè)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)兩支平行質(zhì)控樣品，每支5g，一支用于檢驗(yàn)，一支為備份。5.中國(guó)CDC營(yíng)養(yǎng)食品所應(yīng)于質(zhì)控樣品發(fā)送后一個(gè)月，隨機(jī)抽取5份樣品進(jìn)行檢驗(yàn)以確認(rèn)樣品質(zhì)量。4.15種質(zhì)控樣品應(yīng)盡量覆蓋各個(gè)省，省內(nèi)各個(gè)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的質(zhì)控127質(zhì)控樣品運(yùn)輸1.質(zhì)控樣品應(yīng)密封完整，確保其在運(yùn)輸過(guò)程中不會(huì)受到外來(lái)污染。2.質(zhì)控樣品在運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)保持2℃-8℃，確保溫度不會(huì)超出其范圍。3、菌株運(yùn)送應(yīng)按照國(guó)際民航組織《危險(xiǎn)物品航空安全運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則》規(guī)定的生物材料等級(jí)B即UN3373的要求執(zhí)行。質(zhì)控樣品運(yùn)輸1.質(zhì)控樣品應(yīng)密封完整，確保其在運(yùn)輸過(guò)程中不會(huì)128質(zhì)控樣品檢驗(yàn)1.檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)收到質(zhì)控樣品后應(yīng)檢查包裝的完整性，檢驗(yàn)前應(yīng)放置于2℃-5℃保存。2.檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)在收到質(zhì)控樣品后30天內(nèi)進(jìn)行檢驗(yàn)。3.檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)做好實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制，并參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生檢驗(yàn)微生物學(xué)部分（GB/T4789-2008）相關(guān)章節(jié)對(duì)質(zhì)控樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，按照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行增菌培養(yǎng)，將增菌培養(yǎng)物劃線接種于相應(yīng)的平板上分離，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行生化鑒定等。4.檢驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)注意生物安全防護(hù)，實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)對(duì)質(zhì)控樣品進(jìn)行無(wú)害化處理。質(zhì)控樣品檢驗(yàn)1.檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)收到質(zhì)控樣品后應(yīng)檢查包裝的完整性，129質(zhì)控結(jié)果報(bào)告1.32家省級(jí)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)匯總省內(nèi)質(zhì)控結(jié)果，于2010年7月15日前（以郵戳為準(zhǔn)）報(bào)中國(guó)CDC營(yíng)養(yǎng)食品所。質(zhì)控結(jié)果報(bào)告內(nèi)容應(yīng)包括細(xì)菌檢驗(yàn)結(jié)果（附表一）和檢驗(yàn)記錄及詳細(xì)數(shù)據(jù)等。2.質(zhì)控樣品中的細(xì)菌鑒定到屬，并報(bào)告其學(xué)名。質(zhì)控結(jié)果報(bào)告1.32家省級(jí)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)匯總省內(nèi)質(zhì)控結(jié)果，于20130質(zhì)控結(jié)果的評(píng)價(jià)中國(guó)CDC營(yíng)養(yǎng)食品所負(fù)責(zé)將各檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的上報(bào)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合統(tǒng)計(jì)處理，對(duì)質(zhì)控結(jié)果作出分析評(píng)價(jià)。將考核結(jié)果反饋被考核單位，并上報(bào)衛(wèi)生部。質(zhì)控結(jié)果的評(píng)價(jià)中國(guó)CDC營(yíng)養(yǎng)食品所負(fù)責(zé)將各檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的上報(bào)數(shù)據(jù)131謝謝大家！謝謝大家！132食源性致病菌檢驗(yàn)技術(shù)

及質(zhì)量控制

食源性致病菌檢驗(yàn)技術(shù)

及質(zhì)量控制133內(nèi)容1.創(chuàng)傷弧菌檢驗(yàn)2.大腸菌群檢驗(yàn)3.沙門氏菌檢驗(yàn)4.大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn)5.副溶血弧菌檢驗(yàn)6.空腸彎曲菌檢驗(yàn)7.金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)8.單核細(xì)胞增生李斯特菌檢驗(yàn)9.阪崎腸桿菌檢驗(yàn)10.質(zhì)量控制內(nèi)容1.創(chuàng)傷弧菌檢驗(yàn)134創(chuàng)傷弧菌檢驗(yàn)創(chuàng)傷弧菌檢驗(yàn)135沒(méi)有國(guó)標(biāo)食物中毒診斷國(guó)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)美國(guó)FDABAM網(wǎng)絡(luò)版第9章弧菌2004NMKL食品中致病性弧菌的檢驗(yàn)1997加拿大魚(yú)和海產(chǎn)品創(chuàng)傷弧菌的分離計(jì)數(shù)MFLP-731995日本食品衛(wèi)生檢查指征2004沒(méi)有國(guó)標(biāo)136選擇性增菌液堿性蛋白胨水選擇性分離培養(yǎng)基

硫代硫酸鹽－檸檬酸鹽－膽鹽－蔗糖（TCBS）瓊脂改良纖維二糖-多粘菌素B-多粘菌素E（mCPC）瓊脂和纖維二糖-多粘菌素E（CC）瓊脂平板

―探針克隆雜交顯示，兩種平板上均有95％以上的可疑菌落為創(chuàng)傷弧菌選擇性增菌液137引起胃腸炎、傷口感染和原發(fā)性敗血癥人類感染是因?yàn)槭秤蒙虬肷氖芪廴竞．a(chǎn)品,或是因?yàn)閭诮佑|了帶菌的海水或海洋動(dòng)物罹患肝病、血色病的個(gè)體易感者及免疫功能低下者,一旦感染創(chuàng)傷弧菌,更容易發(fā)生致命的傷口感染和原發(fā)性敗血癥,后者的病死率超過(guò)50％創(chuàng)傷弧菌是美國(guó)海產(chǎn)品消費(fèi)引起死亡的首要原因,美國(guó)州際貝類衛(wèi)生委員會(huì)規(guī)定,收獲后經(jīng)處理的牡蠣中創(chuàng)傷弧菌限量不超過(guò)30CFU/g。估計(jì)日本每年創(chuàng)傷弧菌敗血癥病例數(shù)約為425例。大陸沿海地區(qū)也時(shí)有創(chuàng)傷弧菌散發(fā)感染的報(bào)告引起胃腸炎、傷口感染和原發(fā)性敗血癥138創(chuàng)傷弧菌（Vibriovulnificus）1976年首次發(fā)現(xiàn)引起傷口感染致死性的原發(fā)性敗血癥胃腸道感染曾稱為乳糖陽(yáng)性弧菌革蘭氏陰性嗜鹽菌兼性厭氧3個(gè)生物型創(chuàng)傷弧菌（Vibriovulnificus）1976年首次13936℃±1℃，18h～24h39℃～40℃或36℃±1℃，18h～24h36℃±1℃，12h～16h樣品25g（mL）+225mL3％氯化鈉堿性蛋白胨水3％氯化鈉堿性蛋白胨水3管×3個(gè)合適的稀釋度如果進(jìn)行定性檢測(cè)，則不需要進(jìn)行此步驟挑取可疑菌落，接種于3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂生化試驗(yàn)或選用API20E生化鑒定試劑盒結(jié)果報(bào)告改良纖維二糖-多粘菌素B-多粘菌素E瓊脂或纖維二糖-多粘菌素E瓊脂劃線分離篩選試驗(yàn)氧化酶試驗(yàn)，革蘭氏染色，3％氯化鈉三糖鐵瓊脂，嗜鹽性試驗(yàn)36℃±1℃，18h～24h39℃～40℃或36140樣品制備非冷凍樣品采集后應(yīng)立即置7℃～10℃冰箱保存，盡可能及早檢驗(yàn)；冷凍樣品應(yīng)在45℃以下不超過(guò)15min或在2℃～5℃不超過(guò)18h解凍；如果樣品需要冷凍貯存，應(yīng)在樣品中加等量緩沖甘油-氯化鈉溶液（液體樣品應(yīng)加雙料），推薦貯存溫度為-70℃以下。魚(yú)類和頭足類動(dòng)物取表面組織、腸或鰓。貝類取全部?jī)?nèi)容物，包括貝肉和體液；甲殼類取整個(gè)動(dòng)物，或者動(dòng)物的中心部分，包括腸和鰓。如為帶殼貝類或甲殼類，則應(yīng)先在自來(lái)水中洗刷外殼并甩干表面水分，然后以無(wú)菌操作打開(kāi)外殼，按上述要求取相應(yīng)部分。樣品制備非冷凍樣品采集后應(yīng)立即置7℃～10℃冰箱保存，盡可能141以無(wú)菌操作取檢樣25g（mL），加入3％氯化鈉堿性蛋白胨水225mL，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以8000r/min均質(zhì)1min，或拍擊式均質(zhì)器拍擊2min，制備成1:10的均勻稀釋液。如無(wú)均質(zhì)器，則將樣品放入無(wú)菌乳缽中磨碎，然后放在500mL的滅菌容器內(nèi)，加225mL3％氯化鈉堿性蛋白胨水，并充分振蕩。以無(wú)菌操作取檢樣25g（mL），加入3％氯化鈉堿性蛋白胨水142增菌定性檢測(cè)將上述1:10稀釋液于36℃±1℃培養(yǎng)12h～16h。增菌定性檢測(cè)143定量檢測(cè)用滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL，注入含有9mL3％氯化鈉堿性蛋白胨水的試管內(nèi)，充分混勻，制備1:100的稀釋液。另取1mL滅菌吸管，按上條操作依次制備10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管。根據(jù)對(duì)檢樣污染情況的估計(jì)，選擇三個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三支含有9mL3％氯化鈉堿性蛋白胨水的試管，每管接種1mL。置36℃±1℃恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)12h～16h。定量檢測(cè)144分離對(duì)所有顯示生長(zhǎng)的增菌液，用接種環(huán)在距離液面以下1cm內(nèi)沾取一環(huán)，于mCPC或CC平板上劃線分離。一支試管劃線一塊平板。于39℃～40℃或36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。分離對(duì)所有顯示生長(zhǎng)的增菌液，用接種環(huán)在距離液面以下1cm內(nèi)145分離平板——mCPC和CC典型的創(chuàng)傷弧菌在mCPC和CC平板上呈現(xiàn)為圓的、扁平的、中心不透明邊緣透明的黃色菌落，直徑1mm～2mm。分離平板——mCPC和CC典型的創(chuàng)傷弧菌在mCPC和C146純培養(yǎng)挑取三個(gè)或以上的可疑菌落，劃線3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。純培養(yǎng)挑取三個(gè)或以上的可疑菌落，劃線3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊147初步鑒定氧化酶試驗(yàn)：挑選純培養(yǎng)的單個(gè)菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，創(chuàng)傷弧菌為氧化酶陽(yáng)性。涂片鏡檢：將可疑菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察形態(tài)。創(chuàng)傷弧菌為革蘭氏陰性，呈棒狀或弧狀。挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，轉(zhuǎn)種3％氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層，36℃±1℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。創(chuàng)傷弧菌在3％氯化鈉三糖鐵瓊脂中的反應(yīng)為底層變黃不變黑，無(wú)氣泡，斜面顏色不變或紅色加深，偶爾斜面變黃。初步鑒定氧化酶試驗(yàn)：挑選純培養(yǎng)的單個(gè)菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，創(chuàng)傷148V-P試驗(yàn)：以接種針由3％氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面挑取少許培養(yǎng)物穿刺3％氯化鈉MR-VP培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)24h，在加V-P試劑前應(yīng)先觀察動(dòng)力。沿穿刺線周圍呈擴(kuò)散性生長(zhǎng)為動(dòng)力陽(yáng)性。嗜鹽性試驗(yàn)：挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，分別接種于不同氯化鈉濃度的胰胨水，36℃±1℃培養(yǎng)24h，觀察液體混濁情況。創(chuàng)傷弧菌在無(wú)氯化鈉、8％氯化鈉和10％氯化鈉的胰胨水中不生長(zhǎng)，在6％氯化鈉的胰胨水中生長(zhǎng)旺盛。V-P試驗(yàn)：以接種針由3％氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面挑取少許培養(yǎng)物149確定鑒定生化試驗(yàn)：取純培養(yǎng)物分別接種含3％氯化鈉的賴氨酸培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h后觀察結(jié)果。隔夜培養(yǎng)物進(jìn)行ONPG試驗(yàn)。API20E生化鑒定試劑盒：刮取3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上的單個(gè)菌落，用3％氯化鈉溶液制備成濁度適當(dāng)?shù)募?xì)菌懸浮液，使用API20E生化鑒定試劑盒鑒定。確定鑒定生化試驗(yàn)：取純培養(yǎng)物分別接種含3％氯化鈉的賴氨酸培養(yǎng)150創(chuàng)傷弧菌的生化性狀試驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果革蘭氏染色鏡檢陰性，棒狀或弧狀氧化酶＋動(dòng)力＋D-纖維二糖＋蔗糖－葡萄糖＋分解葡萄糖產(chǎn)氣－乳糖＋，或遲緩＋硫化氫－賴氨酸脫羧酶＋V-P－ONPG＋注：＋陽(yáng)性；－陰性。創(chuàng)傷弧菌的生化性狀試驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果革蘭氏染色鏡檢陰性，棒狀或弧狀151報(bào)告當(dāng)檢出的可疑菌落生化性狀符合表1要求時(shí)，報(bào)告25g（mL）樣品中檢出創(chuàng)傷弧菌。如果進(jìn)行定量檢測(cè)，根據(jù)證實(shí)為創(chuàng)傷弧菌陽(yáng)性的試管管數(shù)，查最可能數(shù)（MPN）檢索表，報(bào)告每g（mL）創(chuàng)傷弧菌的MPN值。報(bào)告當(dāng)檢出的可疑菌落生化性狀符合表1要求時(shí)，報(bào)告25g（m152大腸菌群檢驗(yàn)大腸菌群檢驗(yàn)153大腸菌群定義：一群在36℃條件下培養(yǎng)24~48小時(shí)能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。衛(wèi)生學(xué)概念，包括埃希氏菌屬，克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬和檸檬酸桿菌屬等的細(xì)菌檢驗(yàn)比較簡(jiǎn)單，所以被廣泛用做水源的衛(wèi)生指標(biāo)和食品加工衛(wèi)生狀況的通用指標(biāo)大腸菌群定義：一群在36℃條件下培養(yǎng)24~48小時(shí)能發(fā)酵乳糖154大腸菌群計(jì)數(shù)第一法MPN法第二法平板計(jì)數(shù)法第三法Petrifilm測(cè)試片法大腸菌群計(jì)數(shù)第一法MPN法155第一法MPN法與原4789.3的不同操作步驟不同原方法：初發(fā)酵→EMB分離培養(yǎng)→染色，復(fù)發(fā)酵→報(bào)告現(xiàn)方法：LST初發(fā)酵→BGLB驗(yàn)證→報(bào)告第一法MPN法與原4789.3的不同156初發(fā)酵培養(yǎng)基不同原方法：乳糖膽鹽肉湯現(xiàn)方法：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯LST肉湯是國(guó)際上通用的培養(yǎng)基。與乳糖膽鹽肉湯的作用和意義相同，但具有更多的優(yōu)越性，LST中的選擇性抑菌劑是月桂基硫酸鹽，相對(duì)于膽鹽穩(wěn)定性更好些。還有就是LST更容易觀察。初發(fā)酵培養(yǎng)基不同157結(jié)果報(bào)告單位不同原方法：MPN/100g(mL)現(xiàn)方法：MPN/g(mL)結(jié)果報(bào)告單位不同158食源性致病菌檢驗(yàn)技術(shù)及質(zhì)量控制課件159大腸菌群PetrifilmTM測(cè)試片法PetrifilmTM大腸菌群測(cè)試片是一種預(yù)先制備好的培養(yǎng)基系統(tǒng)，含有VRB培養(yǎng)基，冷水可溶性凝膠和TTC指示劑，可增強(qiáng)菌落計(jì)數(shù)效果。表面覆蓋的膠膜，可截留發(fā)酵乳糖的大腸菌群產(chǎn)生的氣體。培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)數(shù)紅點(diǎn)周圍有氣泡的菌落為大腸菌群數(shù)。

大腸菌群PetrifilmTM測(cè)試片法PetrifilmTM160檢樣25g(ml)樣品＋225ml稀釋液,均質(zhì)↓稀釋↓接種PetrifilmTM大腸菌群測(cè)試片↓培養(yǎng)↓

361C24h2h

計(jì)數(shù)紅色帶氣泡的菌落↓計(jì)算菌落總數(shù)↓報(bào)告檢樣↓稀釋↓接種PetrifilmTM大腸菌群測(cè)試片↓培養(yǎng)↓161樣品制備按大腸菌群MPN法的樣品制備方法進(jìn)行。樣品pH的調(diào)節(jié)同大腸菌群MPN法中樣品pH的調(diào)節(jié)。即樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5～7.5之間，pH值過(guò)低或過(guò)高時(shí)分別用1MNaOH或1MHCl予以調(diào)節(jié)。樣品制備按大腸菌群MPN法的樣品制備方法進(jìn)行。162樣品的接種與培養(yǎng)將待檢樣品選取適宜的2~3個(gè)連續(xù)稀釋度,每個(gè)稀釋度接種2張測(cè)試片。將PetrifilmTM大腸菌群測(cè)試片置于平坦實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，揭開(kāi)上層膜，用吸管吸取1mL樣液垂直滴加在測(cè)試片的中央，將上層膜緩慢蓋下，避免氣泡產(chǎn)生和上層膜直接落下，把壓板（平面底朝下）放置在上層膜中央，輕輕地壓下，使樣液均勻覆蓋于圓形的培養(yǎng)面積上，切勿扭轉(zhuǎn)壓板。拿起壓板，靜置至少1分鐘以使培養(yǎng)基凝固。將測(cè)試片的透明面朝上置于培養(yǎng)箱內(nèi)，堆疊片數(shù)不超過(guò)20片，36C±1C培養(yǎng)24h2h。樣品的接種與培養(yǎng)將待檢樣品選取適宜的2~3個(gè)連續(xù)稀釋度,每163判讀培養(yǎng)24h2h后應(yīng)立即計(jì)數(shù)，可目測(cè)、用標(biāo)準(zhǔn)菌落計(jì)數(shù)器、顯微鏡、或PetrifilmTM自動(dòng)判讀儀來(lái)計(jì)數(shù)。紅色有氣泡的菌落確認(rèn)為大腸菌群數(shù)。培養(yǎng)圓形面積邊緣上及邊緣以外的菌落不作計(jì)數(shù)。當(dāng)培養(yǎng)區(qū)域出現(xiàn)大量氣泡，大量不明顯小菌落或培養(yǎng)區(qū)呈暗紅色三種情況，表明大腸菌群的濃度較高，需要進(jìn)一步稀釋樣品來(lái)獲得準(zhǔn)確的讀數(shù)。判讀培養(yǎng)24h2h后應(yīng)立即計(jì)數(shù)，可目測(cè)、用標(biāo)準(zhǔn)菌落計(jì)數(shù)164結(jié)果報(bào)告1)選取菌落數(shù)在15~150之間的測(cè)試片作為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn);2)選擇菌落數(shù)在15~150之間的稀釋度，平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之；3)如果所有稀釋度測(cè)試片上的菌落數(shù)都小于15,則計(jì)數(shù)稀釋度最低的測(cè)試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之；4)如果所有稀釋度的測(cè)試片上均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以(<)1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之；5)如果最高稀釋度的菌落數(shù)大于150個(gè)時(shí)，計(jì)數(shù)最高稀釋度的測(cè)試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之；6)計(jì)數(shù)菌落數(shù)大于150個(gè)的測(cè)試片時(shí)，可計(jì)數(shù)一個(gè)或兩個(gè)具有代表性的方格內(nèi)的菌落數(shù)，換算成單個(gè)方格內(nèi)的菌落數(shù)后乘以20即為測(cè)試片上估算的菌落數(shù)(圓形生長(zhǎng)面積為20cm2)。7)最終菌落濃度的單位以“cfu/g(mL)”表示。結(jié)果報(bào)告1)選取菌落數(shù)在15~150之間的測(cè)試片作為計(jì)數(shù)標(biāo)165沙門氏菌檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)166沙門氏菌腸道傳染病人類沙門氏菌病分為兩大類:1、傷寒與副傷寒:在世界范圍內(nèi)顯著下降,我國(guó)仍有散在發(fā)生,時(shí)有局部暴發(fā)流行.2、

沙門氏菌急性胃腸炎:在世界,在我國(guó)呈上升趨勢(shì),通過(guò)動(dòng)物廣泛分布,家禽和豬是主要的儲(chǔ)存宿主,在食品和許多動(dòng)物制品中發(fā)現(xiàn),是傳播的主要原因.

沙門氏菌腸道傳染病人類沙門氏菌病分為兩大類:167沙門氏菌食物中毒引起食物中毒最常見(jiàn)的沙門氏菌：鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌易引起沙門氏菌中毒的食品：肉、蛋、乳類食品中毒原因：1、食用病畜禽的肉制品食品2、病畜禽、帶菌人和動(dòng)物使食品受污染3、用不潔凈水外理食品沙門氏菌食物中毒引起食物中毒最常見(jiàn)的沙門氏菌：鼠傷寒沙門168沙門氏菌檢驗(yàn)流程前增菌：用無(wú)選擇性的培養(yǎng)基使處于瀕死狀態(tài)的細(xì)菌恢復(fù)活力;BPW選擇性增菌：使沙門氏菌優(yōu)勢(shì)繁殖，其它細(xì)菌受到抑制;SC+TT