核酸含量測定-定磷法課件

核酸含量測定定磷法1核酸含量測定定磷法1核酸定量測定常見的方法1.定磷法：將核酸消化，測定其無機磷量，由此計算出核酸含量，反應靈敏。2.紫外吸收法：利用核酸在260nm處有吸收高峰，操作簡便，受蛋白質(zhì)和核苷酸的干擾影響。3.地衣酚法：用于測定RNA的含量，RNA與濃鹽酸共熱，降解形成的核糖轉(zhuǎn)變?yōu)榭啡?，利用地衣酚反應來測定，特異性差，戊糖均有此反應。4.二苯胺法：DNA中的脫氧核糖在酸性溶液中轉(zhuǎn)化為ω-羥-γ-酮基戊醛，利用二苯胺試劑反應，除脫氧木糖和阿拉伯糖外其他糖類無此反應。2核酸定量測定常見的方法1.定磷法：將核酸消化，測定其無機磷定磷法的原理首先將核酸樣品用硫酸消化成無機磷，利用定磷試劑測定無機磷量。反應式為：(NH4)MoO4+H2SO4H2MoO4+(NH4)2SO4H3PO4+12H2MoO4H3P(Mo3O10)4+12H2O

H3P(Mo3O10)4Mo2O3?

MoO3（鉬藍）Vit?C3定磷法的原理首先將核酸樣品用硫酸消化成無機

還原產(chǎn)物鉬藍在波長660nm測定吸光值，當無機磷含量在1—25μg范圍內(nèi)，光吸收和含磷量成正比。

RNA的含磷量為9.5%，即1μgRNA磷相當于10.5μgRNA。DNA的含磷量平均為9.9%。4還原產(chǎn)物鉬藍在波長660nm測定吸光值，當無試劑酵母RNA樣品溶液：2000μg/mL標準磷原液：含磷量為1000μg/mL標準磷溶液：含磷量為10μg/mL，每組用干試管取15mL定磷試劑：含硫酸、鉬酸銨、Vit.C，淺黃色，如果變綠則不能使用,每組用100mL燒杯取70mL5試劑酵母RNA樣品溶液：2000μg/mL5實驗步驟1.核酸樣品用硫酸消化，將有機磷轉(zhuǎn)化成無機磷；2.制定定磷標準曲線；3.測定回收率和樣品總磷量。6實驗步驟1.核酸樣品用硫酸消化，將有機磷轉(zhuǎn)化成無機磷；61.樣品消化（每兩組或三組做一份）消化管123RNA/mL010標準磷原液/mL001dH2O/mL1005mol/LH2SO4/mL222消煮爐中消化2—6h至溶液無色透明，冷卻dH2O/mL111沸水浴中加熱10min（分解焦磷酸），冷卻用dH2O定容/mL505050混勻71.樣品消化（每兩組或三組做一份）消化管123RNA/m2.定磷標準曲線的制定（每人做一份）

每人取18支試管，按照下表平行操作：

1

234

5

6標準磷溶液/mL00.10.20.30.40.5dH2O/mL1.51.41.31.21.11.0定磷試劑/mL1.51.51.51.51.51.5用漩渦混合器混勻，45℃恒溫水浴保溫25分鐘用去離子水作為空白，660nm測定吸光值A660(1)A660(2)A660平均值A660平均值—空白082.定磷標準曲線的制定（每人做一份）

每人取

3.測定總磷量和回收率（與2同時進行）7（空白）

8（樣品）9（標準）定容溶液/mL1.51.50.15dH2O/mL001.35定磷試劑/mL1.51.51.5用漩渦混合器混勻，45℃恒溫水浴保溫25分鐘A660(1)A660(2)A660平均值A660平均值—空白093.測定總磷量和回收率（與2同時進行）7（空白）

8（樣數(shù)據(jù)處理關于空白：1—6號管用于繪制定磷標準曲線，1號管作為空白。7—9號管用于樣品及回收率的測定，7號管作為空白。以每管含磷量(μg)為橫坐標，吸光值為縱坐標畫標準曲線，直線應過原點。在標準曲線上查出樣品(x)和標準磷(y)的含磷量(μg)。10數(shù)據(jù)處理關于空白：10計算回收率：

(2)計算樣品總磷量：

(3)計算RNA量：

(4)樣品RNA含量：11計算回收率：11操作注意事項1.每人獨立操作，不允許兩人穿插取樣；2.要求試劑及所有器皿清潔，不含磷；3.每管加樣和測定均要求平行操作；4.消化溶液定容后務必上下顛倒混勻后再取樣；5.各種試劑必須用移液管按順序準確量取，移液管口用吸水紙擦凈，溶液盡量加到試管下部，標準溶液要求用差量法。6.漩渦混合器的使用：用點動檔，試管豎直或稍傾斜垂直向下用力。7.測定吸光值時，用一個比色杯裝去離子水調(diào)節(jié)分光光度計零點，另一個比色杯按照從低濃度到高濃度的順序測定，不用潤洗，切忌甩比色杯，將藍色溶液撒在儀器和地面上。

12操作注意事項1.每人獨立操作，不允許兩人穿插取樣；12思考題1.回收率的意義；2.實驗所用的水質(zhì)、試劑質(zhì)量、定磷試劑的酸度對測定結果的影響。13思考題1.回收率的意義；13實驗結束將試管洗凈，斜插在試管架上，放在臺面上。將消化管和橡皮塞洗凈，放回原處。將比色杯洗凈，放在實驗臺上的小平皿中。將實驗臺面擦干凈。14實驗結束將試管洗凈，斜插在試管架上，放在臺面上。14核酸含量測定定磷法15核酸含量測定定磷法1核酸定量測定常見的方法1.定磷法：將核酸消化，測定其無機磷量，由此計算出核酸含量，反應靈敏。2.紫外吸收法：利用核酸在260nm處有吸收高峰，操作簡便，受蛋白質(zhì)和核苷酸的干擾影響。3.地衣酚法：用于測定RNA的含量，RNA與濃鹽酸共熱，降解形成的核糖轉(zhuǎn)變?yōu)榭啡?，利用地衣酚反應來測定，特異性差，戊糖均有此反應。4.二苯胺法：DNA中的脫氧核糖在酸性溶液中轉(zhuǎn)化為ω-羥-γ-酮基戊醛，利用二苯胺試劑反應，除脫氧木糖和阿拉伯糖外其他糖類無此反應。16核酸定量測定常見的方法1.定磷法：將核酸消化，測定其無機磷定磷法的原理首先將核酸樣品用硫酸消化成無機磷，利用定磷試劑測定無機磷量。反應式為：(NH4)MoO4+H2SO4H2MoO4+(NH4)2SO4H3PO4+12H2MoO4H3P(Mo3O10)4+12H2O

H3P(Mo3O10)4Mo2O3?

MoO3（鉬藍）Vit?C17定磷法的原理首先將核酸樣品用硫酸消化成無機

還原產(chǎn)物鉬藍在波長660nm測定吸光值，當無機磷含量在1—25μg范圍內(nèi)，光吸收和含磷量成正比。

RNA的含磷量為9.5%，即1μgRNA磷相當于10.5μgRNA。DNA的含磷量平均為9.9%。18還原產(chǎn)物鉬藍在波長660nm測定吸光值，當無試劑酵母RNA樣品溶液：2000μg/mL標準磷原液：含磷量為1000μg/mL標準磷溶液：含磷量為10μg/mL，每組用干試管取15mL定磷試劑：含硫酸、鉬酸銨、Vit.C，淺黃色，如果變綠則不能使用,每組用100mL燒杯取70mL19試劑酵母RNA樣品溶液：2000μg/mL5實驗步驟1.核酸樣品用硫酸消化，將有機磷轉(zhuǎn)化成無機磷；2.制定定磷標準曲線；3.測定回收率和樣品總磷量。20實驗步驟1.核酸樣品用硫酸消化，將有機磷轉(zhuǎn)化成無機磷；61.樣品消化（每兩組或三組做一份）消化管123RNA/mL010標準磷原液/mL001dH2O/mL1005mol/LH2SO4/mL222消煮爐中消化2—6h至溶液無色透明，冷卻dH2O/mL111沸水浴中加熱10min（分解焦磷酸），冷卻用dH2O定容/mL505050混勻211.樣品消化（每兩組或三組做一份）消化管123RNA/m2.定磷標準曲線的制定（每人做一份）

每人取18支試管，按照下表平行操作：

1

234

5

6標準磷溶液/mL00.10.20.30.40.5dH2O/mL1.51.41.31.21.11.0定磷試劑/mL1.51.51.51.51.51.5用漩渦混合器混勻，45℃恒溫水浴保溫25分鐘用去離子水作為空白，660nm測定吸光值A660(1)A660(2)A660平均值A660平均值—空白0222.定磷標準曲線的制定（每人做一份）

每人取

3.測定總磷量和回收率（與2同時進行）7（空白）

8（樣品）9（標準）定容溶液/mL1.51.50.15dH2O/mL001.35定磷試劑/mL1.51.51.5用漩渦混合器混勻，45℃恒溫水浴保溫25分鐘A660(1)A660(2)A660平均值A660平均值—空白0233.測定總磷量和回收率（與2同時進行）7（空白）

8（樣數(shù)據(jù)處理關于空白：1—6號管用于繪制定磷標準曲線，1號管作為空白。7—9號管用于樣品及回收率的測定，7號管作為空白。以每管含磷量(μg)為橫坐標，吸光值為縱坐標畫標準曲線，直線應過原點。在標準曲線上查出樣品(x)和標準磷(y)的含磷量(μg)。24數(shù)據(jù)處理關于空白：10計算回收率：

(2)計算樣品總磷量：

(3)計算RNA量：

(4)樣品RNA含量：25計算回收率：11操作注意事項1.每人獨立操作，不允許兩人穿插取樣；2.要求試劑及所有器皿清潔，不含磷；3.每管加樣和測定均要求平行操作；4.消化溶液定容后務必上下顛倒混勻后再取樣；5.各種試劑必須用移液管按順序準確量取，移液管口用吸水紙擦凈，溶液盡量加到試管下部，標準溶液要求用差量法。6.漩渦混合器的使用：用點動檔，試管豎直或稍傾斜垂直向下用力。7.測定吸光值時，用一個比色杯裝去離子水調(diào)節(jié)分光光度計零點，另一個比色杯按照從低濃度到高濃度的順序測定，不用潤洗，切忌