核酸的分離提取及定量課件

動(dòng)物組織中核酸的提取動(dòng)物組織中核酸的提取實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙饬x能夠說(shuō)出組織DNA分離提純的原理及方法并能夠抽提制備DNA能夠說(shuō)出組織RNA分離提純的原理及方法并能夠抽提制備RNA。實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙饬x2前言

核酸（nucleicacid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。無(wú)論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對(duì)核酸進(jìn)行分離和純化。核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。

前言核酸（nucleicacid）是遺傳信3分離純化核酸的原則應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的最基本要求減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解：溫度不要過(guò)高；控制pH值范圍(pH值5-9);保持一定離子強(qiáng)度;減少物理因素對(duì)核酸的降解：

避免機(jī)械剪切力破壞核酸結(jié)構(gòu)分離純化核酸的原則應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性4分離純化核酸的原則防止核酸的生物降解：細(xì)胞內(nèi)或外來(lái)的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)。進(jìn)行核酸分離時(shí)最好新鮮生物組織或細(xì)胞樣品，若不能馬上進(jìn)行提取，應(yīng)將材料貯存于液氮中或-70℃冰箱中。所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。分離純化核酸的原則防止核酸的生物降解：5分離純化核酸的原則排除蛋白質(zhì)、脂類、糖類等其他分子的污染無(wú)其他核酸分子的污染（如抽提DNA分子時(shí)應(yīng)去除RNA分子）。分離純化核酸的原則6核酸的性質(zhì)DNA、RNA的理化性質(zhì)特點(diǎn)：核酸分子中既含有酸性基團(tuán)（磷酸基）也含有堿性基團(tuán)（氨基），因而核酸具有兩性性質(zhì)，是兩性電解質(zhì)。由于核酸分子中的磷酸是一個(gè)中等強(qiáng)度的酸，而堿性（氨基）是一個(gè)弱堿，所以核酸通常表現(xiàn)為酸性，等電點(diǎn)比較低。如DNA的等電點(diǎn)為pI4-4.5，RNA的等電點(diǎn)為pI2-2.5。DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末狀固體。DNA和RNA都是極性化合物，因此他們一般都微溶于水，而不溶于乙醇，乙醚，氯仿等有機(jī)溶劑。核酸的性質(zhì)DNA、RNA的理化性質(zhì)特點(diǎn)：7核酸的性質(zhì)核酸的存在方式：

DNA和RNA在細(xì)胞中通常以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在。他們與蛋白質(zhì)結(jié)合形成的復(fù)合物分別稱為DNP（脫氧核糖核蛋白）和RNP（核糖核蛋白）。

核酸的性質(zhì)核酸的存在方式：8核酸純化原理DNA分離純化原理：

脫氧核糖核蛋白（DNP）在0.14mol/LNaCl中溶解度很低，而核糖核蛋白（RNP）卻較易溶解，因此用上述濃度的NaCl洗滌組織勻漿，可得到DNP，再用氯仿-異戊醇除蛋白即可得到DNA。

RNA分離純化原理：組織勻漿在酚與十二烷基硫酸鈉(SDS)存在下，RNA與蛋白質(zhì)分離。酚使蛋白質(zhì)變性凝固，RNA則溶解在水相中，用乙醇使RNA從水相中沉淀而達(dá)到分離。核酸純化原理DNA分離純化原理：9DNA分離純化實(shí)驗(yàn)步驟剪碎組織放入勻漿器加入0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA液7mL棄上清。沉淀中加入0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA液6mL混勻。勻漿，離心5000r/min，5min沉淀中加入3mL0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA,轉(zhuǎn)入勻漿器勻漿，在攪拌下緩緩滴入250g/LSDS0.4mL勻漿，使沉淀懸浮均勻再加入2mol/LNaCl4mL（此時(shí)由于大分子脫氧核糖核蛋白的溶出，溶液粘度驟然升高，再勻漿，使之均勻）加氯仿-異丙醇5mL，劇烈振搖10min?；旌衔镫x心上層水液，下層氯仿，交界面為變性蛋白。收集上層水液邊搖變加入等體積95%乙醇，即可見(jiàn)有長(zhǎng)纖維狀DNA析出5000r/min離心5min3000r/min離心10minDNA分離純化實(shí)驗(yàn)步驟剪碎組織放入勻漿器加入0.14mo10RNA分離純化實(shí)驗(yàn)步驟加入3mL0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液,250g/LSDS0.5mL，勻漿移入三角燒瓶中，65℃水浴中繼續(xù)振搖5-8min，取出流水冷卻5000r/min離心10-15min上層為稍渾濁含有RNA的水相，中層為變性蛋白質(zhì)，下層為酚液，管底殘?jiān)蠨NA。收集上層水液于量筒中，測(cè)水液的體積，加入1/10體積的2mol/L醋酸鈉溶液，混勻。再加2.倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻，冷處放置至絮狀沉淀充分形成（絮狀沉淀即為RNA）再加入等體積80%酚（約4mL），勻漿RNA分離純化實(shí)驗(yàn)步驟加入3mL0.05mol/L醋11核酸分離純化中各試劑的作用

DNP在2mol/LNaCl中易溶解DNP在0.14mol/LNaCl中不溶RNP在0.14mol/LNaCl中易溶解

EDTA：DNA酶抑制劑

DNA酶需要金屬二價(jià)離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價(jià)離子螯合劑EDTA，可抑制DNA酶活性。

氯仿異戊醇抽提：

氯仿可使蛋白質(zhì)變性并加速有機(jī)相與液相分層；異戊醇有助于消除抽提過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡。DNA分離純化核酸分離純化中各試劑的作用DNP在2mol/LNaCl12

乙醇沉淀法：

DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。用無(wú)水乙醇沉淀DNA，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。

可用95％乙醇來(lái)替代無(wú)水乙醇（因?yàn)闊o(wú)水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95％乙醇昂貴）但是加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時(shí)，就會(huì)影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時(shí)可用95％乙醇代替無(wú)水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無(wú)水乙醇。核酸分離純化中各試劑的作用乙醇沉淀法：核酸分離純化中各試劑的作用13RNA分離純化：0.5mol/L醋酸-醋酸鈉溶液使混合物中DNA沉淀

2mol/L醋酸醋酸鈉溶液提供一定鹽離子促進(jìn)RNA沉淀SDS：陰離于型表面活性劑使蛋白質(zhì)變性，有破胞和抑制核酸酶的作用；苯酚抽提法：苯酚是極強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)變性劑，它幾乎使所有遇到的蛋白質(zhì)都變性。能增加去除蛋白的效果，并對(duì)核酸酶有抑制作用。乙醇沉淀法：原理同DNA沉淀。核酸分離純化中各試劑的作用RNA分離純化：核酸分離純化中各試劑的作用14盡量保持低溫下操作，作時(shí)注意避免破壞核酸結(jié)構(gòu)一般來(lái)講，核酸沉淀應(yīng)在低溫下長(zhǎng)時(shí)間下進(jìn)行。但是低溫長(zhǎng)時(shí)間沉淀，易導(dǎo)致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實(shí)驗(yàn)。因此一般使用0℃冰水，10-15min，DNA樣品足可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。使用酚時(shí)應(yīng)注意酚通常是透明無(wú)色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物。變色的酚不能用于核酸抽提實(shí)驗(yàn)，氧化物可破壞核酸的磷酸二酯鍵。酚腐蝕性很強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套。

注意事項(xiàng)盡量保持低溫下操作，作時(shí)注意避免破壞核酸結(jié)構(gòu)注意事項(xiàng)15動(dòng)物組織中核酸的提取動(dòng)物組織中核酸的提取實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙饬x能夠說(shuō)出組織DNA分離提純的原理及方法并能夠抽提制備DNA能夠說(shuō)出組織RNA分離提純的原理及方法并能夠抽提制備RNA。實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙饬x17前言

核酸（nucleicacid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。無(wú)論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對(duì)核酸進(jìn)行分離和純化。核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。

前言核酸（nucleicacid）是遺傳信18分離純化核酸的原則應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的最基本要求減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解：溫度不要過(guò)高；控制pH值范圍(pH值5-9);保持一定離子強(qiáng)度;減少物理因素對(duì)核酸的降解：

避免機(jī)械剪切力破壞核酸結(jié)構(gòu)分離純化核酸的原則應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性19分離純化核酸的原則防止核酸的生物降解：細(xì)胞內(nèi)或外來(lái)的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)。進(jìn)行核酸分離時(shí)最好新鮮生物組織或細(xì)胞樣品，若不能馬上進(jìn)行提取，應(yīng)將材料貯存于液氮中或-70℃冰箱中。所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。分離純化核酸的原則防止核酸的生物降解：20分離純化核酸的原則排除蛋白質(zhì)、脂類、糖類等其他分子的污染無(wú)其他核酸分子的污染（如抽提DNA分子時(shí)應(yīng)去除RNA分子）。分離純化核酸的原則21核酸的性質(zhì)DNA、RNA的理化性質(zhì)特點(diǎn)：核酸分子中既含有酸性基團(tuán)（磷酸基）也含有堿性基團(tuán)（氨基），因而核酸具有兩性性質(zhì)，是兩性電解質(zhì)。由于核酸分子中的磷酸是一個(gè)中等強(qiáng)度的酸，而堿性（氨基）是一個(gè)弱堿，所以核酸通常表現(xiàn)為酸性，等電點(diǎn)比較低。如DNA的等電點(diǎn)為pI4-4.5，RNA的等電點(diǎn)為pI2-2.5。DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末狀固體。DNA和RNA都是極性化合物，因此他們一般都微溶于水，而不溶于乙醇，乙醚，氯仿等有機(jī)溶劑。核酸的性質(zhì)DNA、RNA的理化性質(zhì)特點(diǎn)：22核酸的性質(zhì)核酸的存在方式：

DNA和RNA在細(xì)胞中通常以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在。他們與蛋白質(zhì)結(jié)合形成的復(fù)合物分別稱為DNP（脫氧核糖核蛋白）和RNP（核糖核蛋白）。

核酸的性質(zhì)核酸的存在方式：23核酸純化原理DNA分離純化原理：

脫氧核糖核蛋白（DNP）在0.14mol/LNaCl中溶解度很低，而核糖核蛋白（RNP）卻較易溶解，因此用上述濃度的NaCl洗滌組織勻漿，可得到DNP，再用氯仿-異戊醇除蛋白即可得到DNA。

RNA分離純化原理：組織勻漿在酚與十二烷基硫酸鈉(SDS)存在下，RNA與蛋白質(zhì)分離。酚使蛋白質(zhì)變性凝固，RNA則溶解在水相中，用乙醇使RNA從水相中沉淀而達(dá)到分離。核酸純化原理DNA分離純化原理：24DNA分離純化實(shí)驗(yàn)步驟剪碎組織放入勻漿器加入0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA液7mL棄上清。沉淀中加入0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA液6mL混勻。勻漿，離心5000r/min，5min沉淀中加入3mL0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA,轉(zhuǎn)入勻漿器勻漿，在攪拌下緩緩滴入250g/LSDS0.4mL勻漿，使沉淀懸浮均勻再加入2mol/LNaCl4mL（此時(shí)由于大分子脫氧核糖核蛋白的溶出，溶液粘度驟然升高，再勻漿，使之均勻）加氯仿-異丙醇5mL，劇烈振搖10min?；旌衔镫x心上層水液，下層氯仿，交界面為變性蛋白。收集上層水液邊搖變加入等體積95%乙醇，即可見(jiàn)有長(zhǎng)纖維狀DNA析出5000r/min離心5min3000r/min離心10minDNA分離純化實(shí)驗(yàn)步驟剪碎組織放入勻漿器加入0.14mo25RNA分離純化實(shí)驗(yàn)步驟加入3mL0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液,250g/LSDS0.5mL，勻漿移入三角燒瓶中，65℃水浴中繼續(xù)振搖5-8min，取出流水冷卻5000r/min離心10-15min上層為稍渾濁含有RNA的水相，中層為變性蛋白質(zhì)，下層為酚液，管底殘?jiān)蠨NA。收集上層水液于量筒中，測(cè)水液的體積，加入1/10體積的2mol/L醋酸鈉溶液，混勻。再加2.倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻，冷處放置至絮狀沉淀充分形成（絮狀沉淀即為RNA）再加入等體積80%酚（約4mL），勻漿RNA分離純化實(shí)驗(yàn)步驟加入3mL0.05mol/L醋26核酸分離純化中各試劑的作用

DNP在2mol/LNaCl中易溶解DNP在0.14mol/LNaCl中不溶RNP在0.14mol/LNaCl中易溶解

EDTA：DNA酶抑制劑

DNA酶需要金屬二價(jià)離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價(jià)離子螯合劑EDTA，可抑制DNA酶活性。

氯仿異戊醇抽提：

氯仿可使蛋白質(zhì)變性并加速有機(jī)相與液相分層；異戊醇有助于消除抽提過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡。DNA分離純化核酸分離純化中各試劑的作用DNP在2mol/LNaCl27

乙醇沉淀法：

DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。用無(wú)水乙醇沉淀DNA，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。

可用95％乙醇來(lái)替代無(wú)水乙醇（因?yàn)闊o(wú)水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95％乙醇昂貴）但是加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在