豬流行性腹瀉病毒變異株的鑒定和分子特征分析

豬流行性腹瀉病毒變異株的鑒定和分子特征分析張志;程小娜;樊雅婷;董雅琴;劉爽;吳發(fā)興;邵衛(wèi)星;李曉成【摘要】為查明山東省某豬場流行性腹瀉的病因,本研究對該豬場病死仔豬進行病7(PEDVRT-PCRRT-PCR7PEDVPEDVSPEDVSCV77792.3％～92.4％96.6％～98.6％.PEDV,PEDVG1G2,G1,G2PEDV1PEDVPEDV【期刊名稱】《中國畜牧獸醫(yī)》【年(卷),期】2015(042)007【總頁數(shù)】7頁(P1654-1660)【關(guān)鍵詞】豬流行性腹瀉病毒;鑒定;分子特征;S基因【作者】張志;程小娜;樊雅婷;董雅琴;劉爽;吳發(fā)興;邵衛(wèi)星;李曉成【作者單位】266032570228;650100266032;中國動物266032266032;中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,青島266032;中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,青島266032【正文語種】中文【中圖分類】S852.651978Pensaert[1]用電鏡從發(fā)生腹瀉的豬體內(nèi)鑒定了一種新的病毒——豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)，PEDVRNA。PEDV1383主體內(nèi)介導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的過程中發(fā)揮主要生物學(xué)作用。PEDV2080902010103～4d90%～100%，給中國養(yǎng)豬業(yè)造成極其嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[3-6]。20143PEDV抗原S基因進行了擴增測序和遺傳變異分析，闡明該流行性腹瀉野毒株的分子結(jié)構(gòu)特點。樣品來源7頭呈現(xiàn)腹瀉癥狀的死亡小豬，分別為2～12日齡，來自山東省某豬場，剖檢后取其腸道和糞便樣品進行實驗室檢測。試劑RNA提取試劑盒TRIzol購自Invitrogen公司；pMD18-T載體、反轉(zhuǎn)錄酶AMV、ExTaq酶等均購自TaKaRa公司；其余試劑均為分析純。組織病理學(xué)檢測取病死仔豬的小腸適量，用10%福爾馬林溶液固定，制備組織病理學(xué)切片，進行HE染色，檢查發(fā)病仔豬的顯微病變。RNA1∶4PBS℃、5000r/min10min，然后吸出上清液用于提RNA。RNA250μL1.5mL750μLTRIzol，5min200μL10min；4℃、12000r/min15min500μL，加等體積-2010min，4℃、12000r/min10min75%冰冷乙醇，9000r/min5min；棄上清，倒置風(fēng)干，20μLDEPC20PEDVRT-PCRPEDVRT-PCRRT-PCR[7-8]的方法由畜病監(jiān)測室自行設(shè)計。外引物序列：PM-F1：5′-ACACCTATAGGG-CGCCTGTA-3′，PM-R1：5′-AACCCTAAGAGG-GGCATAGA-3′；內(nèi)引物序列：PM-F2：5′-3′854412bp，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。cDNA合成反應(yīng)體系20μL：RNA5μL，dNTP4μL，5×AMVBuffer4μL，反轉(zhuǎn)錄引物PM-R11μL，AMV0.5μL，HPRI0.5μL，DEPC水補至20μL。反應(yīng)條件：42℃溫浴1.5h，95℃加熱3min，取出后放入-20℃保存?zhèn)溆?。?輪PCR擴增體系：模板cDNA2μL，10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs(10mmol/L)2μL，引物PM-F1和PM-R1各0.5μL，ExTaqDNA0.25μL，ddH2O17.25μL。PCR：943min；9440s，561min，721min，30；7210min1PCR0.5μL，PM-F2PM-R2PCR擴增條件：943min；9430s，5630s，7230s32；7210min。PEDVSGenBankPEDVCH/GDGZ/2012(登錄號：KF384500SSS1、S2、S33PrimerSelect3S-F1/S-R1，S-F2/S-R2S-F3/S-F31。引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成。S1、S2S3PCR以提取的樣品RNA為模板，S-F1/S-R1、S-F2/S-R2、S-F3/S-F3為引物，采用一步法擴增S基因，反應(yīng)體系25μL：RNA3μL，PremixExTaqBuffer12.5μL，ExTaq0.2μL，上、下游引物各0.5μL，DEPC水8.3μL。S-F1/S-R1反應(yīng)條件：42℃1h；94℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，50.5℃退火40s，72℃延伸150s，共35個循環(huán)；72℃延伸10min。S-F2/S-R2反應(yīng)條件：42℃1h；94℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，60℃退火40s，72℃延伸110s，共35個循環(huán)；72℃延伸10min。S-F3/S-R3引物擴增時的退火溫度為57℃，其他反應(yīng)條件同S-F2/S-R2。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)后挑取單個菌落進行PCR鑒定，重組質(zhì)粒由寶生物工程(大連)有限公司進行測序。序列分析對7份樣品中兩株P(guān)EDV野毒株的S基因進行了測序，采用DNAStar軟件對S基因進行連接和同源性分析，用CLUSTALx1.83軟件和Mega6.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，參考序列從GenBank中下載，分別來自韓國、美國、日本、加拿大及中國2004—2014年度的代表毒株，共62株。臨床癥狀和大體病變現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，該豬場仔豬、育肥豬和母豬的發(fā)病率分別為100%、91.0%和7.2%，育肥豬和母豬未出現(xiàn)死亡，但仔豬的死亡率為20.16%，有的整窩仔豬全部死亡。對送檢的7頭病死仔豬進行剖檢，主要可見腸道腫脹、出血、充血、變薄，內(nèi)容物為黃色、棕色或乳白色水樣物，有的胃內(nèi)出現(xiàn)未吸收的凝乳塊，其他臟器病變不明顯。組織病理學(xué)變化觀察制備的小腸病理學(xué)切片，可發(fā)現(xiàn)腸壁變薄，腸絨毛邊緣不整齊，腸絨毛皺縮、腸絨毛中的柱狀細(xì)胞明顯變少，部分腸絨毛中可見紅細(xì)胞浸潤，表明存在出血；腸1)。RT-PCR7PEDVRT-PCR412bp2PEDV。SRNAS1、S2、S33S3331.9、1.71.5kbS將所得的兩株P(guān)EDV分別命名為SD01/2014和SD02/2014，并將其擴增的S1、S2、S33DNAStarS1、S2、S33段序列拼接成一段完整的SSD01/2014SD02/201441491383個氨基酸。將這兩個SGenBankPEDVSSD02/2014CV77792.3%～92.4%，與DR1392.283P-596.6%～98.6%，與2014年美國OhioVBS1毒株的同源性也達(dá)到了97.5%，這表明本試驗檢測的PEDV流行毒株是目前正在流行的PEDV野毒株。CV777、DR13、KPEDV-983P-5SD02/2014CV77755—564135—1361N)；兩個缺失位點，分別發(fā)生在CV777157—158NI1192(T)4)。前3PEDV4SD01/2014SD02/2014的變異區(qū)域主要分布在S1-400(671-250(54401—1383較少(只有38個氨基酸變異)。系統(tǒng)進化樹結(jié)果見圖5。由圖5可知，PEDV毒株可分為兩個大的分支G1和G2，其中G1群所含病毒數(shù)量較少，以疫苗株為主，主要包括CV777、DR13、83P-5、KPEDV-9等疫苗株，中國部分毒株如JS-2004、DX等，韓國部分毒株NJ，日本MKSK-030G2PEDVG2.12011—2013鑒定的毒株，G2.2則以中國、美國、韓國、加拿大等國近年來流行的毒株為主，SD01/2014SD02/2014PEDV與年代之間呈現(xiàn)相關(guān)性。腹瀉病是豬的常見病之一，多種病因均可誘發(fā)。臨床上豬流行性腹瀉引起的腹瀉又難以與豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒等引起的腹瀉區(qū)別，因此，豬流行性腹瀉的確診必須依靠實驗室診斷。2010年底起，中國一些省份的豬群中相繼暴發(fā)腹瀉疫情，表現(xiàn)水樣腹瀉，并伴發(fā)嘔吐，造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失。一些學(xué)者先后對這些發(fā)生腹瀉的樣品進行了包括PEDV在內(nèi)的多種病原檢測，如董彥鵬等[9]用RT-PCR1047153PEDV57.52[1037186PEDV59.1%，TGEV5.4%；Gao[11]曾對北京、河北和浙江等豬場288PEDV92.7%。從這些檢測結(jié)果可PEDV50%，這PEDV7PEDV由于PEDV可通過糞便、墊料、飼料傳播[12]，甚至通過空氣進行傳播，因此，一旦豬場有豬發(fā)生感染發(fā)病，則整個豬場往往都受其所累，但不同日齡的豬感染PEDV以后，其致死率明顯不同。曾報道[13]，該豬場仔豬存欄2089頭，斷奶前仔豬800頭，幾乎全部發(fā)生腹瀉，致死率平均為20.16%，3日齡以內(nèi)的仔豬感染后死亡率更是達(dá)到了100%，但育肥豬和母豬感染后，呈一過性，這一結(jié)果說明該毒株的致病性與仔豬的日齡密切相關(guān)，日齡越小，致死率越高，危害性越大。因此，如何防止仔豬發(fā)生腹瀉是防控腹瀉的關(guān)鍵。豬流行性腹瀉引發(fā)的病變與豬傳染性胃腸炎病毒等病原引起的病變非常類似，但豬流行性腹瀉的病變部位主要是腸道，其他組織病變較少，豬傳染性胃腸炎病毒引起的腹瀉病變部位主要是胃和小腸，而且發(fā)病豬在一般10日齡以上[14]。因此，臨床上根據(jù)這些病變特征也可以初步做出診斷。PEDVSPEDV(S1)和錨定區(qū)(S2S1PEDVSD02/2014毒株SCV77755—564GENQ135—1361N157—158Gao[11]和陳慧娟等[15]的分析類似，他們認(rèn)為PEDV1G23G133G1G2G1CV777、DR13、83P-5、KPEDV-9NK、JS、AS01、AS03JLGZL、SK-0303PEDV2013—2014PEDV一進化分支，進一步證實了