四肽化合物CMS030抗移植排斥作用的實驗研究

四肽化合物CMS030抗移植排斥作用的實驗研究【內容摘要】目的：cms030是從脾臟提取的四肽化合物，本研究觀察cms030對小鼠皮膚和心肌移植排擠反應的影響。方法：通過體外t淋巴細胞轉化實驗和混合淋巴細胞反應〔mlr〕實驗，觀察cms030在體外的免疫抑制造用，建立小鼠皮膚移植和心肌移植模型，觀察cms030對小鼠同種移植物存活時間的影響，觀察cms030對移植受體小鼠t淋巴細胞轉化和脾細胞分泌il2的影響。結果：cms030在體外能夠抑制t淋巴細胞轉化和mlr，在體內能夠明顯延長小鼠皮膚移植物和心肌移植物存活時間，抑制皮膚移植受體小鼠t淋巴細胞轉化能力和脾細胞分泌il2水平。結論：cms030通過抑制t淋巴細胞分泌il2，抑制t淋巴細胞功能，有效拮抗移植排擠反應?！颈疚年P鍵詞語】cms030皮膚移植心肌移植il2studyonthesuppressiveeffectsofcms030tetrameronallograftrejectioninmicezhaolan，lurong，wangsong，fuzheng，liqiuli，wangli，ljunqiang，marui，xuqiong，yaozhi.departmentofimmunology,tianjinmedicaluniversity,tianjin300070，china［abstract］objective:toinvestigatetheeffectsofcms030onskinandcardiacallograftrejectionins:theeffectsofcms030invitrowerestudiedbyconainducedtcellproliferationandmixedlymphocytereaction(mlr).thetailskingraftsofbalb/cmicewereplacedinwoundbedonthebackofc57bl/6mice,andthecardiacallograftsofnewbornc57bl/6miceweretransplantedintotheposteriorofbalb/ceffectsofcms030onthesurvivaltimeofthegraftswereobserved.conainducedlymphocyteproliferationandtheil2ofthemiceweres:theinhibitioneffectsofcms030ontcellsweredisplayedinvitroandthesurvivaltimeofgraftswassignificantlyprolongedbycms030invivo.conainducedlymphocyteproliferationandtheil2secretionofthemicewerebothreducedbysion:cms030caninhibitil2secretionoftlymphocytes,andsuppressallograftrejectionefficiently.［keywords］cms030；skintransplantation；cardiactransplantation；il2免疫抑制劑已經廣泛用于器官移植排擠的治療，迄今仍然是臨床預防和治療排擠反應的重要方法。然而，當前使用的免疫抑制劑還遠沒有到達高效和安全的要求，它們會降低患者的全身免疫功能，藥物的毒副作用也造成臨床用藥的極大局限，人們仍在尋找理想的免疫抑制劑。脾臟是機體的最大免疫器官，也是最活潑踴躍的免疫器官之一，含有豐富的細胞基本營養(yǎng)成分及細胞因子，十分是促進細胞代謝的能量中間體，如核酸、多肽類物質及寡核苷肽。國內外學者先后從動物脾臟中提取出了具有免疫活性的多肽，如imencap和spleenp.m.g等脾臟提取物，用于調節(jié)免疫和腫瘤的輔助治療［1，2］。cms030是脾臟提取的小分子四肽類化合物，由苯丙氨酰、谷氨酰、谷氨酰、甲硫氨酸構成。本研究討論cms030對淋巴細胞免疫功能的影響以及對同種移植排擠反應的影響。1材料與方法1.1實驗動物及體內實驗分組c57bl/6j〔h2b〕小鼠和balb/c〔h2d〕小鼠，5周齡，雌雄各半，科學院動物中心提供；c57bl/6j新生乳鼠，本教研室繁衍。皮膚移植和心肌移植受體小鼠各隨機分為3組：cms030劑量ⅰ組〔10μg/〔kg·d〕〕、cms030劑量ⅱ組〔2μg/〔kg·d〕〕、生理鹽水組〔0.5ml/天〕，藥物腹腔打針，每日1次，連續(xù)給藥5日后進行移植手術，術后連續(xù)給藥20日。1.2重要試劑cms030由深圳康哲藥業(yè)提供；胎牛血清〔fbs〕、rpmi1640為美國hyclone公司產品；hanks’液為美國gibco公司產品；刀豆蛋白〔cona〕、四甲基偶氮唑鹽〔mtt〕為美國sigma公司產品；絲裂霉素〔mit〕為浙江海正藥業(yè)股份生產；硫化鈉由天津市北聯精細化工生產；il2檢測elisa試劑盒為rdsystemsinc產品。1.3體外t淋巴細胞轉化實驗制備balb/c小鼠脾細胞懸液，10%fbs的rpmi1640調整細胞濃度為4×106ml-1，在96孔細胞培養(yǎng)板中每孔參加100μl。陽性對照組參加100μlcona〔終濃度為5μg/ml〕，藥物組參加100μlcms030〔終濃度分別為40、8、1.6和0.32μg/ml〕，陰性對照組參加100μlrpmi1640。每孔總體積為200μl，設6個平行孔。96孔板置于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中孵育72小時后，mtt法檢測吸光度〔od〕，測定波長570nm，參考波長630nm。1.4體外混合淋巴細胞反應〔mlr〕實驗制備balb/c小鼠脾細胞懸液，10%fbs的rpmi1640調整細胞濃度為8×106ml-1，作為反應細胞。制備c57bl/6j小鼠脾細胞懸液，參加mit〔終濃度為25μg/ml〕孵育45分鐘，洗滌后用10%fbs的rpmi1640調整細胞濃度為8×106ml-1，作為刺激細胞。96孔板中，藥物組和陽性對照組參加反應細胞和刺激細胞各100μl，藥物組中參加20μlcms030〔濃度分別為40、8、1.6和0.32μg/ml〕，陽性對照組中參加20μlrpmi1640，陰性對照組中只參加200μl刺激細胞和20μlrpmi1640。每孔總體積220μl，設6個平行孔。96孔板置于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中孵育5日，mtt法檢測od570值。1.5小鼠心肌移植實驗取balb/c受體小鼠，在耳廓背側中線下1/3處做一個3mm橫切口，從切口向耳尖方向鈍性分離皮下組織，制成4mm深的囊腔作為植床。取出新生c57bl/6j乳鼠心臟，置hanks’液中排空心腔內余血，植入植床內，輕壓囊腔上方的皮膚，排盡空氣，使心肌與四周皮膚嚴密接觸。術后第6日開始，用心電圖儀逐日檢測移植心臟的心電圖，連續(xù)3日無心電定為手術失敗，不計入統(tǒng)計，心電消失定位排擠終點，記錄移植物生存時間［3］。1.6小鼠皮膚移植實驗將c57bl/6j受體小鼠背部用8%硫化鈉溶液脫毛，次日脫毛部位消毒后剪去1cm×1cm的皮片，創(chuàng)面經壓迫止血后作為植床。取同性別balb/c小鼠尾部皮膚作為移植物平鋪于植床，用創(chuàng)可貼和醫(yī)用膠布通過胸腹部環(huán)繞包扎，使皮片和植床嚴密接觸。術后第8日拆除包扎，逐日觀察移植物顏色、硬度、結痂和脫落情況，以皮片變黑變硬，結痂脫落定為排擠終點，記錄移植物生存時間［4］。1.7皮膚移植受體小鼠t淋巴細胞增殖實驗皮膚移植受體小鼠于給藥結束后次日，無菌分離脾臟，分別制成脾細胞懸液，調整細胞濃度為4×106ml-1，96孔板中每孔參加100μl，cona刺激組參加100μlcona〔終濃度為5μg/ml〕，對照組參加100μlrpmi1640。每孔總體積200μl，設4個平行孔。96孔板置37℃、5%co2培養(yǎng)箱中孵育72小時，mtt法檢測od570值。刺激指數〔si〕＝cona刺激組od值均數對照組od值均數。1.8皮膚移植受體小鼠脾細胞分泌il2實驗取皮膚移植小鼠脾細胞懸液，調整細胞濃度為2×106ml-1，24孔板中每孔參加1.5ml，參加cona〔終濃度為10μg/ml〕。孵育48小時離心后采集上清，elisa試劑盒檢測il2濃度［5］。1.9統(tǒng)計方法數據以x±s表示，采取kaplanmeier生存分析統(tǒng)計移植物生存時間，采取onewayanova中的studentnewmankeuls〔snk〕進行多組間數據比較。p0.05確以為有統(tǒng)計學意義。2結果2.1cms030體外對t淋巴細胞轉化功能的影響淋巴細胞轉化實驗是體外檢測藥物對淋巴細胞影響的常見方法，cona能夠特異性刺激t淋巴細胞構成淋巴母細胞而促進增殖，mtt法能夠檢測淋巴細胞的增殖水平。cms030藥物濃度為0.32～40μg/ml時，在體外能夠明顯抑制cona誘導的t淋巴細胞轉化，與陰性對照組比較，p0.01，見圖1。2.2cms030體外對mlr的影響mlr是模仿真實體內細胞免疫反應的一種實驗方法，可用于評價機體t細胞對組織相容性抗原的特異性免疫應答功能，提供器官移植的體外根據［6］。cms030濃度為1.6～40μg/ml時，在體外能夠抑制小鼠混合淋巴細胞反應，與陰性對照組比較，p0.01，見圖2。2.3cms030對小鼠心肌移植物生存時間的影響balb/c〔h2d〕和c57bl/6j〔h2b〕是遺傳背景差別較大的兩個近交系小鼠，在移植排擠反應的研究中，常用作受體和供體。小鼠尾背皮膚移植模型和耳后心肌移植模型是兩個經典的移植免疫動物模型，其特點是方法簡便、易操作，能夠較直觀地觀察和檢測排擠反應，常用于同種移植排擠機制和抗排擠藥物的研究［7］。cms030給藥劑量10、2μg/〔kg·d〕能延長小鼠心肌移植物平均生存時間，與生理鹽水組比較，p0.05，見圖3。2.4cms030對小鼠皮膚移植的影響cms030給藥劑量10、2μg/〔kg·d〕時能延長小鼠皮膚移植物平均生存時間，與生理鹽水組比較，p0.01，見圖4。2.5cms030對皮膚移植受體小鼠t淋巴細胞增殖的影響細胞免疫應答在同種移植排擠反應中發(fā)揮重要作用，受體t細胞直接辨別供者抗原提呈細胞外表的同種抗原，發(fā)生激活和增殖，cd4+t細胞介導的遲發(fā)型超敏反應性炎癥，cd8+t細胞特異性殺傷移植物細胞。cms030對cona刺激的t淋巴細胞增殖有一定的抑制造用，與生理鹽水組比較，p0.01，見圖5。2.6cms030對皮膚移植受體小鼠脾細胞分泌il2的影響cona能夠誘導t細胞分泌il2，il2是t細胞的重要活化因子，重要由t細胞分泌，能夠反映細胞免疫應答水平［8］。cms030能夠降低cona誘導的小鼠脾細胞分泌il2的水平，與生理鹽水組比較，p0.01，見圖6。3討論器官移植已成為治療終末期疾病的重要手段之一，近30年來，器官移植的發(fā)展已獲得令人矚目的成就，更為安全有效的免疫抑制劑的不斷推出及臨床應用起了主要作用，21的器官移植領域仍然是免疫抑制劑為主的時代［9］。特異性針對t細胞趨化、活化、分化等各個環(huán)節(jié)的免疫抑制劑是抗移植排擠藥物研究的主要發(fā)展方向。多肽類藥物能夠特異性模仿或阻斷蛋白質間互相作用，能夠發(fā)揮特異性的免疫抑制造用，如小肽類藥物fuzeon能夠抑制病毒與淋巴細胞的融合，已經用于治療hiv。二肽化合物mdp是分枝桿菌細胞壁中具有免疫活性的最小構造單位，能激活單核巨噬細胞、nk細胞，發(fā)揮殺傷腫瘤細胞的作用［10，11］。cms030在體外能顯著抑制cona誘導的t淋巴細胞轉化，提示cms030能夠抑制t淋巴細胞的非特異性增殖，是一種具有t淋巴細胞抑制造用的免疫活性藥物。cms030在體外mlr實驗中顯示較強的抑制t淋巴細胞增殖的作用，表示清楚cms030能夠抑制特異性的t淋巴細胞功能，降低特異性抗原決定簇對t淋巴細胞的活化。體外實驗提示，它可能對t細胞免疫功能和同種移植排擠反應有一定的抑制造用。在小鼠心肌移植和皮膚移植動物模型中，cms030能夠降低移植排擠反應對移植物的損害，延長小鼠皮膚移植物和心肌細胞的存活時間，表示清楚cms030在體內能夠發(fā)揮抗移植排擠的作用。同種移植排擠發(fā)生機制以細胞免疫為主，移植物出現大量單個核細胞浸潤〔重要為t淋巴細胞〕，cd4+t細胞分泌il2等細胞因子，促進cd4+t細胞和cd8+t細胞增殖活化，cd4+t細胞介導超敏反應性炎癥，cd8+t細胞發(fā)揮細胞毒性，使移植物遭到排擠。本研究進一步觀察cms030對皮膚移植受體小鼠t淋巴細胞功能的影響，討論cms030在移植排擠反應中對機體細胞免疫水平的影響。cms030能抑制受體鼠t淋巴細胞轉化，表示清楚cms030能夠使t淋巴細胞增殖功能下降，進而抑制機體細胞免疫應答能力，減輕移植排擠對移植物的損傷。移植排擠細胞免疫應答經過中，il2是啟動移植排擠反應的關鍵細胞因子，能夠直接反映細胞免疫應答水平，觀察體液il2水安然平靜t淋巴細胞il2誘生實驗是監(jiān)測機體排擠反應的主要指標［12］。cms030能抑制cona誘導的t淋巴細胞分泌的il2水平，表示清楚cms030能夠通過抑制il2的表達，降低t淋巴細胞成熟和活化的水平。實驗結果表示清楚，cms030能夠減少淋巴細胞分泌il2，降低機體細胞免疫功能，發(fā)揮對移植排擠反應的治療作用。在本研究經過中，cms030用藥組小鼠未發(fā)現有體重下降、行動延遲緩慢等藥物副作用的表現，而在傳統(tǒng)免疫抑制劑的臨床應用中，重要阻礙之一是藥物的毒副作用，如csa存在肝腎毒性，fk506具有腎毒性和神經毒性等［13，14］。因而，cms030是一種有前途的抗移植排擠新藥，有望替代或部分替代正在使用的免疫抑制劑?！疽韵聻閰⒖嘉墨I】1norenbergjp,krenningbj,koningsiretal.213bi［dota0,tyr3］octreotidepeptidereceptorradionuclidetherapyofpancreatictumorsinapreclinicalanimalmodel［j］.clincancerres,2006;12(3pt1):897903.2gronebergda,rabekf,fischera.novelconceptsofneuropeptidebaseddrugtherapy:vasoactiveintestinalpolypeptideanditsreceptors［j］.eurjpharmacol,2006;533(13):182194.3vakevaa,laurilap,meris.regulationofcomplementmembraneattackcomplexformationinmyocardialinfarction［j］.amjpathol,1993;143(1):6575.4jiankuom,xingbingw,baojunhetal.peptidenucleicacidantisenseprolongsskinallograftsurvivalbymeansofblockadeofcxcr3expressiondirectingtcellsintograft［j］.jimmunol,2003;170(3):15561565.5mayumih,shint,himenoketal.druginducedtolerancetoallograftsinmice〔ii〕.tolerancetotumorallograftsoflargedosesassociatedwithrejectionofskinallograftsandtumorallograftsofsmalldoses［j］.immunobiology,1985;169(2):147161.6馬濤,胡軍,蔡振杰etal.體外混合淋巴細胞培養(yǎng)對心臟移植急性排擠反應的監(jiān)測作用［j］.第四軍醫(yī)大學學報,2006;27(1):2729.7duquesnoyrj,李幼平.移植免疫生物學［m］.北京：科學出版社,2000:85102.8aramburuj,yaffemb,lopezrodriguezcetal.affinitydrivenpeptideselectionofannfatinhibitormoreselectivethancyclosporina［j］.science,1999;285(5436):21292133.9magarik,miyatas,ohkuboyetal.calcineurininhibitorsexertrapidreductionofinflammatorypaininratadjuvantinducedarthritis［j］.brjpharmacol,2003;139(5):927934.10lius,luh,niujetal.differentfromthehivfusioninhibitorc34,theantihivdrugfuzeon(t20)inhibitshiv1entrybytarget