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文檔簡介
大腸菌群的食品衛(wèi)生學(xué)意義作為糞便污染食品的指標(biāo)菌,MPN值愈低則說明食品受糞便污染程度及對人體健康危害程度愈低作為腸道致病菌污染食品的指針,大腸菌群數(shù)量越多則腸道致病菌存在的可能性就越高,但兩者之間并不總是呈平行關(guān)系要求食品中大腸菌群完全不存在是不可能的,重要的是其污染程度即菌量食品中大腸桿菌的檢驗1982年美國食物中毒;我國:1997年在一定范圍內(nèi)開展監(jiān)測,已陸續(xù)有十余個省份在市售食品、進口食品、腹瀉病患者、家畜家禽等分離到該菌,并在1999年我國蘇皖毗鄰地區(qū)突然暴發(fā)了腸出血性大腸桿菌O157:H7,大腸菌群的食品衛(wèi)生學(xué)意義作為糞便污染食品的指標(biāo)菌,MPN值愈1GB4789.3-2010大腸菌群測定定義:Coliforms,一群在36℃培養(yǎng)48h可發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏染色陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源自人畜糞便,作為糞便污染指標(biāo)評價食品的衛(wèi)生狀況,推斷食品中腸道致病菌污染的可能。食品中大腸桿菌的檢驗GB4789.3-2010大腸菌群測定定義:Colifo2ETEC
EIEC
陰溝腸桿菌EHEC
大腸菌群耐熱大腸菌群(糞大腸菌群)大腸桿菌產(chǎn)氣克雷白氏菌大腸埃希氏菌檸檬酸桿菌O157:H7大腸桿菌是人和溫血動物腸道內(nèi)普遍存在的細菌,是糞便中的主要菌種。一般生活在人大腸中并不致病,但它侵入人體一些部位時,可引起感染。大腸菌群并非細菌學(xué)分類命名,而是衛(wèi)生細菌領(lǐng)域的用語,它不代表某一個或某一屬細菌,而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細菌,這些細菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致。一般認為可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。
總大腸菌群系指一群在37℃培養(yǎng)24小時能發(fā)酵乳酸、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。耐熱大腸菌群即糞大腸菌群,作為一種衛(wèi)生指標(biāo)菌,耐熱大腸菌群中很可能含有糞源微生物,因此耐熱大腸菌群的存在表明可能受到了糞便污染,可能存在大腸桿菌。但是,耐熱大腸菌群的存在并不代表對人有什么直接的危害。致病性大腸桿菌能引起食物中毒。致病性菌株能侵入腸粘膜上皮細胞,具有痢疾桿菌樣致病力。腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸毒素性大腸桿菌(ETEC)和腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)等。O157:H7(EHEC)腸出血性大腸桿菌,感染性腹瀉是近年來新發(fā)現(xiàn)的危害嚴(yán)重的腸道傳染病,已逐漸成為威脅人群健康的重要公共衛(wèi)生問題。大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌的從屬關(guān)系ETECEIEC陰溝腸桿菌EHEC大腸菌群耐熱大腸菌群3食品中大腸桿菌的檢驗概述生物學(xué)特性
1)形態(tài)與染色2)培養(yǎng)特性3)生化特性4)抵抗力
5)致病性1)形態(tài)與染色G-、有鞭毛、無芽孢或有莢膜,兩端鈍圓短桿菌。大小為(1.1-1.5)μmX(2.0-6.0)μm(活菌)或(0.4-0.7)μmX(1.0-3.0)μm
(染色菌),絕大多數(shù)菌株有周身鞭毛,能運動,周身還有菌毛,無芽孢,某些菌株具有莢膜。
食品中大腸桿菌的檢驗概述生物學(xué)特性4食品中大腸桿菌的檢驗概述2)培養(yǎng)特性在普通培養(yǎng)基上:長成2-3mm的S型小菌落;在鮮血瓊脂平板上:生長,有些菌株可見β型溶血環(huán)**;在麥康凱培養(yǎng)基上:因發(fā)酵乳糖而產(chǎn)生有色菌落在SS培養(yǎng)基上:大腸桿菌一般不能生長,少數(shù)生長的菌落也因發(fā)酵乳糖而呈紅色;在伊紅美藍瓊脂平板上:生長成紫黑色帶有金屬光澤的菌落;在液體培養(yǎng)基中:呈均勻混濁生長,形成莢膜,管底有粘性沉淀培養(yǎng)物呈特殊的臭味。食品中大腸桿菌的檢驗概述2)培養(yǎng)特性5食品中大腸桿菌的檢驗概述3)生化特性
大腸埃希氏菌發(fā)酵多種糖:葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、山梨醇和丙三醇等;大部分菌株可迅速發(fā)酵乳糖,各菌株對蔗糖、水楊苷、衛(wèi)矛醇及棉子糖的發(fā)酵力不一致,吲哚+,MR+,V-P-,枸櫞酸胺鹽-(IMVC++--),尿素酶-,硫化氫-,氰化鉀培養(yǎng)基不中生長,丙二酸鹽利用-,可使谷氨酸和賴氨酸脫羧基,苯丙氨酸-,氧化酶-,接觸媒+。食品中大腸桿菌的檢驗概述3)生化特性6食品中大腸桿菌的檢驗3致病性(1)致病因素:①侵襲力②內(nèi)毒素③腸毒素①侵襲力大腸桿菌具有K抗原和菌毛:K抗原:有抗吞噬作用,有抵抗抗體和補體的作用菌毛:能幫助細菌粘附于粘膜表面。有侵襲力的菌株可以侵犯腸道表皮層引起炎癥。②內(nèi)毒素大腸桿菌細胞壁具有內(nèi)毒素的活性:其脂類A是毒性部位
特異多糖有助于細菌抵抗宿主的防御機制。概述食品中大腸桿菌的檢驗概述7食品中大腸桿菌的檢驗概述③腸毒素大腸埃希氏菌腸毒素有兩種:
a.不耐熱腸毒素(LT):蛋白質(zhì),加熱65℃經(jīng)30min即被破壞,促進腸粘膜細胞大量分泌腸液,引起腹瀉;
生食b.耐熱腸毒素(ST),ST無免疫性,耐熱,100℃經(jīng)10-20min不被破壞,它也可引起腹瀉。食品中大腸桿菌的檢驗概述③腸毒素8食品中大腸桿菌的檢驗概述(2)所致疾病①腸外感染①腸外感染泌尿系統(tǒng)感染敗血癥膽囊炎肺炎新生兒或嬰兒腦膜炎等。
食品中大腸桿菌的檢驗概述(2)所致疾病9概述②腹瀉4種大腸桿菌都可引起腹瀉:
產(chǎn)毒素大腸桿菌--是嬰幼兒及旅游者腹瀉的主要原因;
致病性大腸桿菌--是嬰兒腹瀉的主要原因,嚴(yán)重者可致死;
侵襲性大腸桿菌--主要引起較大兒童和成年人腹瀉,有時甚至可引起爆發(fā)流行;
出血性大腸埃希氏菌O157--引起的主要臨床癥狀是腹瀉(重者水樣腹瀉)、腹痛、嘔吐,是老幼患者死亡的主要原因。食品中大腸桿菌的檢驗概述②腹瀉食品中大腸桿菌的檢驗10食品中大腸桿菌的檢驗第一法:MPN法第二法:VRBA-MUG平板計數(shù)法第三法:Petrifilm測試片法食品中大腸桿菌的檢驗第一法:MPN法11促進腸粘膜細胞大量分泌腸液,引起腹瀉;2、靛基質(zhì)試驗(吲哚試驗)選擇2~3個適宜稀釋度的樣液,選擇2~3個適宜稀釋度的樣液,要求食品中大腸菌群完全不存在是不可能的,重要的是其污染程度即菌量大腸桿菌具有K抗原和菌毛:大腸埃希氏菌發(fā)酵多種糖:葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、山梨醇和丙三醇等;蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗②注模消毒后一定要用無菌水進行沖洗,避免注模二次污染。*2001年夏天,在大腸桿菌O157:H7爆發(fā)殃及35人之后,ConAgraFoods立刻召回了懷疑受到污染的1900萬磅碎牛肉。食品中大腸桿菌的檢驗熒光法快速測定水中糞大腸菌群[J/OL].由希華,徐標(biāo),李恒慶,宗雪梅.②一旦產(chǎn)品中檢出大腸菌群,要對生產(chǎn)設(shè)備和管道進行徹底消毒。原理:由于96%的大腸桿菌都具有葡萄糖醛苷酸酶,能分解β-D葡萄糖醛苷,而使4-甲基傘形酮游離出來,在366nm紫外光下產(chǎn)生藍色熒光。二、常見生理生化試驗我國:1997年在一定范圍內(nèi)開展監(jiān)測,已陸續(xù)有十余個省份在市售食品、進口食品、腹瀉病患者、家畜家禽等分離到該菌,并在1999年我國蘇皖毗鄰地區(qū)突然暴發(fā)了腸出血性大腸桿菌O157:H7,總大腸菌群系指一群在37℃培養(yǎng)24小時能發(fā)酵乳酸、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。①滅菌一定要徹底,一般溫度在90℃以上,滅菌15min以上,就能使產(chǎn)品達到無菌狀態(tài)。接種PetrifilmTM大腸桿菌測試紙片大腸菌群計數(shù)檢驗流程0將產(chǎn)氣的試管內(nèi)樣品接種到BGLB肉湯LST不產(chǎn)氣(-)小導(dǎo)管里無氣泡LST產(chǎn)氣(+)食品中大腸桿菌的檢驗MPN法促進腸粘膜細胞大量分泌腸液,引起腹瀉;大腸菌群計數(shù)檢驗流程012第二法VRBA平板計數(shù)法選擇15~150平板計數(shù)典型和可疑菌落36℃±1℃18h~24h挑選10個菌落接種到BGLB典型菌落為紫紅色周圍有紅色膽鹽沉淀環(huán),0.5mm食品中大腸桿菌的檢驗MPN法第二法VRBA平板計數(shù)法選擇15~150平板計數(shù)典型和可疑13食品中大腸桿菌的檢驗MPN法大腸桿菌計數(shù)MPN法檢驗程序檢樣25g(ml)+225ml稀釋液,均質(zhì)10倍稀釋選擇3個連續(xù)稀釋度樣品勻液接種LST48±2h36℃±1℃不產(chǎn)氣產(chǎn)氣EC肉湯45℃±0.2℃24±2h不產(chǎn)氣產(chǎn)氣EMB瓊脂平板36℃±1℃24±2h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)生化試驗,革蘭染色查MPN表,報告食品中大腸桿菌的檢驗MPN法大腸桿菌計數(shù)MPN法檢驗程序檢14如何報告結(jié)果?根據(jù)經(jīng)確證后的對應(yīng)濃度陽性管數(shù)查MPN表MPN:最可能數(shù),基于泊松分布的一種間接計數(shù)方法陽性管數(shù)MPN95%可信限0.100.010.001下限上限000<3.0-9.50013.00.159.61003.60.1718333>1100420-食品中大腸桿菌的檢驗MPN法如何報告結(jié)果?根據(jù)經(jīng)確證后的對應(yīng)濃度陽性管數(shù)查MPN表陽性管15食品中大腸桿菌的檢驗美國食品藥品管理局(FDA):BacteriologicalAnalyticalManual,2002,Chapter4:EnumerationofEscherichiacoliandtheColiformBacteria原理:由于96%的大腸桿菌都具有葡萄糖醛苷酸酶,能分解β-D葡萄糖醛苷,而使4-甲基傘形酮游離出來,在366nm紫外光下產(chǎn)生藍色熒光。觀察到藍色熒光即可認為是大腸桿菌陽性。4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷(MUG)對大腸桿菌的生長繁殖既沒有抑制作用也沒有促進作用,對菌落形態(tài)也沒有影響。VRBA-MUG平板計數(shù)法第二法VRBA-MUG平板計數(shù)法食品中大腸桿菌的檢驗美國食品藥品管理局(FDA):Bact16食品中大腸桿菌的檢驗VRBA-MUG平板計數(shù)法VRBA-MUG平板計數(shù)法檢驗程序檢樣25g(ml)+225ml稀釋液,均質(zhì)10倍系列稀釋選擇2~3個適宜稀釋度的樣液,接種VRBA-MUG平板紫外光下,計數(shù)發(fā)熒光的菌落報告結(jié)果36℃±1℃18~24h食品中大腸桿菌的檢驗VRBA-MUG平板計數(shù)法VRBA-M17食品中大腸桿菌的檢驗由希華,徐標(biāo),李恒慶,宗雪梅.熒光法快速測定水中糞大腸菌群[J/OL].中國環(huán)境監(jiān)測VRBA-MUG平板計數(shù)法選擇不同的地表水廢水樣品進行熒光法與多管發(fā)酵法比對測試,討論方法適用性。熒光法與多管發(fā)酵法結(jié)果之間有顯著的線性相食品中大腸桿菌的檢驗由希華,徐標(biāo),李恒慶,宗雪梅.熒光法快18食品中大腸桿菌的檢驗PetrifilmTM測試片法第三法PetrifilmTM測試片法
PetrifilmTM大腸桿菌/大腸菌群測試片是一種預(yù)先制備好的培養(yǎng)基系統(tǒng),含有VRB培養(yǎng)基,冷水可溶性凝膠和葡萄糖苷酶指示劑,可增強菌落計數(shù)效果。E.coli能產(chǎn)生-葡萄糖苷酸酶與培養(yǎng)基中的指示劑反應(yīng),產(chǎn)生藍色沉淀環(huán)繞在大腸桿菌菌落周圍。表面覆蓋的膠膜,可截留發(fā)酵乳糖的大腸菌群產(chǎn)生的氣體。培養(yǎng)結(jié)束后計數(shù)藍點帶氣泡的菌落即為大腸桿菌數(shù),紅點帶氣泡和藍點帶氣泡的菌落之和為大腸菌群數(shù)。食品中大腸桿菌的檢驗PetrifilmTM測試片法第三法19食品中大腸桿菌的檢驗PetrifilmTM測試片法大腸桿菌PetrifilmTM測試片檢驗程序檢樣25g(ml)+225ml稀釋液,均質(zhì)10倍系列稀釋選擇2~3個適宜稀釋度的樣液,接種PetrifilmTM大腸桿菌測試紙片計數(shù)藍色帶氣泡菌落報告結(jié)果36℃±1℃24±2h或48±2h食品中大腸桿菌的檢驗PetrifilmTM測試片法大腸桿菌20食品中大腸桿菌的檢驗PetrifilmTM測試片法史夢雨.消毒餐飲具中大腸菌群的兩種方法比較[J].中國城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生,2018,33(12):76-77.
食品中大腸桿菌的檢驗PetrifilmTM測試片法史夢雨.21食品中大腸桿菌的檢驗PetrifilmTM測試片法食品中大腸桿菌的檢驗PetrifilmTM測試片法22典型菌落:具黑色中心有光澤或無光澤的菌落。這一事件使大腸桿菌O157:H7臭名遠揚。原理:由于96%的大腸桿菌都具有葡萄糖醛苷酸酶,能分解β-D葡萄糖醛苷,而使4-甲基傘形酮游離出來,在366nm紫外光下產(chǎn)生藍色熒光。食品中大腸桿菌的檢驗表面覆蓋的膠膜,可截留發(fā)酵乳糖的大腸菌群產(chǎn)生的氣體。第二法VRBA-MUG平板計數(shù)法①滅菌一定要徹底,一般溫度在90℃以上,滅菌15min以上,就能使產(chǎn)品達到無菌狀態(tài)。在液體培養(yǎng)基中:呈均勻混濁生長,形成莢膜,管底有粘性沉淀培養(yǎng)物呈特殊的臭味。蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗食品中大腸桿菌的檢驗大腸埃希氏菌發(fā)酵多種糖:葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、山梨醇和丙三醇等;①完善企業(yè)更衣消毒設(shè)施,獨立設(shè)置更衣間與消毒間,更衣間安裝紫外滅菌燈、工作衣架。食品中大腸桿菌的檢驗K抗原:有抗吞噬作用,有抵抗抗體和補體的作用第三法:Petrifilm測試片法在麥康凱培養(yǎng)基上:因發(fā)酵乳糖而產(chǎn)生有色菌落我國:1997年在一定范圍內(nèi)開展監(jiān)測,已陸續(xù)有十余個省份在市售食品、進口食品、腹瀉病患者、家畜家禽等分離到該菌,并在1999年我國蘇皖毗鄰地區(qū)突然暴發(fā)了腸出血性大腸桿菌O157:H7,第三法PetrifilmTM測試片法在液體培養(yǎng)基中:呈均勻混濁生長,形成莢膜,管底有粘性沉淀培養(yǎng)物呈特殊的臭味。大腸桿菌PetrifilmTM測試片檢驗程序食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制大腸菌群控制(冷凍飲品生產(chǎn)為例子)人機料法環(huán)典型菌落:具黑色中心有光澤或無光澤的菌落。食品中大腸桿菌的檢23食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“人”①完善企業(yè)更衣消毒設(shè)施,獨立設(shè)置更衣間與消毒間,更衣間安裝紫外滅菌燈、工作衣架。
②消毒間安裝洗手池、酒精噴淋器、干手器。③車間進入門口放鞋靴消毒池。④嚴(yán)格規(guī)定進入生產(chǎn)車間的人員必須清洗和消毒手,必須穿經(jīng)消毒的工作衣,更換工作鞋并在消毒池中消毒后方可進入車間。食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“人”①完善企業(yè)更衣消毒設(shè)24食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“機”①嚴(yán)格落實《生產(chǎn)設(shè)施、設(shè)備清洗消毒制度》,定期對生產(chǎn)設(shè)備及管道用CIP清洗消毒或用90℃以上的熱水消毒,預(yù)防大腸菌群的滋生和繁殖。②一旦產(chǎn)品中檢出大腸菌群,要對生產(chǎn)設(shè)備和管道進行徹底消毒。食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“機”①嚴(yán)格落實《生產(chǎn)設(shè)施25食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“料”①嚴(yán)格驗收原輔料,重點查驗大腸菌群項目,盡可能購買不含大腸菌群原輔料。②對原料產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中沒有檢驗大腸菌群的進行自檢,做到心中有數(shù)。③定期自檢生產(chǎn)用水,必要時進行殺菌處理。④包裝袋使用前進行紫外殺菌處理。食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“料”①嚴(yán)格驗收原輔料,重26食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“法”①滅菌一定要徹底,一般溫度在90℃以上,滅菌15min以上,就能使產(chǎn)品達到無菌狀態(tài)。②注模消毒后一定要用無菌水進行沖洗,避免注模二次污染。③要避免交叉污染,嚴(yán)格區(qū)分開生區(qū)和熟區(qū)。食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“法”①滅菌一定要徹底,一27食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“環(huán)”①在生產(chǎn)車間安裝足夠的紫外滅菌燈,對生產(chǎn)環(huán)境定時殺菌。②生產(chǎn)車間定時通風(fēng)除濕,防止大腸菌群的滋生和繁殖。食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“環(huán)”①在生產(chǎn)車間安裝足夠28*1993年,JackInTheBox快餐連鎖店出售未煮熟的污染漢堡引起700多人(以兒童為主)食物中毒,并造成4人死亡。這一事件使大腸桿菌O157:H7臭名遠揚。*2001年夏天,在大腸桿菌O157:H7爆發(fā)殃及35人之后,ConAgraFoods立刻召回了懷疑受到污染的1900萬磅碎牛肉。美國疾病預(yù)防和控制中心估計,美國每年因大腸桿菌O157:H7致病總?cè)藬?shù)大約為73000人,盡管上報的病例已有所下降。*1998年,佐治亞州亞特蘭大水上公園發(fā)生的大腸桿菌O157:H7大爆發(fā)使得多名兒童住院。*1996年5-8月,日本中學(xué)和幼兒園相繼發(fā)生多起大腸桿菌O157集體中毒事件,波及44個地區(qū),7萬例,死亡12人.與芽菜有關(guān)。*1993年,JackInTheBox快餐連鎖店出售未29益生菌:不致病,能合成維生素B和維生素K,生產(chǎn)大腸菌素,對機體有利;條件致病菌:在機體因內(nèi)外因素所致抵抗力下降或菌體侵入腸外組織或器官時條件下致??;致病菌:引起腸道感染的有四類:產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(enterotoxigenicE.coli,ETEC)出血性大腸埃希氏菌(enterohemorrhagicE.coli,EHEC)
腸道侵襲性大腸埃希氏菌(enteroinvasiveE.coli,EIEC)
腸道致病性大腸埃希氏菌(enteropathogenicE.coli,EPEC)帶菌的牛和豬是傳播本菌引起食物中毒最重要原因,人的帶菌亦可污染食品,引起中毒。益生菌:不致病,能合成維生素B和維生素K,生產(chǎn)大腸菌素,對30EMB瓊脂主要成分:乳糖、營養(yǎng)物質(zhì)。指示劑系統(tǒng):伊紅和美監(jiān)。原理:大腸菌群分解乳糖產(chǎn)酸,使伊紅與美藍結(jié)合而形成黑色化合物,故菌落呈黑紫色,并可產(chǎn)生金屬光澤。黑色程度與光澤產(chǎn)生情況與伊紅、美藍二者的比例有關(guān)。不發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸的細菌,在堿性環(huán)境中不能使伊紅、美藍結(jié)合,因而形成無色的菌落。部分大腸菌群的菌株在EMB上可形成紅色或粉紅色的菌落。(應(yīng)注意非典型的菌落)。典型菌落:具黑色中心有光澤或無光澤的菌落。非典型的可疑菌落:粉紅色,無黑心EMB瓊脂主要成分:乳糖、營養(yǎng)物質(zhì)。指示劑系統(tǒng):伊紅和美監(jiān)。31靛基質(zhì)試驗:甲基紅試驗:V-P試驗:檸檬酸鹽試驗:靛基質(zhì)試驗:32
4、甲基紅(MR)試驗和V-P試驗二、常見生理生化試驗
糖(醇)類代謝試驗1、MR試驗原理:一些細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸可被進一步分解為甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸而使培養(yǎng)基的PH值下降到4.5以下,加入甲基紅指示劑出現(xiàn)紅色反應(yīng)2、V-P試驗原理一些細菌分解葡萄糖為丙酮酸,進一步脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇,乙酰甲基甲醇在堿性溶液中被空氣中的氧氧化成二乙酰丁二酮,進而與培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中所含的精氨酸的胍基發(fā)生反應(yīng)生成紅色化合物。(試驗結(jié)果同MR試驗)4、甲基紅(MR)試驗和V-P試驗二、常見生理生化試驗33二、常見生理生化試驗
糖(醇)類代謝試驗V-P試驗方法:將待檢菌接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中,于35℃培養(yǎng)48h后加入甲液(6%α-萘酚酒精溶液)和乙液(40%KOH溶液),振搖。結(jié)果:在數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性;如無紅色出現(xiàn)且于35℃4h后仍如故者即為陰性。二、常見生理生化試驗糖(醇)類代謝試驗V-P試驗結(jié)果34二、常見生理生化試驗
蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗1、明膠液化試驗一些細菌可產(chǎn)生胞外酶,使明膠蛋白分解為氨基酸,而失去明膠的凝固能力。陽性陰性2、靛基質(zhì)試驗(吲哚試驗)一些細菌可以分解蛋白胨的色氨酸,產(chǎn)生靛基質(zhì),靛基質(zhì)可與對二甲氨基苯甲醛作用,生成玫瑰吲哚而成紅色。陽性對照二、常見生理生化試驗蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗1、明膠液35
1、枸櫞酸鹽利用試驗二、常見生理生化試驗
有機酸鹽和銨鹽的利用試驗一些微生物可以以銨鹽作為唯一的氮源,以檸檬酸鹽作為唯一的碳源,在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長,分解檸檬酸鹽生成碳酸鹽,使培養(yǎng)基變成堿性,酸堿指示劑變色。培養(yǎng)基中的溴麝香草酚蘭指示劑由淡綠色變?yōu)樯钏{色為陽性1、枸櫞酸鹽利用試驗二、常見生理生化試驗有機酸鹽36致病性菌株能侵入腸粘膜上皮細胞,具有痢疾桿菌樣致病力。一些細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸可被進一步分解為甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸而使培養(yǎng)基的PH值下降到4.1、枸櫞酸鹽利用試驗一些細菌可以分解蛋白胨的色氨酸,產(chǎn)生靛基質(zhì),靛基質(zhì)可與對二甲氨基苯甲醛作用,生成玫瑰吲哚而成紅色。選擇15~150平板計數(shù)典型和可疑菌落中國城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生,2018,33(12):76-77.將產(chǎn)氣的試管內(nèi)樣品接種到BGLB肉湯接種VRBA-MUG平板VRBA-MUG平板計數(shù)法檢驗程序特異多糖有助于細菌抵抗宿主的防御機制。食品中大腸桿菌的檢驗菌毛:能幫助細菌粘附于粘膜表面。第三法:Petrifilm測試片法我國:1997年在一定范圍內(nèi)開展監(jiān)測,已陸續(xù)有十余個省份在市售食品、進口食品、腹瀉病患者、家畜家禽等分離到該菌,并在1999年我國蘇皖毗鄰地區(qū)突然暴發(fā)了腸出血性大腸桿菌O157:H7,接種PetrifilmTM大腸桿菌測試紙片④嚴(yán)格規(guī)定進入生產(chǎn)車間的人員必須清洗和消毒手,必須穿經(jīng)消毒的工作衣,更換工作鞋并在消毒池中消毒后方可進入車間。腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸毒素性大腸桿菌(ETEC)和腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)等。由希華,徐標(biāo),李恒慶,宗雪梅.大腸桿菌具有K抗原和菌毛:選擇3個連續(xù)稀釋度樣品勻液接種LST大腸菌群計數(shù)檢驗流程0將產(chǎn)氣的試管內(nèi)樣品接種到BGLB肉湯LST不產(chǎn)氣(-)小導(dǎo)管里無氣泡LST產(chǎn)氣(+)食品中大腸桿菌的檢驗MPN法致病性菌株能侵入腸粘膜上皮細胞,具有痢疾桿菌樣致病力。大腸菌37食品中大腸桿菌的檢驗MPN法大腸桿菌計數(shù)MPN法檢驗程序檢樣25g(ml)+225ml稀釋液,均質(zhì)10倍稀釋選擇3個連續(xù)稀釋度樣品勻液接種LST48±2h36℃±1℃不產(chǎn)氣產(chǎn)氣EC肉湯45℃±0.2℃24±2h不產(chǎn)氣產(chǎn)氣EMB瓊脂平板36℃±1℃24±2h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)生化試驗,革蘭染色查MPN表,報告食品中大腸桿菌的檢驗MPN法大腸桿菌計數(shù)MPN法檢驗程序檢38食品中大腸桿菌的檢驗VRBA-MUG平板計數(shù)法VRBA-MUG平板計數(shù)法檢驗程序檢樣25g(ml)+225ml稀釋液,均質(zhì)10倍系列稀釋選擇2~3個適宜稀釋度的樣液,接種VRBA-MUG平板紫外光下,計數(shù)發(fā)熒光的菌落報告結(jié)果36℃±1℃18~24h食品中大腸桿菌的檢驗VRBA-MUG平板計數(shù)法VRBA-M39食品中大腸桿菌的檢驗由希華,徐標(biāo),李恒慶,宗雪梅.熒光法快速測定水中糞大腸菌群[J/OL].中國環(huán)境監(jiān)測VRBA-MUG平板計數(shù)法選擇不同的地表水廢水樣品進行熒光法與多管發(fā)酵法比對測試,討論方法適用性。熒光法與多管發(fā)酵法結(jié)果之間有顯著的線性相食品中大腸桿菌的檢驗由希華,徐標(biāo),李恒慶,宗雪梅.熒光法快40食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“人”①完善企業(yè)更衣消毒設(shè)施,獨立設(shè)置更衣間與消毒間,更衣間安裝紫外滅菌燈、工作衣架。
②消毒間安裝洗手池、酒精噴淋器、干手器。③車間進入門口放鞋靴消毒池。④嚴(yán)格規(guī)定進入生產(chǎn)車間的人員必須清洗和消毒手,必須穿經(jīng)消毒的工作衣,更換工作鞋并在消毒池中消毒后方可進入車間。食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“人”①完善企業(yè)更衣消毒設(shè)41大腸菌群控制(冷凍飲品生產(chǎn)為例子)24±2h或48±2hK抗原:有抗吞噬作用,有抵抗抗體和補體的作用要求食品中大腸菌群完全不存在是不可能的,重要的是其污染程度即菌量PetrifilmTM測試片法食品中大腸桿菌的檢驗食品中大腸桿菌的檢驗蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗我國:1997年在一定范圍內(nèi)開展監(jiān)測,已陸續(xù)有十余個省份在市售食品、進口食品、腹瀉病患者、家畜家禽等分離到該菌,并在1999年我國蘇皖毗鄰地區(qū)突然暴發(fā)了腸出血性大腸桿菌O157:H7,食品中大腸桿菌的檢驗④嚴(yán)格規(guī)定進入生產(chǎn)車間的人員必須清洗和消毒手,必須穿經(jīng)消毒的工作衣,更換工作鞋并在消毒池中消毒后方可進入車間。食品中大腸桿菌的檢驗第二法VRBA平板計數(shù)法*2001年夏天,在大腸桿菌O157:H7爆發(fā)殃及35人之后,ConAgraFoods立刻召回了懷疑受到污染的1900萬磅碎牛肉。①完善企業(yè)更衣消毒設(shè)施,獨立設(shè)置更衣間與消毒間,更衣間安裝紫外滅菌燈、工作衣架。③要避免交叉污染,嚴(yán)格區(qū)分開生區(qū)和熟區(qū)。一些細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸可被進一步分解為甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸而使培養(yǎng)基的PH值下降到4.大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌的從屬關(guān)系挑選10個菌落接種到BGLB蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗原理:由于96%的大腸桿菌都具有葡萄糖醛苷酸酶,能分解β-D葡萄糖醛苷,而使4-甲基傘形酮游離出來,在366nm紫外光下產(chǎn)生藍色熒光。第三法:Petrifilm測試片法④嚴(yán)格規(guī)定進入生產(chǎn)車間的人員必須清洗和消毒手,必須穿經(jīng)消毒的工作衣,更換工作鞋并在消毒池中消毒后方可進入車間。VRBA-MUG平板計數(shù)法檢驗程序1982年美國食物中毒;(試驗結(jié)果同MR試驗)食品中大腸桿菌的檢驗一般生活在人大腸中并不致病,但它侵入人體一些部位時,可引起感染。食品中大腸桿菌的檢驗菌毛:能幫助細菌粘附于粘膜表面。選擇2~3個適宜稀釋度的樣液,產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(enterotoxigenicE.一些細菌分解葡萄糖為丙酮酸,進一步脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇,乙酰甲基甲醇在堿性溶液中被空氣中的氧氧化成二乙酰丁二酮,進而與培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中所含的精氨酸的胍基發(fā)生反應(yīng)生成紅色化合物。④嚴(yán)格規(guī)定進入生產(chǎn)車間的人員必須清洗和消毒手,必須穿經(jīng)消毒的工作衣,更換工作鞋并在消毒池中消毒后方可進入車間。食品中大腸桿菌的檢驗3-2010大腸菌群測定熒光法與多管發(fā)酵法結(jié)果之間有顯著的線性相將產(chǎn)氣的試管內(nèi)樣品接種到BGLB肉湯食品中大腸桿菌的檢驗一般生活在人大腸中并不致病,但它侵入人體一些部位時,可引起感染。在SS培養(yǎng)基上:大腸桿菌一般不能生長,少數(shù)生長的菌落也因發(fā)酵乳糖而呈紅色;大腸桿菌具有K抗原和菌毛:④包裝袋使用前進行紫外殺菌處理。②對原料產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中沒有檢驗大腸菌群的進行自檢,做到心中有數(shù)。選擇2~3個適宜稀釋度的樣液,大腸埃希氏菌發(fā)酵多種糖:葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、山梨醇和丙三醇等;這一事件使大腸桿菌O157:H7臭名遠揚。食品中大腸桿菌的檢驗要求食品中大腸菌群完全不存在是不可能的,重要的是其污染程度即菌量食品中大腸桿菌的檢驗要求食品中大腸菌群完全不存在是不可能的,重要的是其污染程度即菌量選擇3個連續(xù)稀釋度樣品勻液接種LST大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌的從屬關(guān)系VRBA-MUG平板計數(shù)法K抗原:有抗吞噬作用,有抵抗抗體和補體的作用VRBA-MUG平板計數(shù)法檢驗程序(試驗結(jié)果同MR試驗)④嚴(yán)格規(guī)定進入生產(chǎn)車間的人員必須清洗和消毒手,必須穿經(jīng)消毒的工作衣,更換工作鞋并在消毒池中消毒后方可進入車間。選擇15~150平板計數(shù)典型和可疑菌落*2001年夏天,在大腸桿菌O157:H7爆發(fā)殃及35人之后,ConAgraFoods立刻召回了懷疑受到污染的1900萬磅碎牛肉。2、靛基質(zhì)試驗(吲哚試驗)食品中大腸桿菌的檢驗原理:由于96%的大腸桿菌都具有葡萄糖醛苷酸酶,能分解β-D葡萄糖醛苷,而使4-甲基傘形酮游離出來,在366nm紫外光下產(chǎn)生藍色熒光。2、靛基質(zhì)試驗(吲哚試驗)大腸菌群并非細菌學(xué)分類命名,而是衛(wèi)生細菌領(lǐng)域的用語,它不代表某一個或某一屬細菌,而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細菌,這些細菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致。第三法:Petrifilm測試片法VRBA-MUG平板計數(shù)法PetrifilmTM大腸桿菌/大腸菌群測試片是一種預(yù)先制備好的培養(yǎng)基系統(tǒng),含有VRB培養(yǎng)基,冷水可溶性凝膠和葡萄糖苷酶指示劑,可增強菌落計數(shù)效果。接種PetrifilmTM大腸桿菌測試紙片熒光法與多管發(fā)酵法結(jié)果之間有顯著的線性相3-2010大腸菌群測定①完善企業(yè)更衣消毒設(shè)施,獨立設(shè)置更衣間與消毒間,更衣間安裝紫外滅菌燈、工作衣架。一些細菌分解葡萄糖為丙酮酸,進一步脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇,乙酰甲基甲醇在堿性溶液中被空氣中的氧氧化成二乙酰丁二酮,進而與培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中所含的精氨酸的胍基發(fā)生反應(yīng)生成紅色化合物。原理:由于96%的大腸桿菌都具有葡萄糖醛苷酸酶,能分解β-D葡萄糖醛苷,而使4-甲基傘形酮游離出來,在366nm紫外光下產(chǎn)生藍色熒光。*2001年夏天,在大腸桿菌O157:H7爆發(fā)殃及35人之后,ConAgraFoods立刻召回了懷疑受到污染的1900萬磅碎牛肉。2、靛基質(zhì)試驗(吲哚試驗)耐熱腸毒素(ST),ST無免疫性,耐熱,100℃經(jīng)10-20min不被破壞,它也可引起腹瀉。食品中大腸桿菌的檢驗大腸桿菌具有K抗原和菌毛:大腸桿菌具有K抗原和菌毛:②對原料產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中沒有檢驗大腸菌群的進行自檢,做到心中有數(shù)。我國:1997年在一定范圍內(nèi)開展監(jiān)測,已陸續(xù)有十余個省份在市售食品、進口食品、腹瀉病患者、家畜家禽等分離到該菌,并在1999年我國蘇皖毗鄰地區(qū)突然暴發(fā)了腸出血性大腸桿菌O157:H7,選擇2~3個適宜稀釋度的樣液,食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“環(huán)”①在生產(chǎn)車間安裝足夠的紫外滅菌燈,對生產(chǎn)環(huán)境定時殺菌。②生產(chǎn)車間定時通風(fēng)除濕,防止大腸菌群的滋生和繁殖。大腸菌群控制(冷凍飲品生產(chǎn)為例子)蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗一42大腸菌群的食品衛(wèi)生學(xué)意義作為糞便污染食品的指標(biāo)菌,MPN值愈低則說明食品受糞便污染程度及對人體健康危害程度愈低作為腸道致病菌污染食品的指針,大腸菌群數(shù)量越多則腸道致病菌存在的可能性就越高,但兩者之間并不總是呈平行關(guān)系要求食品中大腸菌群完全不存在是不可能的,重要的是其污染程度即菌量食品中大腸桿菌的檢驗1982年美國食物中毒;我國:1997年在一定范圍內(nèi)開展監(jiān)測,已陸續(xù)有十余個省份在市售食品、進口食品、腹瀉病患者、家畜家禽等分離到該菌,并在1999年我國蘇皖毗鄰地區(qū)突然暴發(fā)了腸出血性大腸桿菌O157:H7,大腸菌群的食品衛(wèi)生學(xué)意義作為糞便污染食品的指標(biāo)菌,MPN值愈43GB4789.3-2010大腸菌群測定定義:Coliforms,一群在36℃培養(yǎng)48h可發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏染色陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源自人畜糞便,作為糞便污染指標(biāo)評價食品的衛(wèi)生狀況,推斷食品中腸道致病菌污染的可能。食品中大腸桿菌的檢驗GB4789.3-2010大腸菌群測定定義:Colifo44ETEC
EIEC
陰溝腸桿菌EHEC
大腸菌群耐熱大腸菌群(糞大腸菌群)大腸桿菌產(chǎn)氣克雷白氏菌大腸埃希氏菌檸檬酸桿菌O157:H7大腸桿菌是人和溫血動物腸道內(nèi)普遍存在的細菌,是糞便中的主要菌種。一般生活在人大腸中并不致病,但它侵入人體一些部位時,可引起感染。大腸菌群并非細菌學(xué)分類命名,而是衛(wèi)生細菌領(lǐng)域的用語,它不代表某一個或某一屬細菌,而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細菌,這些細菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致。一般認為可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。
總大腸菌群系指一群在37℃培養(yǎng)24小時能發(fā)酵乳酸、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。耐熱大腸菌群即糞大腸菌群,作為一種衛(wèi)生指標(biāo)菌,耐熱大腸菌群中很可能含有糞源微生物,因此耐熱大腸菌群的存在表明可能受到了糞便污染,可能存在大腸桿菌。但是,耐熱大腸菌群的存在并不代表對人有什么直接的危害。致病性大腸桿菌能引起食物中毒。致病性菌株能侵入腸粘膜上皮細胞,具有痢疾桿菌樣致病力。腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸毒素性大腸桿菌(ETEC)和腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)等。O157:H7(EHEC)腸出血性大腸桿菌,感染性腹瀉是近年來新發(fā)現(xiàn)的危害嚴(yán)重的腸道傳染病,已逐漸成為威脅人群健康的重要公共衛(wèi)生問題。大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌的從屬關(guān)系ETECEIEC陰溝腸桿菌EHEC大腸菌群耐熱大腸菌群45食品中大腸桿菌的檢驗概述生物學(xué)特性
1)形態(tài)與染色2)培養(yǎng)特性3)生化特性4)抵抗力
5)致病性1)形態(tài)與染色G-、有鞭毛、無芽孢或有莢膜,兩端鈍圓短桿菌。大小為(1.1-1.5)μmX(2.0-6.0)μm(活菌)或(0.4-0.7)μmX(1.0-3.0)μm
(染色菌),絕大多數(shù)菌株有周身鞭毛,能運動,周身還有菌毛,無芽孢,某些菌株具有莢膜。
食品中大腸桿菌的檢驗概述生物學(xué)特性46食品中大腸桿菌的檢驗概述2)培養(yǎng)特性在普通培養(yǎng)基上:長成2-3mm的S型小菌落;在鮮血瓊脂平板上:生長,有些菌株可見β型溶血環(huán)**;在麥康凱培養(yǎng)基上:因發(fā)酵乳糖而產(chǎn)生有色菌落在SS培養(yǎng)基上:大腸桿菌一般不能生長,少數(shù)生長的菌落也因發(fā)酵乳糖而呈紅色;在伊紅美藍瓊脂平板上:生長成紫黑色帶有金屬光澤的菌落;在液體培養(yǎng)基中:呈均勻混濁生長,形成莢膜,管底有粘性沉淀培養(yǎng)物呈特殊的臭味。食品中大腸桿菌的檢驗概述2)培養(yǎng)特性47食品中大腸桿菌的檢驗概述3)生化特性
大腸埃希氏菌發(fā)酵多種糖:葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、山梨醇和丙三醇等;大部分菌株可迅速發(fā)酵乳糖,各菌株對蔗糖、水楊苷、衛(wèi)矛醇及棉子糖的發(fā)酵力不一致,吲哚+,MR+,V-P-,枸櫞酸胺鹽-(IMVC++--),尿素酶-,硫化氫-,氰化鉀培養(yǎng)基不中生長,丙二酸鹽利用-,可使谷氨酸和賴氨酸脫羧基,苯丙氨酸-,氧化酶-,接觸媒+。食品中大腸桿菌的檢驗概述3)生化特性48食品中大腸桿菌的檢驗3致病性(1)致病因素:①侵襲力②內(nèi)毒素③腸毒素①侵襲力大腸桿菌具有K抗原和菌毛:K抗原:有抗吞噬作用,有抵抗抗體和補體的作用菌毛:能幫助細菌粘附于粘膜表面。有侵襲力的菌株可以侵犯腸道表皮層引起炎癥。②內(nèi)毒素大腸桿菌細胞壁具有內(nèi)毒素的活性:其脂類A是毒性部位
特異多糖有助于細菌抵抗宿主的防御機制。概述食品中大腸桿菌的檢驗概述49食品中大腸桿菌的檢驗概述③腸毒素大腸埃希氏菌腸毒素有兩種:
a.不耐熱腸毒素(LT):蛋白質(zhì),加熱65℃經(jīng)30min即被破壞,促進腸粘膜細胞大量分泌腸液,引起腹瀉;
生食b.耐熱腸毒素(ST),ST無免疫性,耐熱,100℃經(jīng)10-20min不被破壞,它也可引起腹瀉。食品中大腸桿菌的檢驗概述③腸毒素50食品中大腸桿菌的檢驗概述(2)所致疾?、倌c外感染①腸外感染泌尿系統(tǒng)感染敗血癥膽囊炎肺炎新生兒或嬰兒腦膜炎等。
食品中大腸桿菌的檢驗概述(2)所致疾病51概述②腹瀉4種大腸桿菌都可引起腹瀉:
產(chǎn)毒素大腸桿菌--是嬰幼兒及旅游者腹瀉的主要原因;
致病性大腸桿菌--是嬰兒腹瀉的主要原因,嚴(yán)重者可致死;
侵襲性大腸桿菌--主要引起較大兒童和成年人腹瀉,有時甚至可引起爆發(fā)流行;
出血性大腸埃希氏菌O157--引起的主要臨床癥狀是腹瀉(重者水樣腹瀉)、腹痛、嘔吐,是老幼患者死亡的主要原因。食品中大腸桿菌的檢驗概述②腹瀉食品中大腸桿菌的檢驗52食品中大腸桿菌的檢驗第一法:MPN法第二法:VRBA-MUG平板計數(shù)法第三法:Petrifilm測試片法食品中大腸桿菌的檢驗第一法:MPN法53促進腸粘膜細胞大量分泌腸液,引起腹瀉;2、靛基質(zhì)試驗(吲哚試驗)選擇2~3個適宜稀釋度的樣液,選擇2~3個適宜稀釋度的樣液,要求食品中大腸菌群完全不存在是不可能的,重要的是其污染程度即菌量大腸桿菌具有K抗原和菌毛:大腸埃希氏菌發(fā)酵多種糖:葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、山梨醇和丙三醇等;蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗②注模消毒后一定要用無菌水進行沖洗,避免注模二次污染。*2001年夏天,在大腸桿菌O157:H7爆發(fā)殃及35人之后,ConAgraFoods立刻召回了懷疑受到污染的1900萬磅碎牛肉。食品中大腸桿菌的檢驗熒光法快速測定水中糞大腸菌群[J/OL].由希華,徐標(biāo),李恒慶,宗雪梅.②一旦產(chǎn)品中檢出大腸菌群,要對生產(chǎn)設(shè)備和管道進行徹底消毒。原理:由于96%的大腸桿菌都具有葡萄糖醛苷酸酶,能分解β-D葡萄糖醛苷,而使4-甲基傘形酮游離出來,在366nm紫外光下產(chǎn)生藍色熒光。二、常見生理生化試驗我國:1997年在一定范圍內(nèi)開展監(jiān)測,已陸續(xù)有十余個省份在市售食品、進口食品、腹瀉病患者、家畜家禽等分離到該菌,并在1999年我國蘇皖毗鄰地區(qū)突然暴發(fā)了腸出血性大腸桿菌O157:H7,總大腸菌群系指一群在37℃培養(yǎng)24小時能發(fā)酵乳酸、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。①滅菌一定要徹底,一般溫度在90℃以上,滅菌15min以上,就能使產(chǎn)品達到無菌狀態(tài)。接種PetrifilmTM大腸桿菌測試紙片大腸菌群計數(shù)檢驗流程0將產(chǎn)氣的試管內(nèi)樣品接種到BGLB肉湯LST不產(chǎn)氣(-)小導(dǎo)管里無氣泡LST產(chǎn)氣(+)食品中大腸桿菌的檢驗MPN法促進腸粘膜細胞大量分泌腸液,引起腹瀉;大腸菌群計數(shù)檢驗流程054第二法VRBA平板計數(shù)法選擇15~150平板計數(shù)典型和可疑菌落36℃±1℃18h~24h挑選10個菌落接種到BGLB典型菌落為紫紅色周圍有紅色膽鹽沉淀環(huán),0.5mm食品中大腸桿菌的檢驗MPN法第二法VRBA平板計數(shù)法選擇15~150平板計數(shù)典型和可疑55食品中大腸桿菌的檢驗MPN法大腸桿菌計數(shù)MPN法檢驗程序檢樣25g(ml)+225ml稀釋液,均質(zhì)10倍稀釋選擇3個連續(xù)稀釋度樣品勻液接種LST48±2h36℃±1℃不產(chǎn)氣產(chǎn)氣EC肉湯45℃±0.2℃24±2h不產(chǎn)氣產(chǎn)氣EMB瓊脂平板36℃±1℃24±2h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)生化試驗,革蘭染色查MPN表,報告食品中大腸桿菌的檢驗MPN法大腸桿菌計數(shù)MPN法檢驗程序檢56如何報告結(jié)果?根據(jù)經(jīng)確證后的對應(yīng)濃度陽性管數(shù)查MPN表MPN:最可能數(shù),基于泊松分布的一種間接計數(shù)方法陽性管數(shù)MPN95%可信限0.100.010.001下限上限000<3.0-9.50013.00.159.61003.60.1718333>1100420-食品中大腸桿菌的檢驗MPN法如何報告結(jié)果?根據(jù)經(jīng)確證后的對應(yīng)濃度陽性管數(shù)查MPN表陽性管57食品中大腸桿菌的檢驗美國食品藥品管理局(FDA):BacteriologicalAnalyticalManual,2002,Chapter4:EnumerationofEscherichiacoliandtheColiformBacteria原理:由于96%的大腸桿菌都具有葡萄糖醛苷酸酶,能分解β-D葡萄糖醛苷,而使4-甲基傘形酮游離出來,在366nm紫外光下產(chǎn)生藍色熒光。觀察到藍色熒光即可認為是大腸桿菌陽性。4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷(MUG)對大腸桿菌的生長繁殖既沒有抑制作用也沒有促進作用,對菌落形態(tài)也沒有影響。VRBA-MUG平板計數(shù)法第二法VRBA-MUG平板計數(shù)法食品中大腸桿菌的檢驗美國食品藥品管理局(FDA):Bact58食品中大腸桿菌的檢驗VRBA-MUG平板計數(shù)法VRBA-MUG平板計數(shù)法檢驗程序檢樣25g(ml)+225ml稀釋液,均質(zhì)10倍系列稀釋選擇2~3個適宜稀釋度的樣液,接種VRBA-MUG平板紫外光下,計數(shù)發(fā)熒光的菌落報告結(jié)果36℃±1℃18~24h食品中大腸桿菌的檢驗VRBA-MUG平板計數(shù)法VRBA-M59食品中大腸桿菌的檢驗由希華,徐標(biāo),李恒慶,宗雪梅.熒光法快速測定水中糞大腸菌群[J/OL].中國環(huán)境監(jiān)測VRBA-MUG平板計數(shù)法選擇不同的地表水廢水樣品進行熒光法與多管發(fā)酵法比對測試,討論方法適用性。熒光法與多管發(fā)酵法結(jié)果之間有顯著的線性相食品中大腸桿菌的檢驗由希華,徐標(biāo),李恒慶,宗雪梅.熒光法快60食品中大腸桿菌的檢驗PetrifilmTM測試片法第三法PetrifilmTM測試片法
PetrifilmTM大腸桿菌/大腸菌群測試片是一種預(yù)先制備好的培養(yǎng)基系統(tǒng),含有VRB培養(yǎng)基,冷水可溶性凝膠和葡萄糖苷酶指示劑,可增強菌落計數(shù)效果。E.coli能產(chǎn)生-葡萄糖苷酸酶與培養(yǎng)基中的指示劑反應(yīng),產(chǎn)生藍色沉淀環(huán)繞在大腸桿菌菌落周圍。表面覆蓋的膠膜,可截留發(fā)酵乳糖的大腸菌群產(chǎn)生的氣體。培養(yǎng)結(jié)束后計數(shù)藍點帶氣泡的菌落即為大腸桿菌數(shù),紅點帶氣泡和藍點帶氣泡的菌落之和為大腸菌群數(shù)。食品中大腸桿菌的檢驗PetrifilmTM測試片法第三法61食品中大腸桿菌的檢驗PetrifilmTM測試片法大腸桿菌PetrifilmTM測試片檢驗程序檢樣25g(ml)+225ml稀釋液,均質(zhì)10倍系列稀釋選擇2~3個適宜稀釋度的樣液,接種PetrifilmTM大腸桿菌測試紙片計數(shù)藍色帶氣泡菌落報告結(jié)果36℃±1℃24±2h或48±2h食品中大腸桿菌的檢驗PetrifilmTM測試片法大腸桿菌62食品中大腸桿菌的檢驗PetrifilmTM測試片法史夢雨.消毒餐飲具中大腸菌群的兩種方法比較[J].中國城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生,2018,33(12):76-77.
食品中大腸桿菌的檢驗PetrifilmTM測試片法史夢雨.63食品中大腸桿菌的檢驗PetrifilmTM測試片法食品中大腸桿菌的檢驗PetrifilmTM測試片法64典型菌落:具黑色中心有光澤或無光澤的菌落。這一事件使大腸桿菌O157:H7臭名遠揚。原理:由于96%的大腸桿菌都具有葡萄糖醛苷酸酶,能分解β-D葡萄糖醛苷,而使4-甲基傘形酮游離出來,在366nm紫外光下產(chǎn)生藍色熒光。食品中大腸桿菌的檢驗表面覆蓋的膠膜,可截留發(fā)酵乳糖的大腸菌群產(chǎn)生的氣體。第二法VRBA-MUG平板計數(shù)法①滅菌一定要徹底,一般溫度在90℃以上,滅菌15min以上,就能使產(chǎn)品達到無菌狀態(tài)。在液體培養(yǎng)基中:呈均勻混濁生長,形成莢膜,管底有粘性沉淀培養(yǎng)物呈特殊的臭味。蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗食品中大腸桿菌的檢驗大腸埃希氏菌發(fā)酵多種糖:葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、山梨醇和丙三醇等;①完善企業(yè)更衣消毒設(shè)施,獨立設(shè)置更衣間與消毒間,更衣間安裝紫外滅菌燈、工作衣架。食品中大腸桿菌的檢驗K抗原:有抗吞噬作用,有抵抗抗體和補體的作用第三法:Petrifilm測試片法在麥康凱培養(yǎng)基上:因發(fā)酵乳糖而產(chǎn)生有色菌落我國:1997年在一定范圍內(nèi)開展監(jiān)測,已陸續(xù)有十余個省份在市售食品、進口食品、腹瀉病患者、家畜家禽等分離到該菌,并在1999年我國蘇皖毗鄰地區(qū)突然暴發(fā)了腸出血性大腸桿菌O157:H7,第三法PetrifilmTM測試片法在液體培養(yǎng)基中:呈均勻混濁生長,形成莢膜,管底有粘性沉淀培養(yǎng)物呈特殊的臭味。大腸桿菌PetrifilmTM測試片檢驗程序食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制大腸菌群控制(冷凍飲品生產(chǎn)為例子)人機料法環(huán)典型菌落:具黑色中心有光澤或無光澤的菌落。食品中大腸桿菌的檢65食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“人”①完善企業(yè)更衣消毒設(shè)施,獨立設(shè)置更衣間與消毒間,更衣間安裝紫外滅菌燈、工作衣架。
②消毒間安裝洗手池、酒精噴淋器、干手器。③車間進入門口放鞋靴消毒池。④嚴(yán)格規(guī)定進入生產(chǎn)車間的人員必須清洗和消毒手,必須穿經(jīng)消毒的工作衣,更換工作鞋并在消毒池中消毒后方可進入車間。食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“人”①完善企業(yè)更衣消毒設(shè)66食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“機”①嚴(yán)格落實《生產(chǎn)設(shè)施、設(shè)備清洗消毒制度》,定期對生產(chǎn)設(shè)備及管道用CIP清洗消毒或用90℃以上的熱水消毒,預(yù)防大腸菌群的滋生和繁殖。②一旦產(chǎn)品中檢出大腸菌群,要對生產(chǎn)設(shè)備和管道進行徹底消毒。食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“機”①嚴(yán)格落實《生產(chǎn)設(shè)施67食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“料”①嚴(yán)格驗收原輔料,重點查驗大腸菌群項目,盡可能購買不含大腸菌群原輔料。②對原料產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中沒有檢驗大腸菌群的進行自檢,做到心中有數(shù)。③定期自檢生產(chǎn)用水,必要時進行殺菌處理。④包裝袋使用前進行紫外殺菌處理。食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“料”①嚴(yán)格驗收原輔料,重68食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“法”①滅菌一定要徹底,一般溫度在90℃以上,滅菌15min以上,就能使產(chǎn)品達到無菌狀態(tài)。②注模消毒后一定要用無菌水進行沖洗,避免注模二次污染。③要避免交叉污染,嚴(yán)格區(qū)分開生區(qū)和熟區(qū)。食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“法”①滅菌一定要徹底,一69食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“環(huán)”①在生產(chǎn)車間安裝足夠的紫外滅菌燈,對生產(chǎn)環(huán)境定時殺菌。②生產(chǎn)車間定時通風(fēng)除濕,防止大腸菌群的滋生和繁殖。食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“環(huán)”①在生產(chǎn)車間安裝足夠70*1993年,JackInTheBox快餐連鎖店出售未煮熟的污染漢堡引起700多人(以兒童為主)食物中毒,并造成4人死亡。這一事件使大腸桿菌O157:H7臭名遠揚。*2001年夏天,在大腸桿菌O157:H7爆發(fā)殃及35人之后,ConAgraFoods立刻召回了懷疑受到污染的1900萬磅碎牛肉。美國疾病預(yù)防和控制中心估計,美國每年因大腸桿菌O157:H7致病總?cè)藬?shù)大約為73000人,盡管上報的病例已有所下降。*1998年,佐治亞州亞特蘭大水上公園發(fā)生的大腸桿菌O157:H7大爆發(fā)使得多名兒童住院。*1996年5-8月,日本中學(xué)和幼兒園相繼發(fā)生多起大腸桿菌O157集體中毒事件,波及44個地區(qū),7萬例,死亡12人.與芽菜有關(guān)。*1993年,JackInTheBox快餐連鎖店出售未71益生菌:不致病,能合成維生素B和維生素K,生產(chǎn)大腸菌素,對機體有利;條件致病菌:在機體因內(nèi)外因素所致抵抗力下降或菌體侵入腸外組織或器官時條件下致??;致病菌:引起腸道感染的有四類:產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(enterotoxigenicE.coli,ETEC)出血性大腸埃希氏菌(enterohemorrhagicE.coli,EHEC)
腸道侵襲性大腸埃希氏菌(enteroinvasiveE.coli,EIEC)
腸道致病性大腸埃希氏菌(enteropathogenicE.coli,EPEC)帶菌的牛和豬是傳播本菌引起食物中毒最重要原因,人的帶菌亦可污染食品,引起中毒。益生菌:不致病,能合成維生素B和維生素K,生產(chǎn)大腸菌素,對72EMB瓊脂主要成分:乳糖、營養(yǎng)物質(zhì)。指示劑系統(tǒng):伊紅和美監(jiān)。原理:大腸菌群分解乳糖產(chǎn)酸,使伊紅與美藍結(jié)合而形成黑色化合物,故菌落呈黑紫色,并可產(chǎn)生金屬光澤。黑色程度與光澤產(chǎn)生情況與伊紅、美藍二者的比例有關(guān)。不發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸的細菌,在堿性環(huán)境中不能使伊紅、美藍結(jié)合,因而形成無色的菌落。部分大腸菌群的菌株在EMB上可形成紅色或粉紅色的菌落。(應(yīng)注意非典型的菌落)。典型菌落:具黑色中心有光澤或無光澤的菌落。非典型的可疑菌落:粉紅色,無黑心EMB瓊脂主要成分:乳糖、營養(yǎng)物質(zhì)。指示劑系統(tǒng):伊紅和美監(jiān)。73靛基質(zhì)試驗:甲基紅試驗:V-P試驗:檸檬酸鹽試驗:靛基質(zhì)試驗:74
4、甲基紅(MR)試驗和V-P試驗二、常見生理生化試驗
糖(醇)類代謝試驗1、MR試驗原理:一些細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸可被進一步分解為甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸而使培養(yǎng)基的PH值下降到4.5以下,加入甲基紅指示劑出現(xiàn)紅色反應(yīng)2、V-P試驗原理一些細菌分解葡萄糖為丙酮酸,進一步脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇,乙酰甲基甲醇在堿性溶液中被空氣中的氧氧化成二乙酰丁二酮,進而與培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中所含的精氨酸的胍基發(fā)生反應(yīng)生成紅色化合物。(試驗結(jié)果同MR試驗)4、甲基紅(MR)試驗和V-P試驗二、常見生理生化試驗75二、常見生理生化試驗
糖(醇)類代謝試驗V-P試驗方法:將待檢菌接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中,于35℃培養(yǎng)48h后加入甲液(6%α-萘酚酒精溶液)和乙液(40%KOH溶液),振搖。結(jié)果:在數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性;如無紅色出現(xiàn)且于35℃4h后仍如故者即為陰性。二、常見生理生化試驗糖(醇)類代謝試驗V-P試驗結(jié)果76二、常見生理生化試驗
蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗1、明膠液化試驗一些細菌可產(chǎn)生胞外酶,使明膠蛋白分解為氨基酸,而失去明膠的凝固能力。陽性陰性2、靛基質(zhì)試驗(吲哚試驗)一些細菌可以分解蛋白胨的色氨酸,產(chǎn)生靛基質(zhì),靛基質(zhì)可與對二甲氨基苯甲醛作用,生成玫瑰吲哚而成紅色。陽性對照二、常見生理生化試驗蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗1、明膠液77
1、枸櫞酸鹽利用試驗二、常見生理生化試驗
有機酸鹽和銨鹽的利用試驗一些微生物可以以銨鹽作為唯一的氮源,以檸檬酸鹽作為唯一的碳源,在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長,分解檸檬酸鹽生成碳酸鹽,使培養(yǎng)基變成堿性,酸堿指示劑變色。培養(yǎng)基中的溴麝香草酚蘭指示劑由淡綠色變?yōu)樯钏{色為陽性1、枸櫞酸鹽利用試驗二、常見生理生化試驗有機酸鹽78致病性菌株能侵入腸粘膜上皮細胞,具有痢疾桿菌樣致病力。一些細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸可被進一步分解為甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸而使培養(yǎng)基的PH值下降到4.1、枸櫞酸鹽利用試驗一些細菌可以分解蛋白胨的色氨酸,產(chǎn)生靛基質(zhì),靛基質(zhì)可與對二甲氨基苯甲醛作用,生成玫瑰吲哚而成紅色。選擇15~150平板計數(shù)典型和可疑菌落中國城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生,2018,33(12):76-77.將產(chǎn)氣的試管內(nèi)樣品接種到BGLB肉湯接種VRBA-MUG平板VRBA-MUG平板計數(shù)法檢驗程序特異多糖有助于細菌抵抗宿主的防御機制。食品中大腸桿菌的檢驗菌毛:能幫助細菌粘附于粘膜表面。第三法:Petrifilm測試片法我國:1997年在一定范圍內(nèi)開展監(jiān)測,已陸續(xù)有十余個省份在市售食品、進口食品、腹瀉病患者、家畜家禽等分離到該菌,并在1999年我國蘇皖毗鄰地區(qū)突然暴發(fā)了腸出血性大腸桿菌O157:H7,接種PetrifilmTM大腸桿菌測試紙片④嚴(yán)格規(guī)定進入生產(chǎn)車間的人員必須清洗和消毒手,必須穿經(jīng)消毒的工作衣,更換工作鞋并在消毒池中消毒后方可進入車間。腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸毒素性大腸桿菌(ETEC)和腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)等。由希華,徐標(biāo),李恒慶,宗雪梅.大腸桿菌具有K抗原和菌毛:選擇3個連續(xù)稀釋度樣品勻液接種LST大腸菌群計數(shù)檢驗流程0將產(chǎn)氣的試管內(nèi)樣品接種到BGLB肉湯LST不產(chǎn)氣(-)小導(dǎo)管里無氣泡LST產(chǎn)氣(+)食品中大腸桿菌的檢驗MPN法致病性菌株能侵入腸粘膜上皮細胞,具有痢疾桿菌樣致病力。大腸菌79食品中大腸桿菌的檢驗MPN法大腸桿菌計數(shù)MPN法檢驗程序檢樣25g(ml)+225ml稀釋液,均質(zhì)10倍稀釋選擇3個連續(xù)稀釋度樣品勻液接種LST48±2h36℃±1℃不產(chǎn)氣產(chǎn)氣EC肉湯45℃±0.2℃24±2h不產(chǎn)氣產(chǎn)氣EMB瓊脂平板36℃±1℃24±2h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)生化試驗,革蘭染色查MPN表,報告食品中大腸桿菌的檢驗MPN法大腸桿菌計數(shù)MPN法檢驗程序檢80食品中大腸桿菌的檢驗VRBA-MUG平板計數(shù)法VRBA-MUG平板計數(shù)法檢驗程序檢樣25g(ml)+225ml稀釋液,均質(zhì)10倍系列稀釋選擇2~3個適宜稀釋度的樣液,接種VRBA-MUG平板紫外光下,計數(shù)發(fā)熒光的菌落報告結(jié)果36℃±1℃18~24h食品中大腸桿菌的檢驗VRBA-MUG平板計數(shù)法VRBA-M81食品中大腸桿菌的檢驗由希華,徐標(biāo),李恒慶,宗雪梅.熒光法快速測定水中糞大腸菌群[J/OL].中國環(huán)境監(jiān)測VRBA-MUG平板計數(shù)法選擇不同的地表水廢水樣品進行熒光法與多管發(fā)酵法比對測試,討論方法適用性。熒光法與多管發(fā)酵法結(jié)果之間有顯著的線性相食品中大腸桿菌的檢驗由希華,徐標(biāo),李恒慶,宗雪梅.熒光法快82食品中大腸桿菌的檢驗大腸菌群控制“人”①完善企業(yè)更衣消毒設(shè)施,獨立設(shè)置更衣間與消毒間,更衣間安裝紫外滅菌燈、工作衣架。
②消毒間安裝洗手池、酒精噴淋器、干手器。③車間進入門口放鞋靴消毒池。④嚴(yán)格規(guī)定進入生產(chǎn)車間的人員必須清洗和消毒手,必須穿經(jīng)消毒的工作衣,更換工作鞋并在消毒池中消毒后方可進
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