流式細胞儀基本原理及應用課件

流式細胞儀在臨床檢測和臨床科研中的應用李柏青蚌埠醫(yī)學院免疫學教研室流式細胞儀在臨床檢測和臨床科研中的應用李柏青-2-流式細胞儀和流式細胞術(shù)－概述流式細胞儀的工作原理和測量參數(shù)流式細胞儀在臨床檢測和科研中的應用免疫學檢測和科研應用血液病檢測和科研應用腫瘤學檢測和科研應用流式細胞儀的基本工作原理以及在基礎(chǔ)和臨床科研中的應用-2-流式細胞儀和流式細胞術(shù)－概述流式細胞儀的基本工作原理以-3-一、流式細胞儀和流式細胞術(shù)的基本概念流式細胞儀(FlowCytometer，F(xiàn)CM):是集合光電子物理，光電測量技術(shù)，液流技術(shù)，計算機技術(shù)等現(xiàn)代高科技技術(shù)為一體的細胞測量和分析儀器。-3-一、流式細胞儀和流式細胞術(shù)的基本概念流式細胞儀(Flo-4-一、流式細胞儀和流式細胞術(shù)的基本概念流式細胞術(shù)(FlowCytometry，F(xiàn)CM):是應用流式細胞儀，對處于快速流動液體中的細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速測量和定量分析，以及分選的技術(shù)。-4-一、流式細胞儀和流式細胞術(shù)的基本概念流式細胞術(shù)(Flo-5-一、流式細胞儀和流式細胞術(shù)－特點多參數(shù)測量和分析（散射光和熒光）；快速測量和分析每秒可達1000-10000個細胞分選純度可達99%以上。獲取的數(shù)據(jù)分析結(jié)果更具有統(tǒng)計學意義；通常測量的對象如各種細胞細胞必須處在單個細胞懸液中。此外，也可測量微生物等生物顆粒，或者工合成微球非生物顆粒，-5-一、流式細胞儀和流式細胞術(shù)－特點多參數(shù)測量和分析（散射-6-臺式機——FACSCalibur雙激光

488nm 635nm四熒光參數(shù)分選、濃縮系統(tǒng)-6-臺式機——FACSCalibur雙激光77-8-大型機——FACSVantageSE科研型八熒光參數(shù)高速分選多路分選-8-大型機——FACSVantageSE-9-

流式細胞儀與熒光顯微鏡比較

流式細胞儀熒光顯微鏡

流動的細胞靜止的細胞樣本數(shù)量大數(shù)量少高速分選樣本難以再利用細胞群體特征量分布可揭示細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息-9-流式細胞儀與熒光顯微鏡比較流式細胞儀-10-二、流式細胞儀的工作原理和測量參數(shù)光路系統(tǒng)：

激光光源，光路系統(tǒng)（透鏡、濾光片）電子系統(tǒng)：光電倍增管（PMT），補償電路液流系統(tǒng)：

鞘液系統(tǒng)，樣品流動系統(tǒng)數(shù)據(jù)系統(tǒng)：計算機，數(shù)據(jù)測量和分析軟件。細胞分選系統(tǒng)（一）流式細胞儀的結(jié)構(gòu)

-10-二、流式細胞儀的工作原理和測量參數(shù)光路系統(tǒng)：（一）-11-流式細胞儀－光路系統(tǒng)激光(Laser)是一種相干光源，它能提供單一波長、單一方向、同步的穩(wěn)定光照激光波長:488nm,635nm光收集系統(tǒng)是由若干組透鏡,濾波片,小孔組成，將產(chǎn)生的光信號引導至檢測器-11-流式細胞儀－光路系統(tǒng)激光(Laser)是一種相干光-12-光路系統(tǒng)-12-光路系統(tǒng)-13-InjectorTip-13-Injector-14-InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid-14-InjectorFluorescencesigna-15-流式細胞儀－光學系統(tǒng)激發(fā)光源與熒光標記物-15-流式細胞儀－光學系統(tǒng)激發(fā)光源與熒光標記物-16-光學檢測信號-16-光學檢測信號-17-流式細胞儀的光學系統(tǒng)FACSCalibur-17-流式細胞儀的光學系統(tǒng)FACSCalibur-18-流式細胞儀－液流系統(tǒng)-18-流式細胞儀－液流系統(tǒng)-19-液流系統(tǒng)：鞘液系統(tǒng)＋樣品流動系統(tǒng)-19-液流系統(tǒng)：鞘液系統(tǒng)＋樣品流動系統(tǒng)-20-流式細胞儀的電子系統(tǒng)

信號檢測和分析當細胞攜帶熒光素,通過激光照射區(qū),受到激發(fā)產(chǎn)生不同波長的、代表細胞內(nèi)不同物質(zhì)的熒光信號熒光信號由光電接收器接收，轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖信號，電脈沖信號經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號數(shù)字信號傳送到計算機，進行儲存、作圖和統(tǒng)計分析-20-流式細胞儀的電子系統(tǒng)信號檢測和分析-21-數(shù)據(jù)系統(tǒng)-21-數(shù)據(jù)系統(tǒng)-22-（二）流式細胞儀可檢測的細胞參數(shù)細胞結(jié)構(gòu)細胞大小細胞顆粒性程度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量細胞功能細胞表面蛋白抗原細胞胞漿內(nèi)蛋白性抗原細胞內(nèi)細胞因子細胞增殖細胞內(nèi)鈣離子濃度二、流式細胞儀的工作原理和測量參數(shù)-22-（二）流式細胞儀可檢測的細胞參數(shù)細胞結(jié)構(gòu)細胞功能二-23-（二）流式細胞儀可檢測的細胞的參數(shù)：

散射光信號前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

入射光的前向

(5)散射光信號,可反映：細胞相對大小及其表面積側(cè)向角散射光（SSC,SideScatter）

入射光90角的散射光信號，可反映：細胞顆粒性程度

（胞內(nèi)成分和構(gòu)造和表面結(jié)構(gòu)的復雜性）-23-（二）流式細胞儀可檢測的細胞的參數(shù)：

-24-散射光信號前向角散射光－FSCFALSSensorLaser-24-散射光信號前向角散射光－FSCFALSSensor-25-散射光信號側(cè)向角散射光－SSCFALSSensor90LSSensorLaser-25-散射光信號側(cè)向角散射光－SSCFALSSensor-26-流式細胞的基本信息:“形態(tài)”-26-流式細胞的基本信息:“形態(tài)”-27--27--28-外周全血細胞（紅細胞溶解后）

以散射光表示的雙參數(shù)點圖-28-外周全血細胞（紅細胞溶解后）

-29-外周全血細胞（紅細胞溶解后）

以散射光表示的雙參數(shù)點圖中性粒細胞單核細胞淋巴細胞-29-外周全血細胞（紅細胞溶解后）

-30-（二）流式細胞檢測細胞參數(shù):

特征信息－熒光（Fluorescence）信號熒光素吸收激光（激發(fā)光波長）能量熒光素將吸收能量釋放，轉(zhuǎn)換為釋放較入射光波長更長的光量子（發(fā)射光波長）熒光素與特異抗體結(jié)合（熒光抗體）熒光抗體與細胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生熒光信號越強 熒光素與細胞核酸結(jié)合，熒光強度反映核酸含量-30-（二）流式細胞檢測細胞參數(shù):

特征信息－熒光（F-31-（二）流式細胞檢測細胞參數(shù):

特征信息－熒光（Fluorescence）信號Forwardscatter(FSC)Sidescatter(SSC)FL1（第一熒光）-FITC(異硫氰酸熒光素）FL2（第二熒光）-PE（藻紅蛋白）FL3（第三熒光）-PerCP,PeCy5等PL4（第四熒光）-APC（藻青蛋白）-31-（二）流式細胞檢測細胞參數(shù):

特征信息－熒光（F-32-熒光信號FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)-32-熒光信號FluorescenceFALSSenso-33--33--34-熒光信號雙色直接染色-34-熒光信號雙色直接染色-35-（三）流式細胞儀分析數(shù)據(jù)常見圖形：

（二維）點陳圖(DotPlot)適用于：雙參數(shù)分析-35-（三）流式細胞儀分析數(shù)據(jù)常見圖形：

（二維）點陳圖-36-（三）流式細胞儀分析數(shù)據(jù)常見圖形：

直方圖(HistogramPlot)適用于：單參數(shù)分析僅需要觀察某個熒光強度的變化-36-（三）流式細胞儀分析數(shù)據(jù)常見圖形：

直方圖(Hi-37-流式細胞術(shù)檢測細胞的熒光標記方法單標：

一種單抗:FL1,FSC,SSC（三參數(shù)）雙標：兩種單抗：FL1,FL1,FSC,SSC（四參數(shù)）三標：三種單抗：FL1,FL2,FL3,FSC,SSC（五參數(shù)）四標－四種熒光標記抗體：四種單抗：FL1,FL2,FL3,FL4,FSC,SSC（六參數(shù)）-37-流式細胞術(shù)檢測細胞的熒光標記方法單標：-38-淋巴細胞亞群分析細胞凋亡

腫瘤學移植免疫三流式細胞儀在臨床檢測和科研中的應用血小板其它-38-淋巴細胞亞群分析細胞凋亡腫瘤學移植免疫三-39-淋巴細胞亞群分析-39-淋巴細胞亞群分析-40-AdhesionMetabolic-40-AdhesionMetabolic-41--41--42--42--43-

T淋巴細胞淋巴細胞亞群檢測：

Tcells,Tsubsets,NKcells,Bcells-43-T淋巴細胞淋巴細胞亞群檢測：-44-淋巴細胞亞群T淋巴細胞(CD3+)名稱功能CD3+CD4+輔助性/誘導性T細胞(Th/Ti)輔助和誘導細胞免疫和體液免疫CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-輔助性T細胞(Th)誘導性T細胞(Ti)輔助細胞免疫和體液免疫誘導細胞免疫和體液免疫CD3+CD8+抑制性/殺傷性T細胞(Ts/Tc)抑制免疫反應/殺傷異源細胞CD3+CD8+CD28-CD3+CD4+CD29-抑制性T細胞(Ts)殺傷性T細胞(Tc)抑制細胞和體液免疫細胞毒性T細胞CD3+CD4+CD8+活化的T細胞在T細胞惡性增生時升高CD3+CD4-CD8-有調(diào)節(jié)功能的T細胞,其表達/T細胞受體(TCR/)CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO-幼稚的/靜止的T淋巴細胞當免疫系統(tǒng)沒有能力更新輔助性或抑制性/細胞毒性淋巴細胞的祖細胞時此細胞亞群較低CD45RA-CD45RO+記憶性T淋巴細胞病菌感染時升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化的T細胞,感染時升高感染時升高-44-淋巴細胞亞群T淋巴細胞(CD3+)名稱功能-45-淋巴細胞亞群活化T淋巴細胞名稱功能CD3+HLA-DR+活化T細胞CD4+HLA-DR+活化的輔助性/誘導性T細胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細胞CD4+CD25+活化的輔助性/誘導性T細胞CD8+CD25+CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細胞在病毒感染的患者中增加;其增加意味著HIV患者的預后較差B淋巴細胞(19+)CD19+CD23+活化的B細胞過敏患者中升高CD19+CD5+在自身免疫性疾病中升高CD19+CD5+CD23+慢性B細胞白血病及單克隆B淋巴細胞NK細胞CD3+CD(16+56)+自身免疫性疾病時降低,而病毒感染時升高CD3+CD57+CMV(巨細胞病毒)感染的強烈征兆-45-淋巴細胞亞群活化T淋巴細胞名稱功-46-淋巴細胞亞群與疾病疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡類風濕性關(guān)節(jié)炎自身免疫性溶血性貧血重癥肌無力免疫缺陷病愛滋病病毒感染傳染性單核細胞增多癥慢性活動性肝炎活動性肝硬化腫瘤消化道癌,肝癌,肺癌再生障礙性貧血粒細胞減少癥-46-淋巴細胞亞群與疾病疾病CD3CD4CD8-47-淋巴細胞亞群檢測意義疾病機理研究

疾病輔助診斷移植后免疫檢測治療方案的確定及療效評價CD25高于正常值5-10%,表明即將或已發(fā)生排斥CD4/CD8比值下降提示并發(fā)兇險感染

<0.2時,必須停用免疫抑制劑CD2+HLA-DR+增加5-10%,且不伴有CD25的增加,提示巨細胞病毒感染慢性疲勞,感染后綜合征,纖維肌痛,類風濕性關(guān)節(jié)炎,過敏等

疾病預防-47-淋巴細胞亞群檢測意義疾病機理研究疾病輔助診斷移植后-48-淋巴細胞亞群檢測意義

Control（n=20)ActiveSLE(n=17)StableSLE(n=13)CD370.4±5.8765.8±10.968.5±8.95CD435.0±5.7022.1±4.15**34.5±4.23CD827.9±5.7345.7±9.58**32.7±9.01CD4/CD81.27±0.140.43±0.12**1.05±0.26*NK17.8±5.484.37±3.31**7.59±5.01**鑒別活動期和非活動期SLE-48-淋巴細胞亞群檢測意義Control（n=20)A-49-HIVANDAIDS-49-HIVANDAIDS-50-Th1/Th2細胞-50-Th1/Th2細胞-51-Th1/Th2細胞Th1型細胞因子介導細胞免疫反應引起遲發(fā)型過敏反應、巨噬細胞活化、局部炎癥刺激來源：病毒、某些細菌Th2型介導體液免疫反應引起B(yǎng)細胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、促進I型變態(tài)反應（過敏反應）刺激來源：多細胞寄生蟲、過敏原-51-Th1/Th2細胞Th1型細胞因子介導細胞免疫反應-52-Th1/Th2細胞PMA+Ionomycin刺激4-6hr-52-Th1/Th2細胞PMA+Ionomycin刺激4-53-流式細胞儀檢測胞內(nèi)細胞因子

新鮮分離PBMC

加PMA＋Io刺激后6h測定胞內(nèi)細胞因子IL-4和IFN-g

檢測免疫細胞表型和結(jié)合檢測胞內(nèi)細胞因子：操作和分析方法；

-53-流式細胞儀檢測胞內(nèi)細胞因子新鮮分離PBMC檢測免-54-四色標記胞內(nèi)因子FCM檢測-54-四色標記胞內(nèi)因子FCM檢測-55-Th1/Th2失衡相關(guān)疾病嗜酸性細胞增多和IgE升高相關(guān)疾病

Ommen’sSyndrome(Ommen’s綜合征)HyperosinophilicSyndrome(高嗜曙紅細胞綜合征)Kimura’sDisease(Kimura’s疾病)Well’sSyndrome(Well’s綜合征)傳染病

病毒性疾病

人類免疫缺陷性病毒感染和愛滋病(AIDS)

麻疹

呼吸道合胞體病毒感染

慢性活動性乙型肝炎病毒感染

分枝桿菌和其它細菌感染

麻瘋病/肺結(jié)核

鳥結(jié)核分枝桿菌復合感染滑膜炎反應性關(guān)節(jié)炎

淋病和梅毒

-55-Th1/Th2失衡相關(guān)疾病嗜酸性細胞增多和IgE升高-56-Th1/Th2失衡相關(guān)疾病寄生蟲病

原寄生蟲感染：皮膚和內(nèi)臟利什曼病

蠕蟲?。航z蟲病和血吸蟲病真菌性疾病

過敏性支氣管肺霉菌病

念珠菌病

隱球菌病

類球孢子菌病球孢子菌病

組織胞漿菌病惡性腫瘤

皮膚基底細胞和鱗細胞癌

SezarySyndrome(Sezary綜合征)

淋巴瘤

EBV相關(guān)的B細胞和非何杰金氏淋巴瘤

何杰金氏淋巴瘤

大細胞退行性(CD30+)淋巴瘤

多發(fā)性骨髓瘤和Castleman’s綜合征

卡氏肉瘤-56-Th1/Th2失衡相關(guān)疾病寄生蟲病www.gotof-57-Th1/Th2失衡相關(guān)疾病變應性疾病

皮膚性哮喘

變應性哮喘

春季結(jié)膜炎炎性和自身免疫性疾病

巨細胞(暫時性的)動脈炎

系統(tǒng)性紅斑狼瘡

類風濕性關(guān)節(jié)炎

自身免疫性甲狀腺疾病

類肉瘤病

銀屑病(牛皮癬)IgA腎病

多發(fā)性硬化-57-Th1/Th2失衡相關(guān)疾病變應性疾病www.goto-58-Th1/Th2細胞檢測意義疾病治療發(fā)病機制研究使用Th1和Th2相關(guān)的細胞因子

IFN-治療麻瘋病

用抗Th1和Th2相關(guān)細胞因子或其受體的抗體

抗IL-4抗體治療真菌和寄生蟲感染

使用調(diào)節(jié)Th2/Th2細胞因子平衡的藥物:

薩力多胺(Thaliodomide)治療巨細胞動脈炎疾病治療監(jiān)測-58-Th1/Th2細胞檢測意義疾病治療發(fā)病機制研究使用T-59-

腫瘤學-59-腫瘤學-60-腫瘤發(fā)生發(fā)展-60-腫瘤發(fā)生發(fā)展-61-02004006008001000PI熒光強度(DNA含量)DNA含量分析2N4NCountsG0/G1G2/MS異倍體-61-02004006008001000PI熒光-62-DNA含量分析70%人類癌癥中存在著異倍體或細胞周期的改變1.RossJS.DNAPloidyandCellCycleAnalysisinPathology.NewYork:Igaku-Shoin;1996:47-60DNA倍體和S期比例--指導治療[2]卵巢癌，乳腺癌，結(jié)腸癌，子宮內(nèi)膜癌，原發(fā)部位不明的癌癥--早期(I/II期)DNA倍體和DNA指數(shù)--預后長期和無病生存期[2]卵巢癌--晚期2.TheRecommendMedicareNationalCoveragePolicyforFlowCytometry.HCFAWebsite,1999-62-DNA含量分析70%人類癌癥中存在著異倍體或細胞周期-63-P53/Bcl-2-63-P53/B-64-P53乳腺癌

與病理學分級有關(guān),并與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)大腸腫瘤

早期發(fā)現(xiàn)大腸癌胃癌

與預后相關(guān)肝細胞癌

與組織分級,腫瘤預后,轉(zhuǎn)移及腫瘤大小密切相關(guān)-64-P53乳腺癌與病理學分級有關(guān),并與乳腺癌-65-Bcl-2Bcl-2在正常組織中的表達

造血系統(tǒng)細胞—淋巴,單核細胞等受激素或生長因子調(diào)節(jié)的腺上皮—前列腺上皮,子宮內(nèi)膜等干細胞或增值細胞—皮膚的基底細胞,腸上皮壽命長的分裂細胞—神經(jīng)元胚胎組織Bcl-2在腫瘤組織中的表達

腎臟腫瘤—腎癌,腎盂乳頭瘤,Wilms瘤,腎嗜酸細胞瘤前列腺癌

B細胞性淋巴瘤乳腺癌(43%)

甲狀腺癌-65-Bcl-2Bcl-2在正常組織中的表達造血-66-nm23nm23與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移及預后相關(guān)

肝細胞癌甲狀腺腫瘤乳腺癌結(jié)腸癌肉瘤-66-nm23nm23與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移及預后相關(guān)-67-CD44(CD44s/CD44v)-67-CD44(CD44s/CD44v)www.gotof-68-腫瘤多藥耐藥性(MDR)檢測P-gp在腫瘤組織中的表達

乳腺癌,膀胱癌,胃癌,食管癌,卵巢癌,前列腺癌等化療前高表達化療后高表達

腎細胞癌,結(jié)腸癌,肝癌,腎上腺皮質(zhì)癌,胰腺癌等化療前低表達

非何杰金氏淋巴瘤,成神經(jīng)細胞瘤,急性髓白血病等化療不敏感化療敏感化療不敏感-68-腫瘤多藥耐藥性(MDR)檢測P-gp在腫瘤組織中的表-69-乳腺癌石蠟切片脫臘ER(雌激素受體)ER抗體染色酶解流式檢測固定(多聚甲醛)破膜(70%甲醇)細胞-69-乳腺癌石蠟切片脫臘ER(雌激素受體)ER抗體染色酶解-70-Cyclin(細胞周期蛋白)-70-Cyclin(細胞周期蛋白)www.gotofcm.-71-細胞凋亡-71-細胞凋亡-72-細胞凋亡分析

-72-細胞凋亡分析-73-DNA斷裂-73-DNA斷裂-74-乳腺癌Fas/FasL與疾病慢性病毒性肝炎惡性腫瘤細胞-黑色素瘤、結(jié)腸癌、肺癌、肝癌等腦缺血后細胞凋亡自身免疫性疾病—系統(tǒng)性紅斑狼瘡Fas/FasL(CD95/CD95L)-74-乳腺癌Fas/FasL與疾病慢性病毒性肝炎惡性腫瘤細-75-乳腺癌Caspases早期細胞凋亡AnnexinV/PI-75-乳腺癌Caspases早期細胞凋亡AnnexinV-76-移植免疫-76-移植免疫-77-CD25高于正常值5-10%,表明即將或已發(fā)生排斥CD4/CD8比值下降提示并發(fā)兇險感染

<0.2時,必須停用免疫抑制劑CD2+HLA-DR+增加5-10%,且不伴有CD25的增加提示巨細胞病毒感染移植后免疫監(jiān)測-77-CD25高于正常值5-10%,表明即將或已發(fā)生排斥-78-血小板-78-血小板-79-血小板活化靜止血小板活化血小板-79-血小板活化靜止血小板活化血小板www.gotofcm-80-血小板活化-80-血小板活化-81-網(wǎng)織血小板ITP(特發(fā)性血小板減少癥)化療鑒別診斷骨髓移植-81-網(wǎng)織血小板ITP(特發(fā)性血小板減少癥)化療鑒別診斷骨-82-血小板計數(shù)新標準(間接雙平臺法)R=紅細胞數(shù)/血小板數(shù)(流式細胞術(shù))血小板數(shù)=紅細胞數(shù)(血球儀)/R(國際血液學標準化委員會(ICSH)/國際實驗血液學協(xié)會(ISLH)2001)

靈敏度高(1-400x109/L)，重復性好，室內(nèi)/室外變異系數(shù)均很小尤其應用于血小板預輸注病人的檢測(閾值:20x109/L)-82-血小板計數(shù)新標準(間接雙平臺法)R=紅細胞數(shù)/血-83-其它-83-其它-84-HLA-B27-84-HLA-B27-85-正常人患者HLA-B27-85-正常人患者HLA-B27www.gotofcm.c-86-細胞介導的細胞毒作用活靶細胞死靶細胞替代51Cr釋放實驗-86-細胞介導的細胞毒作用活-87-HLA-B27檢測CalibrationbeadsHLA-B27calibrationbeadsDecisionmarkerHLA—B27FITC（MFI)

-87-HLA-B27檢測Calibrationbeads-88-流式臨床應用發(fā)展白血病/淋巴瘤免疫分型HIV感染的CD4絕對計數(shù)CD34絕對計數(shù)/異體移植的免疫重建抗原特異性T細胞檢測樹突狀細胞（DC）循環(huán)微轉(zhuǎn)移腫瘤細胞IIIIIIIVMartiGE,MaryaliceSS,etal.IntroductiontoFlowcytometry.SeminarsinHematology,2001;38(2):93-99-88-流式臨床應用發(fā)展白血病-89-

流式微球分析

CytometricBeadArray（CBA）-89-

流式微球分析CytometricBeadAr-90-CBA與ELISA相比優(yōu)點

“多元”和“同步”檢測

樣本量少

靈敏度相似穩(wěn)定性好

-90-CBA與ELISA相比優(yōu)點

91

以上有不當之處，請大家給與批評指正，謝謝大家！91流式細胞儀在臨床檢測和臨床科研中的應用李柏青蚌埠醫(yī)學院免疫學教研室流式細胞儀在臨床檢測和臨床科研中的應用李柏青-93-流式細胞儀和流式細胞術(shù)－概述流式細胞儀的工作原理和測量參數(shù)流式細胞儀在臨床檢測和科研中的應用免疫學檢測和科研應用血液病檢測和科研應用腫瘤學檢測和科研應用流式細胞儀的基本工作原理以及在基礎(chǔ)和臨床科研中的應用-2-流式細胞儀和流式細胞術(shù)－概述流式細胞儀的基本工作原理以-94-一、流式細胞儀和流式細胞術(shù)的基本概念流式細胞儀(FlowCytometer，F(xiàn)CM):是集合光電子物理，光電測量技術(shù)，液流技術(shù)，計算機技術(shù)等現(xiàn)代高科技技術(shù)為一體的細胞測量和分析儀器。-3-一、流式細胞儀和流式細胞術(shù)的基本概念流式細胞儀(Flo-95-一、流式細胞儀和流式細胞術(shù)的基本概念流式細胞術(shù)(FlowCytometry，F(xiàn)CM):是應用流式細胞儀，對處于快速流動液體中的細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速測量和定量分析，以及分選的技術(shù)。-4-一、流式細胞儀和流式細胞術(shù)的基本概念流式細胞術(shù)(Flo-96-一、流式細胞儀和流式細胞術(shù)－特點多參數(shù)測量和分析（散射光和熒光）；快速測量和分析每秒可達1000-10000個細胞分選純度可達99%以上。獲取的數(shù)據(jù)分析結(jié)果更具有統(tǒng)計學意義；通常測量的對象如各種細胞細胞必須處在單個細胞懸液中。此外，也可測量微生物等生物顆粒，或者工合成微球非生物顆粒，-5-一、流式細胞儀和流式細胞術(shù)－特點多參數(shù)測量和分析（散射-97-臺式機——FACSCalibur雙激光

488nm 635nm四熒光參數(shù)分選、濃縮系統(tǒng)-6-臺式機——FACSCalibur雙激光987-99-大型機——FACSVantageSE科研型八熒光參數(shù)高速分選多路分選-8-大型機——FACSVantageSE-100-

流式細胞儀與熒光顯微鏡比較

流式細胞儀熒光顯微鏡

流動的細胞靜止的細胞樣本數(shù)量大數(shù)量少高速分選樣本難以再利用細胞群體特征量分布可揭示細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息-9-流式細胞儀與熒光顯微鏡比較流式細胞儀-101-二、流式細胞儀的工作原理和測量參數(shù)光路系統(tǒng)：

激光光源，光路系統(tǒng)（透鏡、濾光片）電子系統(tǒng)：光電倍增管（PMT），補償電路液流系統(tǒng)：

鞘液系統(tǒng)，樣品流動系統(tǒng)數(shù)據(jù)系統(tǒng)：計算機，數(shù)據(jù)測量和分析軟件。細胞分選系統(tǒng)（一）流式細胞儀的結(jié)構(gòu)

-10-二、流式細胞儀的工作原理和測量參數(shù)光路系統(tǒng)：（一）-102-流式細胞儀－光路系統(tǒng)激光(Laser)是一種相干光源，它能提供單一波長、單一方向、同步的穩(wěn)定光照激光波長:488nm,635nm光收集系統(tǒng)是由若干組透鏡,濾波片,小孔組成，將產(chǎn)生的光信號引導至檢測器-11-流式細胞儀－光路系統(tǒng)激光(Laser)是一種相干光-103-光路系統(tǒng)-12-光路系統(tǒng)-104-InjectorTip-13-Injector-105-InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid-14-InjectorFluorescencesigna-106-流式細胞儀－光學系統(tǒng)激發(fā)光源與熒光標記物-15-流式細胞儀－光學系統(tǒng)激發(fā)光源與熒光標記物-107-光學檢測信號-16-光學檢測信號-108-流式細胞儀的光學系統(tǒng)FACSCalibur-17-流式細胞儀的光學系統(tǒng)FACSCalibur-109-流式細胞儀－液流系統(tǒng)-18-流式細胞儀－液流系統(tǒng)-110-液流系統(tǒng)：鞘液系統(tǒng)＋樣品流動系統(tǒng)-19-液流系統(tǒng)：鞘液系統(tǒng)＋樣品流動系統(tǒng)-111-流式細胞儀的電子系統(tǒng)

信號檢測和分析當細胞攜帶熒光素,通過激光照射區(qū),受到激發(fā)產(chǎn)生不同波長的、代表細胞內(nèi)不同物質(zhì)的熒光信號熒光信號由光電接收器接收，轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖信號，電脈沖信號經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號數(shù)字信號傳送到計算機，進行儲存、作圖和統(tǒng)計分析-20-流式細胞儀的電子系統(tǒng)信號檢測和分析-112-數(shù)據(jù)系統(tǒng)-21-數(shù)據(jù)系統(tǒng)-113-（二）流式細胞儀可檢測的細胞參數(shù)細胞結(jié)構(gòu)細胞大小細胞顆粒性程度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量細胞功能細胞表面蛋白抗原細胞胞漿內(nèi)蛋白性抗原細胞內(nèi)細胞因子細胞增殖細胞內(nèi)鈣離子濃度二、流式細胞儀的工作原理和測量參數(shù)-22-（二）流式細胞儀可檢測的細胞參數(shù)細胞結(jié)構(gòu)細胞功能二-114-（二）流式細胞儀可檢測的細胞的參數(shù)：

散射光信號前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

入射光的前向

(5)散射光信號,可反映：細胞相對大小及其表面積側(cè)向角散射光（SSC,SideScatter）

入射光90角的散射光信號，可反映：細胞顆粒性程度

（胞內(nèi)成分和構(gòu)造和表面結(jié)構(gòu)的復雜性）-23-（二）流式細胞儀可檢測的細胞的參數(shù)：

-115-散射光信號前向角散射光－FSCFALSSensorLaser-24-散射光信號前向角散射光－FSCFALSSensor-116-散射光信號側(cè)向角散射光－SSCFALSSensor90LSSensorLaser-25-散射光信號側(cè)向角散射光－SSCFALSSensor-117-流式細胞的基本信息:“形態(tài)”-26-流式細胞的基本信息:“形態(tài)”-118--27--119-外周全血細胞（紅細胞溶解后）

以散射光表示的雙參數(shù)點圖-28-外周全血細胞（紅細胞溶解后）

-120-外周全血細胞（紅細胞溶解后）

以散射光表示的雙參數(shù)點圖中性粒細胞單核細胞淋巴細胞-29-外周全血細胞（紅細胞溶解后）

-121-（二）流式細胞檢測細胞參數(shù):

特征信息－熒光（Fluorescence）信號熒光素吸收激光（激發(fā)光波長）能量熒光素將吸收能量釋放，轉(zhuǎn)換為釋放較入射光波長更長的光量子（發(fā)射光波長）熒光素與特異抗體結(jié)合（熒光抗體）熒光抗體與細胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生熒光信號越強 熒光素與細胞核酸結(jié)合，熒光強度反映核酸含量-30-（二）流式細胞檢測細胞參數(shù):

特征信息－熒光（F-122-（二）流式細胞檢測細胞參數(shù):

特征信息－熒光（Fluorescence）信號Forwardscatter(FSC)Sidescatter(SSC)FL1（第一熒光）-FITC(異硫氰酸熒光素）FL2（第二熒光）-PE（藻紅蛋白）FL3（第三熒光）-PerCP,PeCy5等PL4（第四熒光）-APC（藻青蛋白）-31-（二）流式細胞檢測細胞參數(shù):

特征信息－熒光（F-123-熒光信號FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)-32-熒光信號FluorescenceFALSSenso-124--33--125-熒光信號雙色直接染色-34-熒光信號雙色直接染色-126-（三）流式細胞儀分析數(shù)據(jù)常見圖形：

（二維）點陳圖(DotPlot)適用于：雙參數(shù)分析-35-（三）流式細胞儀分析數(shù)據(jù)常見圖形：

（二維）點陳圖-127-（三）流式細胞儀分析數(shù)據(jù)常見圖形：

直方圖(HistogramPlot)適用于：單參數(shù)分析僅需要觀察某個熒光強度的變化-36-（三）流式細胞儀分析數(shù)據(jù)常見圖形：

直方圖(Hi-128-流式細胞術(shù)檢測細胞的熒光標記方法單標：

一種單抗:FL1,FSC,SSC（三參數(shù)）雙標：兩種單抗：FL1,FL1,FSC,SSC（四參數(shù)）三標：三種單抗：FL1,FL2,FL3,FSC,SSC（五參數(shù)）四標－四種熒光標記抗體：四種單抗：FL1,FL2,FL3,FL4,FSC,SSC（六參數(shù)）-37-流式細胞術(shù)檢測細胞的熒光標記方法單標：-129-淋巴細胞亞群分析細胞凋亡

腫瘤學移植免疫三流式細胞儀在臨床檢測和科研中的應用血小板其它-38-淋巴細胞亞群分析細胞凋亡腫瘤學移植免疫三-130-淋巴細胞亞群分析-39-淋巴細胞亞群分析-131-AdhesionMetabolic-40-AdhesionMetabolic-132--41--133--42--134-

T淋巴細胞淋巴細胞亞群檢測：

Tcells,Tsubsets,NKcells,Bcells-43-T淋巴細胞淋巴細胞亞群檢測：-135-淋巴細胞亞群T淋巴細胞(CD3+)名稱功能CD3+CD4+輔助性/誘導性T細胞(Th/Ti)輔助和誘導細胞免疫和體液免疫CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-輔助性T細胞(Th)誘導性T細胞(Ti)輔助細胞免疫和體液免疫誘導細胞免疫和體液免疫CD3+CD8+抑制性/殺傷性T細胞(Ts/Tc)抑制免疫反應/殺傷異源細胞CD3+CD8+CD28-CD3+CD4+CD29-抑制性T細胞(Ts)殺傷性T細胞(Tc)抑制細胞和體液免疫細胞毒性T細胞CD3+CD4+CD8+活化的T細胞在T細胞惡性增生時升高CD3+CD4-CD8-有調(diào)節(jié)功能的T細胞,其表達/T細胞受體(TCR/)CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO-幼稚的/靜止的T淋巴細胞當免疫系統(tǒng)沒有能力更新輔助性或抑制性/細胞毒性淋巴細胞的祖細胞時此細胞亞群較低CD45RA-CD45RO+記憶性T淋巴細胞病菌感染時升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化的T細胞,感染時升高感染時升高-44-淋巴細胞亞群T淋巴細胞(CD3+)名稱功能-136-淋巴細胞亞群活化T淋巴細胞名稱功能CD3+HLA-DR+活化T細胞CD4+HLA-DR+活化的輔助性/誘導性T細胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細胞CD4+CD25+活化的輔助性/誘導性T細胞CD8+CD25+CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細胞在病毒感染的患者中增加;其增加意味著HIV患者的預后較差B淋巴細胞(19+)CD19+CD23+活化的B細胞過敏患者中升高CD19+CD5+在自身免疫性疾病中升高CD19+CD5+CD23+慢性B細胞白血病及單克隆B淋巴細胞NK細胞CD3+CD(16+56)+自身免疫性疾病時降低,而病毒感染時升高CD3+CD57+CMV(巨細胞病毒)感染的強烈征兆-45-淋巴細胞亞群活化T淋巴細胞名稱功-137-淋巴細胞亞群與疾病疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡類風濕性關(guān)節(jié)炎自身免疫性溶血性貧血重癥肌無力免疫缺陷病愛滋病病毒感染傳染性單核細胞增多癥慢性活動性肝炎活動性肝硬化腫瘤消化道癌,肝癌,肺癌再生障礙性貧血粒細胞減少癥-46-淋巴細胞亞群與疾病疾病CD3CD4CD8-138-淋巴細胞亞群檢測意義疾病機理研究

疾病輔助診斷移植后免疫檢測治療方案的確定及療效評價CD25高于正常值5-10%,表明即將或已發(fā)生排斥CD4/CD8比值下降提示并發(fā)兇險感染

<0.2時,必須停用免疫抑制劑CD2+HLA-DR+增加5-10%,且不伴有CD25的增加,提示巨細胞病毒感染慢性疲勞,感染后綜合征,纖維肌痛,類風濕性關(guān)節(jié)炎,過敏等

疾病預防-47-淋巴細胞亞群檢測意義疾病機理研究疾病輔助診斷移植后-139-淋巴細胞亞群檢測意義

Control（n=20)ActiveSLE(n=17)StableSLE(n=13)CD370.4±5.8765.8±10.968.5±8.95CD435.0±5.7022.1±4.15**34.5±4.23CD827.9±5.7345.7±9.58**32.7±9.01CD4/CD81.27±0.140.43±0.12**1.05±0.26*NK17.8±5.484.37±3.31**7.59±5.01**鑒別活動期和非活動期SLE-48-淋巴細胞亞群檢測意義Control（n=20)A-140-HIVANDAIDS-49-HIVANDAIDS-141-Th1/Th2細胞-50-Th1/Th2細胞-142-Th1/Th2細胞Th1型細胞因子介導細胞免疫反應引起遲發(fā)型過敏反應、巨噬細胞活化、局部炎癥刺激來源：病毒、某些細菌Th2型介導體液免疫反應引起B(yǎng)細胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、促進I型變態(tài)反應（過敏反應）刺激來源：多細胞寄生蟲、過敏原-51-Th1/Th2細胞Th1型細胞因子介導細胞免疫反應-143-Th1/Th2細胞PMA+Ionomycin刺激4-6hr-52-Th1/Th2細胞PMA+Ionomycin刺激4-144-流式細胞儀檢測胞內(nèi)細胞因子

新鮮分離PBMC

加PMA＋Io刺激后6h測定胞內(nèi)細胞因子IL-4和IFN-g

檢測免疫細胞表型和結(jié)合檢測胞內(nèi)細胞因子：操作和分析方法；

-53-流式細胞儀檢測胞內(nèi)細胞因子新鮮分離PBMC檢測免-145-四色標記胞內(nèi)因子FCM檢測-54-四色標記胞內(nèi)因子FCM檢測-146-Th1/Th2失衡相關(guān)疾病嗜酸性細胞增多和IgE升高相關(guān)疾病

Ommen’sSyndrome(Ommen’s綜合征)HyperosinophilicSyndrome(高嗜曙紅細胞綜合征)Kimura’sDisease(Kimura’s疾病)Well’sSyndrome(Well’s綜合征)傳染病

病毒性疾病

人類免疫缺陷性病毒感染和愛滋病(AIDS)

麻疹

呼吸道合胞體病毒感染

慢性活動性乙型肝炎病毒感染

分枝桿菌和其它細菌感染

麻瘋病/肺結(jié)核

鳥結(jié)核分枝桿菌復合感染滑膜炎反應性關(guān)節(jié)炎

淋病和梅毒

-55-Th1/Th2失衡相關(guān)疾病嗜酸性細胞增多和IgE升高-147-Th1/Th2失衡相關(guān)疾病寄生蟲病

原寄生蟲感染：皮膚和內(nèi)臟利什曼病

蠕蟲?。航z蟲病和血吸蟲病真菌性疾病

過敏性支氣管肺霉菌病

念珠菌病

隱球菌病

類球孢子菌病球孢子菌病

組織胞漿菌病惡性腫瘤

皮膚基底細胞和鱗細胞癌

SezarySyndrome(Sezary綜合征)

淋巴瘤

EBV相關(guān)的B細胞和非何杰金氏淋巴瘤

何杰金氏淋巴瘤

大細胞退行性(CD30+)淋巴瘤

多發(fā)性骨髓瘤和Castleman’s綜合征

卡氏肉瘤-56-Th1/Th2失衡相關(guān)疾病寄生蟲病www.gotof-148-Th1/Th2失衡相關(guān)疾病變應性疾病

皮膚性哮喘

變應性哮喘

春季結(jié)膜炎炎性和自身免疫性疾病

巨細胞(暫時性的)動脈炎

系統(tǒng)性紅斑狼瘡

類風濕性關(guān)節(jié)炎

自身免疫性甲狀腺疾病

類肉瘤病

銀屑病(牛皮癬)IgA腎病

多發(fā)性硬化-57-Th1/Th2失衡相關(guān)疾病變應性疾病www.goto-149-Th1/Th2細胞檢測意義疾病治療發(fā)病機制研究使用Th1和Th2相關(guān)的細胞因子

IFN-治療麻瘋病

用抗Th1和Th2相關(guān)細胞因子或其受體的抗體

抗IL-4抗體治療真菌和寄生蟲感染

使用調(diào)節(jié)Th2/Th2細胞因子平衡的藥物:

薩力多胺(Thaliodomide)治療巨細胞動脈炎疾病治療監(jiān)測-58-Th1/Th2細胞檢測意義疾病治療發(fā)病機制研究使用T-150-

腫瘤學-59-腫瘤學-151-腫瘤發(fā)生發(fā)展-60-腫瘤發(fā)生發(fā)展-152-02004006008001000PI熒光強度(DNA含量)DNA含量分析2N4NCountsG0/G1G2/MS異倍體-61-02004006008001000PI熒光-153-DNA含量分析70%人類癌癥中存在著異倍體或細胞周期的改變1.RossJS.DNAPloidyandCellCycleAnalysisinPathology.NewYork:Igaku-Shoin;1996:47-60DNA倍體和S期比例--指導治療[2]卵巢癌，乳腺癌，結(jié)腸癌，子宮內(nèi)膜癌，原發(fā)部位不明的癌癥--早期(I/II期)DNA倍體和DNA指數(shù)--預后長期和無病生存期[2]卵巢癌--晚期2.TheRecommendMedicareNationalCoveragePolicyforFlowCytometry.HCFAWebsite,1999-62-DNA含量分析70%人類癌癥中存在著異倍體或細胞周期-154-P53/Bcl-2-63-P53/B-155-P53乳腺癌

與病理學分級有關(guān),并與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)大腸腫瘤

早期發(fā)現(xiàn)大腸癌胃癌

與預后相關(guān)肝細胞癌

與組織分級,腫瘤預后,轉(zhuǎn)移及腫瘤大小密切相關(guān)-64-P53乳腺癌與病理學分級有關(guān),并與乳腺癌-156-Bcl-2Bcl-2在正常組織中的表達

造血系統(tǒng)細胞—淋巴,單核細胞等受激素或生長因子調(diào)節(jié)的腺上皮—前列腺上皮,子宮內(nèi)膜等干細胞或增值細胞—皮膚的基底細胞,腸上皮