腫瘤標志物篩選策略與新腫瘤標志物課件

腫瘤標志物研究策略

及新腫瘤標志物腫瘤標志物研究策略

及新腫瘤標志物1腫瘤標志物

腫瘤細胞所產生或分泌的某種蛋白質或其它物質，與腫瘤的存在和發(fā)展密切關系。

可用于腫瘤的篩查、診斷、治療療效監(jiān)測和預后判斷。常見分類法:

蛋白類糖蛋白類酶類激素類核酸類腫瘤標志物

腫瘤細胞所產生或分泌的某種蛋白質或其2

腫瘤特異性抗原(tumorspecificantigen,TSA)

僅存在于某種腫瘤細胞表面，而不存在于相應正常組織細胞或其它腫瘤細胞表面的抗原。

腫瘤相關性抗原(tumor-associatedantigen,TAA)

腫瘤細胞和正常組織細胞都表達的抗原物質，只是其含量在細胞癌變時明顯升高，僅表現為量的變化，無嚴格腫瘤特異性，如胚胎抗原，分化抗原等。

腫瘤特異性抗原(tumorspecificantige3理想的腫瘤標志物1.靈敏度高：可以用于腫瘤早期發(fā)現、早期診斷2.特異性好：腫瘤為陽性，而非腫瘤時為陰性3.能對腫瘤進行定位：具有器官特異性4.與疾病的嚴重程度：腫瘤大小，分期有關5.監(jiān)測腫瘤的療效6.監(jiān)測腫瘤的復發(fā)7.預測腫瘤的預后理想的腫瘤標志物1.靈敏度高：可以用于腫瘤早期發(fā)現、早期診4理想是美好的，道路是曲折的理想狀態(tài)實際狀態(tài)理想是美好的，道路是曲折的理想狀態(tài)實際狀態(tài)5腫瘤太狡猾腫瘤細胞異質性大腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程復雜多基因多因素參與理想腫瘤標志物任重而道遠！腫瘤太狡猾腫瘤細胞異質性大6腫瘤標志物的篩選和研發(fā)策略腫瘤標志物的篩選和研發(fā)策略7腫瘤標志物的篩選和研發(fā)策略美國國立癌癥研究員制定的五個階段一、臨床前探索性研究二、臨床方法檢測已有疾病三、縱向回顧性分析研究四、前瞻性篩查研究五、控癌研究腫瘤標志物的篩選和研發(fā)策略美國國立癌癥研究員制定的五個階段8一、臨床前探索性研究

尋找新的腫瘤標志物研究標本1.腫瘤組織與非腫瘤組織2.腫瘤細胞株與正常細胞株研究使用的方法技術1.組織芯片2.基因芯片3.蛋白質差異表達比較4.單克隆抗體技術一、臨床前探索性研究

尋找新的腫瘤標志物9一、臨床前探索性研究

尋找新的腫瘤標志物研究標本1.腫瘤組織與非腫瘤組織2.腫瘤細胞株與正常細胞株研究使用的方法技術1.組織芯片2.基因芯片3.蛋白質差異表達比較4.單克隆抗體技術差異比較一、臨床前探索性研究

尋找新的腫瘤標志物差異比較10組織芯片是生物芯片技術的一個重要分支，是將許多不同個體組織標本以規(guī)則陣列方式排布于同一載玻片上，進行同一指標的原位組織學研究。組織芯片是生物芯片技術的一個重要分支，是將許多11①選取所需蠟塊,常規(guī)切片做HE染色,顯微鏡下確定目標區(qū)并做定位標記。1組織芯片制備過程①選取所需蠟塊,常規(guī)切片做HE染色,顯微鏡下1組織芯片12②采用組織芯片儀在受體蠟塊上打孔,并精確排成微孔陣列。③在做標記的蠟塊上鉆取組織柱,按設計方案移到受體蠟塊上。②采用組織芯片儀在受體蠟塊上打孔,并精確排成微孔陣列。13④把設計好的蠟塊放入溫箱,根據蠟質,調定溫箱溫度,在半融狀態(tài)下取出,室溫冷卻,放入4℃冰箱中備用。⑤借助特定切片輔助系統(tǒng)—粘著包被帶卷片系統(tǒng),對組織芯片蠟塊連續(xù)切片。切片厚度2～3μm,一般可切片50～100張。④把設計好的蠟塊放入溫箱,根據蠟質,調定溫箱14腫瘤標志物篩選策略與新腫瘤標志物課件15

各種不同低、中、高密度組織芯片1,2是低密度組織芯片（組織點<200）。3,4,5,6是中密度組織芯片(組織點200-600)。7,8是高密度組織芯片(組織點>600)各種不同低、中、高密度組織芯片1,2是低密度組織芯片16基因芯片基因芯片的測序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的核苷酸的探針?；蛐酒蛐酒臏y序原理是雜交測序方法，即通17DNA芯片DNA芯片186400點的基因芯片（面積12X14mm)6400點的基因芯片19蛋白質差異表達比較

二維電泳蛋白質比較研究的質譜相關技術SELDI蛋白質芯片技術蛋白質差異表達比較

二維電泳201.Expressionproteomics(表達蛋白組學)ThestudyofglobalchangesinproteinexpressionProteomics2.Cell-mapproteomics（細胞圖譜蛋白組學）Thesystematicstudyofprotein-proteininteractionsthroughtheisolationofproteincomplexes蛋白質差異表達比較

Proteomics2.Cell-mapproteomic21

雙向凝膠電泳是利用不同蛋白質的物理、化學性質的差異，把復雜蛋白混合物中的蛋白質在二維平面上展開。第一向等電聚焦:等電點第二向SDS：分子量二維電泳

雙向凝膠電泳是利用不同蛋白質的物理、化學性質的22腫瘤標志物篩選策略與新腫瘤標志物課件23蛋白質比較研究的質譜相關技術

基質輔助激光解吸電離技術MALDI

(Matrix-assistedlaserdesorption/ionization)電噴霧電離質譜術

ESI（Electrosprayionisation）蛋白質比較研究的質譜相關技術

基質輔助激光解吸電離技術MAL24單克隆抗體技術的核心是用骨髓瘤細胞與經特定抗源免疫刺激的B淋巴細胞融合得到雜交瘤細胞，雜交瘤細胞既能象骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細胞產生特異性抗體的能力。單克隆抗體技術單克隆抗體技術的核心是用骨髓瘤細胞與經特定抗源免疫刺25腫瘤標志物篩選策略與新腫瘤標志物課件26單克隆抗體技術1.使用腫瘤細胞免疫動物后，得到的雜交瘤細胞產生的抗體，反過來尋找抗原。2.在腫瘤細胞中驗證單克隆抗體技術1.使用腫瘤細胞免疫動物后，得到的雜交瘤細胞產27新腫瘤標志物

1.HE42.GP733.Her-24.Pepsinogen5.S1006.PRO-GRP新腫瘤標志物

1.HE428HE4屬于乳清酸性4-二硫化中心（WFDC）蛋白家族.HE4首先在附睪遠端的上皮中被發(fā)現，并且最初認為它是一種與精子成熟相關的蛋白酶抑制劑。一分泌型HE4已經在卵巢癌患者的血清中檢測到有高水平表達。HE4屬于乳清酸性4-二硫化中心（WFDC）蛋白家族.29GP73GP73是存在于高爾基體的一種跨膜蛋白。2000年Kladney研究表明，在正常的人體肝組織中，GP73主要由膽管上皮細胞表達，而肝細胞表達很少甚至不表達。肝細胞受到病毒感染后可引起GP73的表達上調。2005年Block等發(fā)現，在肝癌患者血清中GP73水平顯著升高。在一項研究中，與肝硬化患者相比，144例肝癌患者的血清GP73水平顯著升高。GP73診斷肝癌的敏感性為69%，特異性為75%。GP73GP73是存在于高爾基體的一種跨膜蛋白。30人類表皮生長因子受體2-Her2Her2基因,即c-erbB-2基因，定位于染色體17q12-21.32上,編碼相對分子質量為185000的跨膜受體樣蛋白，具有酪氨酸激酶活性Her2陽性(過表達或擴增)的乳腺癌，其臨床特點和生物學行為有特殊表現，治療模式也與其他類型的乳腺癌有很大的區(qū)別，目前已有針對該基因失活的藥物赫賽?。℉erceptin）臨床意義：是重要的乳腺癌預后判斷因子用于指導赫賽汀治療選擇化療方案以及療效評價人類表皮生長因子受體2-Her2Her2基因,即c-erbB31胃蛋白酶原-pepsinogen

胃蛋白酶原是由胃粘膜分泌的胃蛋白酶前體PGI僅存在于胃底和胃體部粘膜的主細胞、頸粘液細胞，而PGII則分布于全胃及十二指腸的Burnner腺細胞，均可在血清與尿液中測出胃癌患者PGI的含量及PGI/PGII比值均明顯降低，測定PGI水平與PGI/PGII比值可作為胃癌診斷的一個輔助指標PGI與胃酸的分泌存在平行關系。PGI水平和PGI/PGII的比值能夠反映胃粘膜的功能狀態(tài)，并且與胃粘膜萎縮的范圍及嚴重程度顯著相關。鑒于中、重度萎縮性胃炎與腸型胃癌的發(fā)生關系密切，PGI或PGI/PGII比值明顯降低預示患腸型胃癌的危險因素增加胃蛋白酶原-pepsinogen

胃蛋白酶原是由胃粘膜分泌的32S100

S100蛋白分子量為10.5KD的鈣結合蛋白S100A1和S100B是最先發(fā)現的成員。由中樞神經系統(tǒng)細胞表達，特別是星形膠質細胞、黑色素瘤細胞和其他一些組織也有表達臨床意義：惡性黑色素瘤患者，特別是II、III和IV期的患者，血清S100濃度的升高提示疾病的進展，連續(xù)檢測有助于療效的評估多種類型的大腦損傷，腦脊液中S100的濃度會升高，并能釋放到血中，多種疾病導致的腦損傷，如腦外傷、中風和腦腫瘤的患者血清中能檢測出S100S100

S100蛋白分子量為10.5KD的鈣結合蛋白33胃泌素釋放肽前體-Pro-GRP神經內分泌組織異常分化所導致，外周循環(huán)中ProGRP的正常上限為50pg/ml血清ProGRP水平與肺癌的病理類型有著相關性，小細胞肺癌（SCLC）比非小細胞肺癌（NSCLC）具有更高的水平，ProGRP對小細胞肺癌有較高的敏感性ProGRP結合NSE對SCLC治療進行療效的監(jiān)測可用于SCLC的診斷,早期發(fā)現腫瘤復發(fā)部分慢性腎功能衰竭患者血清ProGRP也可升高，故臨床檢測時宜同時檢查患者的腎功能胃泌素釋放肽前體-Pro-GRP神經內分泌組織異常分化所導致34每年有很多新的腫瘤標志物報道期待更多的新的腫瘤標志物每年有很多新的腫瘤標志物報道35謝謝謝謝36腫瘤標志物研究策略

及新腫瘤標志物腫瘤標志物研究策略

及新腫瘤標志物37腫瘤標志物

腫瘤細胞所產生或分泌的某種蛋白質或其它物質，與腫瘤的存在和發(fā)展密切關系。

可用于腫瘤的篩查、診斷、治療療效監(jiān)測和預后判斷。常見分類法:

蛋白類糖蛋白類酶類激素類核酸類腫瘤標志物

腫瘤細胞所產生或分泌的某種蛋白質或其38

腫瘤特異性抗原(tumorspecificantigen,TSA)

僅存在于某種腫瘤細胞表面，而不存在于相應正常組織細胞或其它腫瘤細胞表面的抗原。

腫瘤相關性抗原(tumor-associatedantigen,TAA)

腫瘤細胞和正常組織細胞都表達的抗原物質，只是其含量在細胞癌變時明顯升高，僅表現為量的變化，無嚴格腫瘤特異性，如胚胎抗原，分化抗原等。

腫瘤特異性抗原(tumorspecificantige39理想的腫瘤標志物1.靈敏度高：可以用于腫瘤早期發(fā)現、早期診斷2.特異性好：腫瘤為陽性，而非腫瘤時為陰性3.能對腫瘤進行定位：具有器官特異性4.與疾病的嚴重程度：腫瘤大小，分期有關5.監(jiān)測腫瘤的療效6.監(jiān)測腫瘤的復發(fā)7.預測腫瘤的預后理想的腫瘤標志物1.靈敏度高：可以用于腫瘤早期發(fā)現、早期診40理想是美好的，道路是曲折的理想狀態(tài)實際狀態(tài)理想是美好的，道路是曲折的理想狀態(tài)實際狀態(tài)41腫瘤太狡猾腫瘤細胞異質性大腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程復雜多基因多因素參與理想腫瘤標志物任重而道遠！腫瘤太狡猾腫瘤細胞異質性大42腫瘤標志物的篩選和研發(fā)策略腫瘤標志物的篩選和研發(fā)策略43腫瘤標志物的篩選和研發(fā)策略美國國立癌癥研究員制定的五個階段一、臨床前探索性研究二、臨床方法檢測已有疾病三、縱向回顧性分析研究四、前瞻性篩查研究五、控癌研究腫瘤標志物的篩選和研發(fā)策略美國國立癌癥研究員制定的五個階段44一、臨床前探索性研究

尋找新的腫瘤標志物研究標本1.腫瘤組織與非腫瘤組織2.腫瘤細胞株與正常細胞株研究使用的方法技術1.組織芯片2.基因芯片3.蛋白質差異表達比較4.單克隆抗體技術一、臨床前探索性研究

尋找新的腫瘤標志物45一、臨床前探索性研究

尋找新的腫瘤標志物研究標本1.腫瘤組織與非腫瘤組織2.腫瘤細胞株與正常細胞株研究使用的方法技術1.組織芯片2.基因芯片3.蛋白質差異表達比較4.單克隆抗體技術差異比較一、臨床前探索性研究

尋找新的腫瘤標志物差異比較46組織芯片是生物芯片技術的一個重要分支，是將許多不同個體組織標本以規(guī)則陣列方式排布于同一載玻片上，進行同一指標的原位組織學研究。組織芯片是生物芯片技術的一個重要分支，是將許多47①選取所需蠟塊,常規(guī)切片做HE染色,顯微鏡下確定目標區(qū)并做定位標記。1組織芯片制備過程①選取所需蠟塊,常規(guī)切片做HE染色,顯微鏡下1組織芯片48②采用組織芯片儀在受體蠟塊上打孔,并精確排成微孔陣列。③在做標記的蠟塊上鉆取組織柱,按設計方案移到受體蠟塊上。②采用組織芯片儀在受體蠟塊上打孔,并精確排成微孔陣列。49④把設計好的蠟塊放入溫箱,根據蠟質,調定溫箱溫度,在半融狀態(tài)下取出,室溫冷卻,放入4℃冰箱中備用。⑤借助特定切片輔助系統(tǒng)—粘著包被帶卷片系統(tǒng),對組織芯片蠟塊連續(xù)切片。切片厚度2～3μm,一般可切片50～100張。④把設計好的蠟塊放入溫箱,根據蠟質,調定溫箱50腫瘤標志物篩選策略與新腫瘤標志物課件51

各種不同低、中、高密度組織芯片1,2是低密度組織芯片（組織點<200）。3,4,5,6是中密度組織芯片(組織點200-600)。7,8是高密度組織芯片(組織點>600)各種不同低、中、高密度組織芯片1,2是低密度組織芯片52基因芯片基因芯片的測序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的核苷酸的探針?；蛐酒蛐酒臏y序原理是雜交測序方法，即通53DNA芯片DNA芯片546400點的基因芯片（面積12X14mm)6400點的基因芯片55蛋白質差異表達比較

二維電泳蛋白質比較研究的質譜相關技術SELDI蛋白質芯片技術蛋白質差異表達比較

二維電泳561.Expressionproteomics(表達蛋白組學)ThestudyofglobalchangesinproteinexpressionProteomics2.Cell-mapproteomics（細胞圖譜蛋白組學）Thesystematicstudyofprotein-proteininteractionsthroughtheisolationofproteincomplexes蛋白質差異表達比較

Proteomics2.Cell-mapproteomic57

雙向凝膠電泳是利用不同蛋白質的物理、化學性質的差異，把復雜蛋白混合物中的蛋白質在二維平面上展開。第一向等電聚焦:等電點第二向SDS：分子量二維電泳

雙向凝膠電泳是利用不同蛋白質的物理、化學性質的58腫瘤標志物篩選策略與新腫瘤標志物課件59蛋白質比較研究的質譜相關技術

基質輔助激光解吸電離技術MALDI

(Matrix-assistedlaserdesorption/ionization)電噴霧電離質譜術

ESI（Electrosprayionisation）蛋白質比較研究的質譜相關技術

基質輔助激光解吸電離技術MAL60單克隆抗體技術的核心是用骨髓瘤細胞與經特定抗源免疫刺激的B淋巴細胞融合得到雜交瘤細胞，雜交瘤細胞既能象骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細胞產生特異性抗體的能力。單克隆抗體技術單克隆抗體技術的核心是用骨髓瘤細胞與經特定抗源免疫刺61腫瘤標志物篩選策略與新腫瘤標志物課件62單克隆抗體技術1.使用腫瘤細胞免疫動物后，得到的雜交瘤細胞產生的抗體，反過來尋找抗原。2.在腫瘤細胞中驗證單克隆抗體技術1.使用腫瘤細胞免疫動物后，得到的雜交瘤細胞產63新腫瘤標志物

1.HE42.GP733.Her-24.Pepsinogen5.S1006.PRO-GRP新腫瘤標志物

1.HE464HE4屬于乳清酸性4-二硫化中心（WFDC）蛋白家族.HE4首先在附睪遠端的上皮中被發(fā)現，并且最初認為它是一種與精子成熟相關的蛋白酶抑制劑。一分泌型HE4已經在卵巢癌患者的血清中檢測到有高水平表達。HE4屬于乳清酸性4-二硫化中心（WFDC）蛋白家族.65GP73GP73是存在于高爾基體的一種跨膜蛋白。2000年Kladney研究表明，在正常的人體肝組織中，GP73主要由膽管上皮細胞表達，而肝細胞表達很少甚至不表達。肝細胞受到病毒感染后可引起GP73的表達上調。2005年Block等發(fā)現，在肝癌患者血清中GP73水平顯著升高。在一項研究中，與肝硬化患者相比，144例肝癌患者的血清GP73水平顯著升高。GP73診斷肝癌的敏感性為69%，特異性為75%。GP73GP73是存在于高爾基體的一種跨膜蛋白。66人類表皮生長因子受體2-Her2Her2基因,即c-erbB-2基因，定位于染色體17q12-21.32上,編碼相對分子質量為185000的跨膜受體樣蛋白，具有酪氨酸激酶活性Her2陽性(過表達或擴增)的乳腺癌，其臨床特點和生物學行為有特殊表現，治療模式也與其他類型的乳腺癌有很大的區(qū)別，目前已有針對該基因失活的藥物赫賽?。℉erceptin）臨床意義：是重要的乳腺癌預后判斷因子用于指導赫賽汀治療選擇化療方案以及療效評價人類表皮生長因子受體2-Her2Her2基因,即c-erbB67胃蛋白酶原-pepsinogen

胃蛋白酶原是由