第二章微生物分類及微生物基本研究技術(shù)課件

第二章

微生物的分類鑒定及微生物的基本研究技術(shù)第二章

微生物的分類鑒定及微生物的基本研究技術(shù)1研究微生物的基本技術(shù)手段微生物的分類鑒定contents研究微生物的基本技術(shù)手段contents2第一節(jié)

微生物的基本研究技術(shù)一、無菌技術(shù)

在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時防止其被其它微生物污染的技術(shù)。微生物培養(yǎng)的常用器具的滅菌1.試管、三角瓶、平皿、玻璃燒瓶等——高溫干熱滅菌：160-180℃2h2.培養(yǎng)基的滅菌——濕熱滅菌：121℃15-30min3.接種工具——火焰灼燒無菌操作——微生物學(xué)研究中最常用的基本操作。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，用經(jīng)過滅菌的接種工具，在無菌的條件下接種含菌材料于培養(yǎng)基上，這一操作過程稱做無菌操作。接種的微生物不能釋放到環(huán)境中，防止環(huán)境污染。第一節(jié)微生物的基本研究技術(shù)一、無菌技術(shù)3培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿4高壓蒸汽自動滅菌鍋手提式高壓蒸汽滅菌鍋高壓蒸汽自動滅菌鍋手提式高壓蒸汽滅菌鍋5無菌操作箱無菌操作箱6無菌操作無菌操作7二、染色技術(shù)利用染料分子和細(xì)胞物質(zhì)的親和力，而使其牢固結(jié)合，使細(xì)胞呈現(xiàn)顏色，便于觀察、鑒別細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。染料是一種有機(jī)化合物，電離后形成帶有正電荷或負(fù)電荷的染料離子。微生物細(xì)胞表現(xiàn)出兩性電解質(zhì)的性質(zhì)細(xì)菌的等電點較低，pH值大約在2—5之間，故在中性、堿性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶陰電荷；G+比G-細(xì)菌對堿性染料的親和力高。二、染色技術(shù)利用染料分子和細(xì)胞物質(zhì)的親和力，而使其牢固結(jié)合，8根據(jù)電離后所帶電荷的性質(zhì)，染料分為：1、酸性染料：帶負(fù)電，與堿性物質(zhì)成鹽。如伊紅、剛果紅、苯胺黑、酸性復(fù)紅等2、堿性染料：帶正電，如美藍(lán)、結(jié)晶紫、孔雀綠、番紅等3、中性染料：酸性染料和堿性染料的結(jié)合，如吉姆薩染料4、單純?nèi)玖希哼@類物質(zhì)親和力低，不能和被染物成鹽，染色能力取決于能否溶于被染物。根據(jù)電離后所帶電荷的性質(zhì)，染料分為：9

簡單染色法

正染色革蘭氏染色法

鑒別染色法抗酸性染色法芽孢染色法死菌姬姆薩染色法細(xì)菌染色法負(fù)染色：莢膜染色法等

活菌：用美藍(lán)或TTC（氧化三苯基四氮唑）等作活菌染色染色方法：簡單染色法、鑒別染色法（復(fù)染色法）、負(fù)染色法簡10染色的基本程序

制片→染色→水洗→干燥→鏡檢。A.加小滴水

B.涂成薄層

C.固定菌體

涂片制備過程染色的基本程序制片→染色→水洗→干燥→鏡檢。A.加小滴11顯微鏡是微生物研究中的不可缺少的工具。顯微技術(shù)是微生物學(xué)研究的重要技術(shù)和基礎(chǔ)。三、顯微技術(shù)顯微鏡是微生物研究中的不可缺少的工具。三、顯微技術(shù)12顯微鏡的種類：普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡、掃描電鏡、透射電鏡。1.放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)×接目鏡放大倍數(shù)2.顯微鏡的分辨率是表示顯微鏡辨析物體（兩端）兩點之間距離的能力，可用公式表示為：D=λ/2n·sin(α/2)式中D：物鏡分辨出物體兩點間的最短距離。：可見光的波長（平均0.55m)n:物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折射率。：鏡口角（即入射角）。顯微鏡的種類：1.放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)×接目鏡放大倍數(shù)13（一）油鏡的使用原理：

油鏡的透鏡很小，光線通過玻片與油鏡頭之間的空氣時，因介質(zhì)密度不同，發(fā)生折射或全反射，使射入透鏡的光線減少，物象顯現(xiàn)不清。1.香柏油的折射率與玻璃接近（n=1.52），提高了視野的照明度。2.提高了顯微鏡的分辨率D=λ/2n·sin(α/2)光學(xué)顯微鏡油鏡的使用（一）油鏡的使用原理：

油鏡的透鏡很小，光線通過玻片14（二）油鏡頭的識別：

各接物鏡的放大率可由其外形辨認(rèn)，鏡頭長度越大，鏡片直徑越小，放大倍數(shù)大；反之，放大倍數(shù)小。油鏡頭長度大于低、高倍鏡，鏡頭下緣一般刻有一圈黑線或白線，并刻有100×、1.25或oil等字樣。

（三）油鏡的使用法：

1、使用顯微鏡油鏡時，必須將顯微鏡端正直立桌上，不得將鏡臂彎曲，使載物臺傾斜，以免香柏油流溢，影響觀察，污染臺面。

2、對光：

首先打開光圈，使光線集中于集光器。

一般用低倍鏡或高倍鏡觀察物象或用油鏡檢查不染色標(biāo)本時，需下降集光器并適當(dāng)?shù)乜s小光圈，使光度減弱；若用油鏡檢查染色標(biāo)本時，光度宜強(qiáng)。應(yīng)將顯微鏡亮度開關(guān)調(diào)至最亮，光圈完全打開，集光器上升至與載物臺相平。

（二）油鏡頭的識別：

各接物鏡的放大率可由其外形辨認(rèn)，153、調(diào)焦距：

A、將標(biāo)本片放載物臺上，用標(biāo)本推進(jìn)器固定，將欲檢部分移至接物鏡下。先用低倍鏡找出標(biāo)本的位置，然后提高鏡筒，在標(biāo)本的待檢部位滴鏡油一滴，再換油鏡觀察。

B、轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器使載物臺徐徐上升（或使鏡筒漸漸下降），直至油鏡頭浸沒至油中。此時眼睛應(yīng)從側(cè)面觀察，以免壓碎標(biāo)本片和損壞鏡頭。

C、然后雙眼移至接目鏡，一面從接目鏡觀察，一面反方向緩慢地轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器（下降載物臺，或上升鏡筒），當(dāng)出現(xiàn)模糊物象時，換用細(xì)調(diào)節(jié)器，轉(zhuǎn)動至物象清晰為止。

3、調(diào)焦距：16D、觀察完畢，應(yīng)先提高鏡筒，并將油鏡頭扭向一側(cè)，再取下標(biāo)本片。油鏡頭使用后，應(yīng)立即用擦鏡紙擦凈鏡頭上的油，再用擦鏡紙蘸少許二甲苯擦拭鏡頭，并隨即用干的鏡紙擦去殘存的二甲苯，以免二甲苯滲入，溶解用以粘固透鏡的膠質(zhì)物，造成鏡片移位或脫落D、觀察完畢，應(yīng)先提高鏡筒，并將油鏡頭扭向一側(cè)，再取下標(biāo)本片17四、接種技術(shù)接種技術(shù)是微生物學(xué)實驗及研究中的一項最基本的操作技術(shù)。接種是將純種微生物在無菌操作條件下移植到已滅菌并適宜該菌生長繁殖所需要的培養(yǎng)基中。為了獲得微生物的純種培養(yǎng)（指一株菌種或一個培養(yǎng)物中所有的細(xì)胞或孢子都是由一個細(xì)胞分裂、繁殖而產(chǎn)生的后代），要求接種過程中必須嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作，一般是在無菌室內(nèi)，超凈工作臺火焰旁或?qū)嶒炇一鹧媾赃M(jìn)行。四、接種技術(shù)接種技術(shù)是微生物學(xué)實驗及研究中的一項最基本的操作18根據(jù)不同的實驗?zāi)康募芭囵B(yǎng)方式可以采用不同的接種工具和接種方法。常用的工具有接種環(huán)、接種針、接種鏟、玻璃涂棒，移液管及滴管等。常用的方法有斜面接種，液體接種，穿刺接種和平板接種。根據(jù)不同的實驗?zāi)康募芭囵B(yǎng)方式可以采用不同的接種工具和19斜面接種斜面接種20穿刺接種操作過程示意圖穿刺接種操作過程示意圖21接種菌名及接種劃線方式、接種工具：細(xì)菌：如枯草桿菌，大腸桿菌，巨大芽孢桿菌接種方式：“之”字劃線，接種工具：接種環(huán)酵母菌：如釀酒酵母菌，假絲酵母菌接種方式：劃直線，接種工具：接種環(huán)霉菌：如黑曲霉，黃曲霉，根霉接種方式：點植或劃直線，接種工具：接種鉤或接種環(huán)接種菌名及接種劃線方式、接種工具：22各種無菌操作接種技術(shù)示意圖各種無菌操作接種技術(shù)示意圖23微生物的分離純化技術(shù)是指從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程。分離純化技術(shù)其實是進(jìn)行平板接種，即用接種環(huán)將菌種接至平板培養(yǎng)基上，或用移液管、滴管將一定體積的菌液移至平板培養(yǎng)基上，然后培養(yǎng)達(dá)到。平板接種的目的是觀察菌落形態(tài)，分離純化菌種，活菌計數(shù)及在平板上進(jìn)行各種實驗時采用的一種接種方法。五、分離純化技術(shù)微生物的分離純化技術(shù)是指從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種24平板（培養(yǎng)平板）：指熔化的固體培養(yǎng)基倒入無菌平皿，冷卻凝固后形成培養(yǎng)平板。培養(yǎng)物：在人為規(guī)定的條件下培養(yǎng)、繁殖得到的微生物群體稱為培養(yǎng)物。純培養(yǎng)物：只有一種微生物的培養(yǎng)物。純培養(yǎng)技術(shù)：把特定的微生物從自然界混雜存在的狀態(tài)中分離、純化出來的培養(yǎng)技術(shù)。以無菌操作方法獲得純培養(yǎng)是微生物學(xué)獨有的技術(shù)，對微生物學(xué)的發(fā)展有非常重要的意義。一、幾個概念平板（培養(yǎng)平板）：指熔化的固體培養(yǎng)基倒入無菌平皿，冷卻凝固后25第二章微生物分類及微生物基本研究技術(shù)課件26二、微生物的分離純化方法：（1）平板劃線法（2）稀釋倒平板法（3）稀釋涂布法（4）選擇培養(yǎng)分離法（5）單細(xì)胞挑取法（6）利用環(huán)境條件控制法二、微生物的分離純化方法：27平板劃線分離操作法示意圖平板劃線分離法：平板劃線分離操作法示意圖平板劃線分離法：28平板劃線菌落分離效果圖平板劃線菌落分離效果圖29稀釋倒平板法稀釋倒平板法30稀釋涂布法稀釋涂布法31選擇培養(yǎng)分離法---選擇培養(yǎng)基利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行直接分離比如：分離產(chǎn)蛋白酶菌株——在培養(yǎng)基中添加牛奶或酪素，觀察是否產(chǎn)生蛋白水解圈。選擇培養(yǎng)分離法---選擇培養(yǎng)基32單細(xì)胞挑取法單細(xì)胞挑取法33利用環(huán)境條件控制法溫度——嗜熱菌、嗜冷菌pH——耐酸、耐堿微生物滲透壓——耐鹽、糖利用環(huán)境條件控制法34二元培養(yǎng)：

以某種微生物的純培養(yǎng)為食物（或寄主）來進(jìn)行另外一種微生物的純培養(yǎng)、稱二元培養(yǎng)。二元培養(yǎng)：

以某種微生物的純培養(yǎng)為食物（或寄主）來進(jìn)行另外35什么是微生物分類學(xué)(microbialtaxonomy):按照微生物的親緣關(guān)系將其安排成條理清楚的各種分類單元和分類群的科學(xué)微生物分類的目的把各種微生物按照它們的親緣關(guān)系分群歸類，排成系統(tǒng)，以便于人們對微生物進(jìn)行鑒定和交流第二節(jié)微生物的分類鑒定什么是微生物分類學(xué)(microbialtaxonomy):按36微生物分類學(xué)的主要任務(wù)分類(classification)即根據(jù)相似性或親緣關(guān)系,將一個有機(jī)體放在一個單元中命名(nomenclature)鑒定(identification)確定一個新的分類物是否歸屬于已經(jīng)命名的分類單元的過程微生物分類學(xué)的主要任務(wù)分類(classification)命37一、微生物的分類單位界Kingdom門Phylum綱Class目Order科Family屬Genus種Species種以上的系統(tǒng)分類單元自上而下可依次分為7個等級：一、微生物的分類單位界Kingdom種以上的系統(tǒng)分類單元自上38種是最基本的分類單位,它是一大群表型特征高度相似，親緣關(guān)系極其相近，與同屬內(nèi)其它種有著明顯差異的菌株的總稱?，F(xiàn)代分類學(xué)上規(guī)定種內(nèi)菌株的DNA同源性≧70%

常用的幾種分類概念種是最基本的分類單位,它是一大群表型特征高度相似，親緣關(guān)系39新種（speciesnova，sp.nov或novsp.）是指權(quán)威性的分類、鑒定手冊中從未記載過的一種新分離并鑒定過的微生物。

按《國際命名法規(guī)》對它命名并在規(guī)定的學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表時，應(yīng)在其學(xué)名后附上“sp.nov”符號。在新種發(fā)表前，其模式菌株的培養(yǎng)物就應(yīng)存放在一個永久性的可靠的菌種保藏機(jī)構(gòu)中，并允許研究人員取得該菌種。新記錄種新種（speciesnova，sp.nov或novsp.40亞種(變種)當(dāng)某一個種內(nèi)的不同菌株存在少數(shù)明顯而穩(wěn)定的變異特征或遺傳性狀而又不足以區(qū)分成新種時，可以將這些菌株細(xì)分成兩個或更多的小的分類單元--亞種。亞種(變種)41型(form或type)常指亞種以下的細(xì)分。當(dāng)同種或同亞種不同菌株之間的性狀差異，不足以分為新的亞種時，可以細(xì)分為不同的型。例如抗原特征的差異分為不同的血清型。型(form或type)42菌株(品系)(strain):

表示任何由一個獨立分離的單細(xì)胞繁殖成的純遺傳型群體及其一切后代。菌株名稱常用數(shù)字編號、字母、人名、地名等表示。如枯草桿菌AS1.398(BacillussubtilisAS1.398)和枯草桿菌BF7658(BacillussubtilisBF7658)，分別代表枯草桿菌的兩個菌株(ASI.398和BF7658分別為菌株的編號)，這兩個菌株，前者可用于生產(chǎn)蛋白酶，后者則可用于生產(chǎn)α-淀粉酶。菌株(品系)(strain):43菌株與型的區(qū)別：

菌株之間不存在鑒別性特征的差異，命名不同的菌株無需分類學(xué)依據(jù)；不同型的細(xì)菌之間存在鑒別性特征的差異，命名或鑒定不同的型必需有分類學(xué)依據(jù)。菌株與型的區(qū)別：44大腸桿菌的分類地位大腸桿菌的分類地位45每一種微生物都有一個自己的專門名稱。學(xué)名是國際上統(tǒng)一使用的名稱。以細(xì)菌為例：物種的學(xué)名是用拉丁詞或拉丁化的詞組成的。在一般出版物中，學(xué)名應(yīng)排斜體字，在書寫或打字材料中，應(yīng)在學(xué)名之下劃一橫線，以表示它應(yīng)是斜體字母。1.雙名法（binominalnomenclature）命名按照《國際細(xì)菌命名法規(guī)》,采用林奈氏雙名法。

屬名+種名+命名人EscherichiacoliCastellanietChalmers1919二、微生物的命名每一種微生物都有一個自己的專門名稱。學(xué)名是國際上統(tǒng)一使用的名462.三名法（trinominalnomenclature）當(dāng)某種微生物是一個亞種（subspecies，簡稱“subsp”）或變種(variety，簡稱“var”，亞種的同義詞)時，學(xué)名就應(yīng)按三名法拼寫該亞種名可譯為：反硝化產(chǎn)堿桿菌氧化木糖亞種

2.三名法（trinominalnomenclature47三、微生物的分類鑒定方法

1.經(jīng)典鑒定分類法(特征分類法）2.數(shù)值分類法（統(tǒng)計分類法）

3.遺傳分類法三、微生物的分類鑒定方法1.經(jīng)典鑒定分類法(特征分類法48（一）特征分類法（經(jīng)典分類法）

隨機(jī)地和不系統(tǒng)地根據(jù)一些特征進(jìn)行分類。主要是形態(tài)、生理生化特征。1、形態(tài)特征（個體和群體）

形態(tài)學(xué)特征可作為微生物分類和鑒定的重要依據(jù)之一。包括培養(yǎng)特征、細(xì)胞形態(tài)及其染色特性、特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、運動性等等（一）特征分類法（經(jīng)典分類法）

隨機(jī)地和不系統(tǒng)地根據(jù)49形態(tài)學(xué)特征分（1）細(xì)菌形態(tài)：形狀、大小、排列（2）培養(yǎng)特征：固體—菌落，半固體—穿刺，液體特征（3）特殊結(jié)構(gòu)：鞭毛、芽孢、莢膜、孢子（4）染色反應(yīng)：革蘭、抗酸（5）內(nèi)含物：異染顆粒、伴孢晶體（6）運動性：滑行、鞭毛泳動形態(tài)學(xué)特征分502、生理生化反應(yīng)生理生化特征也是最常用的細(xì)菌分類、鑒定指標(biāo)。營養(yǎng)要求：碳源、氮源、營養(yǎng)類型

代謝產(chǎn)物：種類、產(chǎn)量、顯色反應(yīng)

酶：產(chǎn)酶種類、反應(yīng)特性

2、生理生化反應(yīng)51第二章微生物分類及微生物基本研究技術(shù)課件523、生態(tài)學(xué)特征

相互關(guān)系、宿主種類、與氧關(guān)系等。

4、生活史，有性生殖5、血清學(xué)反應(yīng)6、近年又發(fā)展了紅外光譜，GC含量，DNA雜交等。3、生態(tài)學(xué)特征

相互關(guān)系、宿主種類、與氧關(guān)系等。532.分子與遺傳方法（1）DNA堿基組成：GC%

相同不能說明是同種，但不同則肯定不是同種。

差別>10%不是同種，<10%可能是同種。（2）核酸分子雜交

親緣關(guān)系越近，雜交百分率越高。（3）16srRNA寡核苷酸編目分析

水解rRNA產(chǎn)生一系列寡核苷酸片段，順序分析。近年來，采用紅外、核磁、電鏡等新技術(shù)越來越廣泛。2.分子與遺傳方法543.數(shù)值分類法（統(tǒng)計分類法）

根據(jù)較多特征分類，每一特征地位相同。

1、每一菌株為一操作單位，確定很多特征（50—60個）

2、比較菌株間的最大相似性

陽性和陰性符合的總和

----------------------×100%

總的測定數(shù)-無效測定數(shù)>85%為同種，>65%為同屬

3、據(jù)數(shù)值繪出矩陣圖并轉(zhuǎn)換成樹狀譜。用數(shù)理統(tǒng)計的方法處理細(xì)菌的各種特征，求出相似值，根據(jù)相似值大小決定細(xì)菌在分類學(xué)中的關(guān)系，并進(jìn)行類群的劃分。3.數(shù)值分類法（統(tǒng)計分類法）

用數(shù)理統(tǒng)55四、微生物的快速分類鑒定方法1、API細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)AnalyticaProductsINC的簡稱。法國生物-梅里埃公司生產(chǎn)的細(xì)菌數(shù)值分類分析鑒定系統(tǒng)。約有1000種生化反應(yīng),可鑒定的細(xì)菌大于550種。目前中國各級疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)在細(xì)菌學(xué)檢驗中比較多地應(yīng)用了此項技術(shù)四、微生物的快速分類鑒定方法1、API細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)562、Enterotube系統(tǒng)不同培養(yǎng)基分裝不同小槽中，同步接種，培養(yǎng)后檢測、查表、鑒定。2、Enterotube系統(tǒng)不同培養(yǎng)基分573、Biolog全自動或手動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)在96孔的細(xì)菌培養(yǎng)板上檢測微生物對不同發(fā)酵性碳源利用情況進(jìn)行的分類鑒定。自動化、快速可鑒定細(xì)菌有1140多種、酵母菌267種、目前已經(jīng)可用于絲狀真菌。每個孔中含有不同的底物菌懸液或無菌水3、Biolog全自動或手動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)58第二章微生物分類及微生物基本研究技術(shù)課件59五、菌種鑒定手冊菌種鑒定工作三部曲

1、獲得該微生物的純培養(yǎng)

2、測定一系列必要的鑒定指標(biāo)

3、查找權(quán)威性鑒定手冊

原核生物：

《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》第8版，1973

《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》第9版，1994

真菌：Ainsworth(1973)系統(tǒng)

酵母：Lodder分類系統(tǒng)

五、菌種鑒定手冊菌種鑒定工作三部曲

1、獲得該微生物的純培601923年以來已出至第九版(1994)；第九版伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊設(shè)立35個群，將古細(xì)菌部改編為5個群，全書描寫了約500個屬。劃分為四大類：

第一類具細(xì)胞壁的革蘭氏陰性真細(xì)菌第二類具細(xì)胞壁的革蘭氏陽性真細(xì)菌第三類無細(xì)胞壁的真細(xì)菌第四類古細(xì)菌伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊1923年以來已出至第九版(1994)；伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊61思考題1、什么是種、菌株、模式菌株？2、什么是學(xué)名，舉例說明什么是雙名法？3、微生物的分類依據(jù)有哪些？4、現(xiàn)代微生物分類中應(yīng)用了哪些新技術(shù)和新方法？5、細(xì)菌、真菌、酵母菌的鑒定手冊分別是什么？6、無菌操作的內(nèi)涵？7、微生物學(xué)中哪幾項技術(shù)是獨特的？論述其對發(fā)展現(xiàn)代生物學(xué)所做的貢獻(xiàn)。思考題62第二章

微生物的分類鑒定及微生物的基本研究技術(shù)第二章

微生物的分類鑒定及微生物的基本研究技術(shù)63研究微生物的基本技術(shù)手段微生物的分類鑒定contents研究微生物的基本技術(shù)手段contents64第一節(jié)

微生物的基本研究技術(shù)一、無菌技術(shù)

在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時防止其被其它微生物污染的技術(shù)。微生物培養(yǎng)的常用器具的滅菌1.試管、三角瓶、平皿、玻璃燒瓶等——高溫干熱滅菌：160-180℃2h2.培養(yǎng)基的滅菌——濕熱滅菌：121℃15-30min3.接種工具——火焰灼燒無菌操作——微生物學(xué)研究中最常用的基本操作。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，用經(jīng)過滅菌的接種工具，在無菌的條件下接種含菌材料于培養(yǎng)基上，這一操作過程稱做無菌操作。接種的微生物不能釋放到環(huán)境中，防止環(huán)境污染。第一節(jié)微生物的基本研究技術(shù)一、無菌技術(shù)65培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿66高壓蒸汽自動滅菌鍋手提式高壓蒸汽滅菌鍋高壓蒸汽自動滅菌鍋手提式高壓蒸汽滅菌鍋67無菌操作箱無菌操作箱68無菌操作無菌操作69二、染色技術(shù)利用染料分子和細(xì)胞物質(zhì)的親和力，而使其牢固結(jié)合，使細(xì)胞呈現(xiàn)顏色，便于觀察、鑒別細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。染料是一種有機(jī)化合物，電離后形成帶有正電荷或負(fù)電荷的染料離子。微生物細(xì)胞表現(xiàn)出兩性電解質(zhì)的性質(zhì)細(xì)菌的等電點較低，pH值大約在2—5之間，故在中性、堿性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶陰電荷；G+比G-細(xì)菌對堿性染料的親和力高。二、染色技術(shù)利用染料分子和細(xì)胞物質(zhì)的親和力，而使其牢固結(jié)合，70根據(jù)電離后所帶電荷的性質(zhì)，染料分為：1、酸性染料：帶負(fù)電，與堿性物質(zhì)成鹽。如伊紅、剛果紅、苯胺黑、酸性復(fù)紅等2、堿性染料：帶正電，如美藍(lán)、結(jié)晶紫、孔雀綠、番紅等3、中性染料：酸性染料和堿性染料的結(jié)合，如吉姆薩染料4、單純?nèi)玖希哼@類物質(zhì)親和力低，不能和被染物成鹽，染色能力取決于能否溶于被染物。根據(jù)電離后所帶電荷的性質(zhì)，染料分為：71

簡單染色法

正染色革蘭氏染色法

鑒別染色法抗酸性染色法芽孢染色法死菌姬姆薩染色法細(xì)菌染色法負(fù)染色：莢膜染色法等

活菌：用美藍(lán)或TTC（氧化三苯基四氮唑）等作活菌染色染色方法：簡單染色法、鑒別染色法（復(fù)染色法）、負(fù)染色法簡72染色的基本程序

制片→染色→水洗→干燥→鏡檢。A.加小滴水

B.涂成薄層

C.固定菌體

涂片制備過程染色的基本程序制片→染色→水洗→干燥→鏡檢。A.加小滴73顯微鏡是微生物研究中的不可缺少的工具。顯微技術(shù)是微生物學(xué)研究的重要技術(shù)和基礎(chǔ)。三、顯微技術(shù)顯微鏡是微生物研究中的不可缺少的工具。三、顯微技術(shù)74顯微鏡的種類：普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡、掃描電鏡、透射電鏡。1.放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)×接目鏡放大倍數(shù)2.顯微鏡的分辨率是表示顯微鏡辨析物體（兩端）兩點之間距離的能力，可用公式表示為：D=λ/2n·sin(α/2)式中D：物鏡分辨出物體兩點間的最短距離。：可見光的波長（平均0.55m)n:物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折射率。：鏡口角（即入射角）。顯微鏡的種類：1.放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)×接目鏡放大倍數(shù)75（一）油鏡的使用原理：

油鏡的透鏡很小，光線通過玻片與油鏡頭之間的空氣時，因介質(zhì)密度不同，發(fā)生折射或全反射，使射入透鏡的光線減少，物象顯現(xiàn)不清。1.香柏油的折射率與玻璃接近（n=1.52），提高了視野的照明度。2.提高了顯微鏡的分辨率D=λ/2n·sin(α/2)光學(xué)顯微鏡油鏡的使用（一）油鏡的使用原理：

油鏡的透鏡很小，光線通過玻片76（二）油鏡頭的識別：

各接物鏡的放大率可由其外形辨認(rèn)，鏡頭長度越大，鏡片直徑越小，放大倍數(shù)大；反之，放大倍數(shù)小。油鏡頭長度大于低、高倍鏡，鏡頭下緣一般刻有一圈黑線或白線，并刻有100×、1.25或oil等字樣。

（三）油鏡的使用法：

1、使用顯微鏡油鏡時，必須將顯微鏡端正直立桌上，不得將鏡臂彎曲，使載物臺傾斜，以免香柏油流溢，影響觀察，污染臺面。

2、對光：

首先打開光圈，使光線集中于集光器。

一般用低倍鏡或高倍鏡觀察物象或用油鏡檢查不染色標(biāo)本時，需下降集光器并適當(dāng)?shù)乜s小光圈，使光度減弱；若用油鏡檢查染色標(biāo)本時，光度宜強(qiáng)。應(yīng)將顯微鏡亮度開關(guān)調(diào)至最亮，光圈完全打開，集光器上升至與載物臺相平。

（二）油鏡頭的識別：

各接物鏡的放大率可由其外形辨認(rèn)，773、調(diào)焦距：

A、將標(biāo)本片放載物臺上，用標(biāo)本推進(jìn)器固定，將欲檢部分移至接物鏡下。先用低倍鏡找出標(biāo)本的位置，然后提高鏡筒，在標(biāo)本的待檢部位滴鏡油一滴，再換油鏡觀察。

B、轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器使載物臺徐徐上升（或使鏡筒漸漸下降），直至油鏡頭浸沒至油中。此時眼睛應(yīng)從側(cè)面觀察，以免壓碎標(biāo)本片和損壞鏡頭。

C、然后雙眼移至接目鏡，一面從接目鏡觀察，一面反方向緩慢地轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器（下降載物臺，或上升鏡筒），當(dāng)出現(xiàn)模糊物象時，換用細(xì)調(diào)節(jié)器，轉(zhuǎn)動至物象清晰為止。

3、調(diào)焦距：78D、觀察完畢，應(yīng)先提高鏡筒，并將油鏡頭扭向一側(cè)，再取下標(biāo)本片。油鏡頭使用后，應(yīng)立即用擦鏡紙擦凈鏡頭上的油，再用擦鏡紙蘸少許二甲苯擦拭鏡頭，并隨即用干的鏡紙擦去殘存的二甲苯，以免二甲苯滲入，溶解用以粘固透鏡的膠質(zhì)物，造成鏡片移位或脫落D、觀察完畢，應(yīng)先提高鏡筒，并將油鏡頭扭向一側(cè)，再取下標(biāo)本片79四、接種技術(shù)接種技術(shù)是微生物學(xué)實驗及研究中的一項最基本的操作技術(shù)。接種是將純種微生物在無菌操作條件下移植到已滅菌并適宜該菌生長繁殖所需要的培養(yǎng)基中。為了獲得微生物的純種培養(yǎng)（指一株菌種或一個培養(yǎng)物中所有的細(xì)胞或孢子都是由一個細(xì)胞分裂、繁殖而產(chǎn)生的后代），要求接種過程中必須嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作，一般是在無菌室內(nèi)，超凈工作臺火焰旁或?qū)嶒炇一鹧媾赃M(jìn)行。四、接種技術(shù)接種技術(shù)是微生物學(xué)實驗及研究中的一項最基本的操作80根據(jù)不同的實驗?zāi)康募芭囵B(yǎng)方式可以采用不同的接種工具和接種方法。常用的工具有接種環(huán)、接種針、接種鏟、玻璃涂棒，移液管及滴管等。常用的方法有斜面接種，液體接種，穿刺接種和平板接種。根據(jù)不同的實驗?zāi)康募芭囵B(yǎng)方式可以采用不同的接種工具和81斜面接種斜面接種82穿刺接種操作過程示意圖穿刺接種操作過程示意圖83接種菌名及接種劃線方式、接種工具：細(xì)菌：如枯草桿菌，大腸桿菌，巨大芽孢桿菌接種方式：“之”字劃線，接種工具：接種環(huán)酵母菌：如釀酒酵母菌，假絲酵母菌接種方式：劃直線，接種工具：接種環(huán)霉菌：如黑曲霉，黃曲霉，根霉接種方式：點植或劃直線，接種工具：接種鉤或接種環(huán)接種菌名及接種劃線方式、接種工具：84各種無菌操作接種技術(shù)示意圖各種無菌操作接種技術(shù)示意圖85微生物的分離純化技術(shù)是指從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程。分離純化技術(shù)其實是進(jìn)行平板接種，即用接種環(huán)將菌種接至平板培養(yǎng)基上，或用移液管、滴管將一定體積的菌液移至平板培養(yǎng)基上，然后培養(yǎng)達(dá)到。平板接種的目的是觀察菌落形態(tài)，分離純化菌種，活菌計數(shù)及在平板上進(jìn)行各種實驗時采用的一種接種方法。五、分離純化技術(shù)微生物的分離純化技術(shù)是指從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種86平板（培養(yǎng)平板）：指熔化的固體培養(yǎng)基倒入無菌平皿，冷卻凝固后形成培養(yǎng)平板。培養(yǎng)物：在人為規(guī)定的條件下培養(yǎng)、繁殖得到的微生物群體稱為培養(yǎng)物。純培養(yǎng)物：只有一種微生物的培養(yǎng)物。純培養(yǎng)技術(shù)：把特定的微生物從自然界混雜存在的狀態(tài)中分離、純化出來的培養(yǎng)技術(shù)。以無菌操作方法獲得純培養(yǎng)是微生物學(xué)獨有的技術(shù)，對微生物學(xué)的發(fā)展有非常重要的意義。一、幾個概念平板（培養(yǎng)平板）：指熔化的固體培養(yǎng)基倒入無菌平皿，冷卻凝固后87第二章微生物分類及微生物基本研究技術(shù)課件88二、微生物的分離純化方法：（1）平板劃線法（2）稀釋倒平板法（3）稀釋涂布法（4）選擇培養(yǎng)分離法（5）單細(xì)胞挑取法（6）利用環(huán)境條件控制法二、微生物的分離純化方法：89平板劃線分離操作法示意圖平板劃線分離法：平板劃線分離操作法示意圖平板劃線分離法：90平板劃線菌落分離效果圖平板劃線菌落分離效果圖91稀釋倒平板法稀釋倒平板法92稀釋涂布法稀釋涂布法93選擇培養(yǎng)分離法---選擇培養(yǎng)基利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行直接分離比如：分離產(chǎn)蛋白酶菌株——在培養(yǎng)基中添加牛奶或酪素，觀察是否產(chǎn)生蛋白水解圈。選擇培養(yǎng)分離法---選擇培養(yǎng)基94單細(xì)胞挑取法單細(xì)胞挑取法95利用環(huán)境條件控制法溫度——嗜熱菌、嗜冷菌pH——耐酸、耐堿微生物滲透壓——耐鹽、糖利用環(huán)境條件控制法96二元培養(yǎng)：

以某種微生物的純培養(yǎng)為食物（或寄主）來進(jìn)行另外一種微生物的純培養(yǎng)、稱二元培養(yǎng)。二元培養(yǎng)：

以某種微生物的純培養(yǎng)為食物（或寄主）來進(jìn)行另外97什么是微生物分類學(xué)(microbialtaxonomy):按照微生物的親緣關(guān)系將其安排成條理清楚的各種分類單元和分類群的科學(xué)微生物分類的目的把各種微生物按照它們的親緣關(guān)系分群歸類，排成系統(tǒng)，以便于人們對微生物進(jìn)行鑒定和交流第二節(jié)微生物的分類鑒定什么是微生物分類學(xué)(microbialtaxonomy):按98微生物分類學(xué)的主要任務(wù)分類(classification)即根據(jù)相似性或親緣關(guān)系,將一個有機(jī)體放在一個單元中命名(nomenclature)鑒定(identification)確定一個新的分類物是否歸屬于已經(jīng)命名的分類單元的過程微生物分類學(xué)的主要任務(wù)分類(classification)命99一、微生物的分類單位界Kingdom門Phylum綱Class目Order科Family屬Genus種Species種以上的系統(tǒng)分類單元自上而下可依次分為7個等級：一、微生物的分類單位界Kingdom種以上的系統(tǒng)分類單元自上100種是最基本的分類單位,它是一大群表型特征高度相似，親緣關(guān)系極其相近，與同屬內(nèi)其它種有著明顯差異的菌株的總稱?，F(xiàn)代分類學(xué)上規(guī)定種內(nèi)菌株的DNA同源性≧70%

常用的幾種分類概念種是最基本的分類單位,它是一大群表型特征高度相似，親緣關(guān)系101新種（speciesnova，sp.nov或novsp.）是指權(quán)威性的分類、鑒定手冊中從未記載過的一種新分離并鑒定過的微生物。

按《國際命名法規(guī)》對它命名并在規(guī)定的學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表時，應(yīng)在其學(xué)名后附上“sp.nov”符號。在新種發(fā)表前，其模式菌株的培養(yǎng)物就應(yīng)存放在一個永久性的可靠的菌種保藏機(jī)構(gòu)中，并允許研究人員取得該菌種。新記錄種新種（speciesnova，sp.nov或novsp.102亞種(變種)當(dāng)某一個種內(nèi)的不同菌株存在少數(shù)明顯而穩(wěn)定的變異特征或遺傳性狀而又不足以區(qū)分成新種時，可以將這些菌株細(xì)分成兩個或更多的小的分類單元--亞種。亞種(變種)103型(form或type)常指亞種以下的細(xì)分。當(dāng)同種或同亞種不同菌株之間的性狀差異，不足以分為新的亞種時，可以細(xì)分為不同的型。例如抗原特征的差異分為不同的血清型。型(form或type)104菌株(品系)(strain):

表示任何由一個獨立分離的單細(xì)胞繁殖成的純遺傳型群體及其一切后代。菌株名稱常用數(shù)字編號、字母、人名、地名等表示。如枯草桿菌AS1.398(BacillussubtilisAS1.398)和枯草桿菌BF7658(BacillussubtilisBF7658)，分別代表枯草桿菌的兩個菌株(ASI.398和BF7658分別為菌株的編號)，這兩個菌株，前者可用于生產(chǎn)蛋白酶，后者則可用于生產(chǎn)α-淀粉酶。菌株(品系)(strain):105菌株與型的區(qū)別：

菌株之間不存在鑒別性特征的差異，命名不同的菌株無需分類學(xué)依據(jù)；不同型的細(xì)菌之間存在鑒別性特征的差異，命名或鑒定不同的型必需有分類學(xué)依據(jù)。菌株與型的區(qū)別：106大腸桿菌的分類地位大腸桿菌的分類地位107每一種微生物都有一個自己的專門名稱。學(xué)名是國際上統(tǒng)一使用的名稱。以細(xì)菌為例：物種的學(xué)名是用拉丁詞或拉丁化的詞組成的。在一般出版物中，學(xué)名應(yīng)排斜體字，在書寫或打字材料中，應(yīng)在學(xué)名之下劃一橫線，以表示它應(yīng)是斜體字母。1.雙名法（binominalnomenclature）命名按照《國際細(xì)菌命名法規(guī)》,采用林奈氏雙名法。

屬名+種名+命名人EscherichiacoliCastellanietChalmers1919二、微生物的命名每一種微生物都有一個自己的專門名稱。學(xué)名是國際上統(tǒng)一使用的名1082.三名法（trinominalnomenclature）當(dāng)某種微生物是一個亞種（subspecies，簡稱“subsp”）或變種(variety，簡稱“var”，亞種的同義詞)時，學(xué)名就應(yīng)按三名法拼寫該亞種名可譯為：反硝化產(chǎn)堿桿菌氧化木糖亞種

2.三名法（trinominalnomenclature109三、微生物的分類鑒定方法

1.經(jīng)典鑒定分類法(特征分類法）2.數(shù)值分類法（統(tǒng)計分類法）

3.遺傳分類法三、微生物的分類鑒定方法1.經(jīng)典鑒定分類法(特征分類法110（一）特征分類法（經(jīng)典分類法）

隨機(jī)地和不系統(tǒng)地根據(jù)一些特征進(jìn)行分類。主要是形態(tài)、生理生化特征。1、形態(tài)特征（個體和群體）

形態(tài)學(xué)特征可作為微生物分類和鑒定的重要依據(jù)之一。包括培養(yǎng)特征、細(xì)胞形態(tài)及其染色特性、特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、運動性等等（一）特征分類法（經(jīng)典分類法）

隨機(jī)地和不系統(tǒng)地根據(jù)111形態(tài)學(xué)特征分（1）細(xì)菌形態(tài)：形狀、大小、排列（2）培養(yǎng)特征：固體—菌落，半固體—穿刺，液體特征（3）特殊結(jié)構(gòu)：鞭毛、芽孢、莢膜、孢子（4）染色反應(yīng)：革蘭、抗酸（5）內(nèi)含物：異染顆粒、伴孢晶體（6）運動性：滑行、鞭毛泳動形態(tài)學(xué)特征分1122、生理生化反應(yīng)生理生化特征也是最常用的細(xì)菌分類、鑒定指標(biāo)。營養(yǎng)要求：碳源、氮源、營養(yǎng)類型

代謝產(chǎn)物：種類、產(chǎn)量、顯色反應(yīng)

酶：產(chǎn)酶種類