基因工程ppt第八章基因工程課件

第八章基因工程基因工程(geneticengineering)、基因克隆、DNA重組、DNA克隆、分子克隆克?。╟lone）無(wú)性繁殖應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將目的基因與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子（復(fù)制子、重組體），繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子拷貝，或其表達(dá)產(chǎn)物。第八章基因工程基因工程(geneticengin1基因克隆示意圖基因克隆示意圖2基因工程ppt第八章基因工程課件3基因工程大事記1973Cohen第一例成功的克隆實(shí)驗(yàn)1978Genentech公司人胰島素世界上第一種基因工程蛋白藥物

1982第一個(gè)基因工程藥物--重組人胰島素在英、美獲準(zhǔn)使用

1985第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），中國(guó)轉(zhuǎn)基因魚(yú)

基因工程大事記1973Cohen第一例成功的克隆實(shí)驗(yàn)41993

基因工程西紅柿在美國(guó)上市1997英國(guó)羅斯林研究所多莉羊1999.9中國(guó)獲準(zhǔn)加入人類(lèi)基因組計(jì)劃.負(fù)責(zé)測(cè)定人類(lèi)基因組全部序列的1%2000.6.26科學(xué)家公布人類(lèi)基因組工作草圖2001.2.11公布人類(lèi)基因組基本信息生物技術(shù)工程：基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程1993基因工程西紅柿在美國(guó)上市5胰島素人生長(zhǎng)激素干擾素白細(xì)胞介素2粒細(xì)胞集落刺激因子粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子紅細(xì)胞生成素EPO組織纖溶酶原激活劑生長(zhǎng)激素促生長(zhǎng)素抗血友病因子Ⅷ脫氧核糖核酸酶葡糖腦苷脂酶鼠單克隆抗體胰島素6自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組基因重組(geneticrecombination)——整段DNA在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間,甚至不同物種間進(jìn)行交換,并能在新的位置上復(fù)制,轉(zhuǎn)錄和翻譯自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組是無(wú)目的基因工程有目的自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組基因重組(geneticrecom7結(jié)合作用質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)化作用transformation

通過(guò)自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型的過(guò)程結(jié)合作用8轉(zhuǎn)導(dǎo)作用transduction病毒、噬菌體介導(dǎo)溶菌途徑；溶原菌途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)作用transduction病毒、噬菌體介導(dǎo)9基因工程工具酶載體重組DNA技術(shù)的基本過(guò)程真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染克隆基因的表達(dá)基因工程工具酶10工具酶限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3′-5′磷酸二酯鍵DNA聚合酶Ⅰ探針標(biāo)記、補(bǔ)平3′末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶3′末端多聚尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基常用的工具酶：工具酶限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3′-5′11一把特殊的剪刀

—限制性?xún)?nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，獲1978年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)一把特殊的剪刀

—限制性?xún)?nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

阿爾伯(Arber)、121953年，Arber研究噬菌體與細(xì)菌（A、B）的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)100-200個(gè)子代噬菌體中，只有1個(gè)可感染B，即其他的噬菌體在B中受到限制，唯有這一個(gè)受到修飾（甲基化）后感染成功。細(xì)菌B：在缺甲硫氨酸的培養(yǎng)基中，細(xì)菌死亡。原因：細(xì)菌無(wú)法對(duì)自己的DNA進(jìn)行修飾。假設(shè)：限制性?xún)?nèi)切酶與修飾酶。1953年，Arber研究噬菌體與細(xì)菌（A、B）的關(guān)系。13基因工程ppt第八章基因工程課件14基因工程ppt第八章基因工程課件151967年，Smith，分析限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別和切割序列，認(rèn)為它由5-6個(gè)堿基組成原因：限制性酶將T7DNA切成平均長(zhǎng)度為1000堿基的片段。識(shí)別和切割序列：中心對(duì)稱(chēng)的回文結(jié)構(gòu)。限制性酶：HindⅡNathans：用限制性酶切割猴子SV40DNA，DNA測(cè)序。1967年，Smith，分析限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別和切割序列，認(rèn)16限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)部特異位點(diǎn)并裂解磷酸二酯鍵分類(lèi)：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型命名：EcoRⅠ(E：屬名；co：種名；R：株；Ⅰ：發(fā)現(xiàn)次序)限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)識(shí)別17識(shí)別和切割位點(diǎn)回文結(jié)構(gòu)4～6bp出現(xiàn)兩種末端粘性末端粘端

平頭末端平端

同工異源酶：來(lái)源不同，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)同尾酶：識(shí)別序列不同，但產(chǎn)生相同的粘性末端識(shí)別和切割位點(diǎn)18粘性末端與平頭末端粘性末端與平頭末端19修飾酶DNA聚合酶Ⅰ逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)T4DNA連接酶(T4ligase)堿性磷酸酶(alkalinephosphatase)末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)TaqDNA聚合酶修飾酶DNA聚合酶Ⅰ20DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)的活性5′至3′的聚合活性5′→3′方向核酸外切酶活性5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性polⅠ經(jīng)枯草桿菌蛋白酶裂解可得大、小兩個(gè)片段大片段（Klenow片段）：聚合活性、3′→5′外切活性常用的工具酶DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)的活性5′至3′的聚合活性21核酸外切酶活性3′→5′外切酶活性5′→3′外切酶活性核酸外切酶活性3′→5′外切酶活性22基因工程ppt第八章基因工程課件23基因工程ppt第八章基因工程課件24基因工程ppt第八章基因工程課件25末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(TDT)末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(TDT)26載體vectorDNA，能在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制和表達(dá)克隆載體、表達(dá)載體原核載體：質(zhì)粒(pBR322,pUC…）噬菌體（λ，M13）等真核載體：動(dòng)物病毒載體pLXSN等載體vectorDNA，能在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制和27基因工程ppt第八章基因工程課件28常用的克隆載體質(zhì)粒(plasmid)—存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子理想的質(zhì)粒

拷貝數(shù)多;兩三個(gè)遺傳標(biāo)志，如抗藥性基因：抗氨芐青霉素基因(ampr)

、抗四環(huán)素基因(terr)；β-半乳糖苷酶基因(lacZ)篩選標(biāo)志多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsites,MCS)常用的克隆載體質(zhì)粒(plasmid)—存在于細(xì)菌染色體外的小29基因工程ppt第八章基因工程課件30基因工程ppt第八章基因工程課件31基因工程ppt第八章基因工程課件32基因工程ppt第八章基因工程課件33常用的克隆載體λ噬菌體(λphage)基因組分三個(gè)區(qū)域：左側(cè)區(qū)、中間區(qū)（非必需區(qū)）、右側(cè)區(qū)DNA，替換型載體，外源DNA：9~23kb常用：EMBL系列、λgt系列、charon系列粘性質(zhì)粒(cosmid)：λDNA的cos區(qū)+質(zhì)粒，雙鏈環(huán)狀DNA，克隆容量：40~50kbM13噬菌體最大優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)生單鏈DNA常用的克隆載體λ噬菌體(λphage)34基因工程ppt第八章基因工程課件35基因工程ppt第八章基因工程課件36基因工程ppt第八章基因工程課件37基因工程ppt第八章基因工程課件38基因工程ppt第八章基因工程課件39基因工程ppt第八章基因工程課件40cos:cohesive-endsite特點(diǎn)：cos:cohesive-endsite特點(diǎn)：41基因工程ppt第八章基因工程課件42基因工程ppt第八章基因工程課件43RFDNA:replicationalformDNA優(yōu)點(diǎn)：RFDNA:優(yōu)點(diǎn)：44表達(dá)載體(expressingvector)特點(diǎn)：帶表達(dá)構(gòu)件—轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的DNA序列大腸桿菌表達(dá)載體：含啟動(dòng)子—核糖體結(jié)合位點(diǎn)—克隆位點(diǎn)—轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)啟動(dòng)子：trp-lac(tac)啟動(dòng)子、λ噬菌體PL啟動(dòng)子、T7噬菌體啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome-bindingsite,RBS)：起始密碼子(ATG)和SD序列轉(zhuǎn)錄終止序列表達(dá)載體(expressingvector)特點(diǎn)：帶表達(dá)構(gòu)45基因工程ppt第八章基因工程課件46基因工程ppt第八章基因工程課件47基因工程ppt第八章基因工程課件48哺乳動(dòng)物表達(dá)載體真核表達(dá)元件：?jiǎn)?dòng)子/增強(qiáng)子—克隆位點(diǎn)—終止信號(hào)和加poly(A)信號(hào)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體真核表達(dá)元件：?jiǎn)?dòng)子/增強(qiáng)子—克隆位點(diǎn)—終止49重組DNA技術(shù)的基本過(guò)程目的基因的制備載體的選擇和制備DNA分子的體外連接將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞目的基因的篩選和鑒定重組DNA技術(shù)的基本過(guò)程目的基因的制備50目的基因(targetDNA)的制備目的基因（外源基因）制備基因組DNA基因文庫(kù)(genomiclibrary)—存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌中、克隆載體攜帶的所有基因組DNA的集合制備cDNAcDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)制備用于表達(dá)的基因片段：PCR技術(shù)、化學(xué)合成目的基因(targetDNA)的制備目的基因（外源基因）51基因工程ppt第八章基因工程課件52基因工程ppt第八章基因工程課件53基因工程ppt第八章基因工程課件54基因工程ppt第八章基因工程課件55基因工程ppt第八章基因工程課件56載體的選擇和制備：λ噬菌體、粘性質(zhì)粒、pUC系列、M13噬菌體DNA分子的體外連接（DNA連接酶）粘性末端連接連接效率高相同酶切末端平端連接連接效率低人工接頭(linker)法同聚物接尾法載體的選擇和制備：λ噬菌體、粘性質(zhì)粒、pUC系列、M13噬57基因工程ppt第八章基因工程課件58基因工程ppt第八章基因工程課件59基因工程ppt第八章基因工程課件60基因工程ppt第八章基因工程課件61同聚物接尾法同聚物接尾法62將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因工程菌HB101,JM109轉(zhuǎn)化(transformation)制備感受態(tài)細(xì)胞冷的氯化鈣處理，細(xì)胞處于最適攝取和容忍外來(lái)DNA的生理狀態(tài)感染(infaction)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：由噬菌體和細(xì)胞病毒介導(dǎo)的遺傳信息轉(zhuǎn)移過(guò)程轉(zhuǎn)染(transfection)：真核細(xì)胞主動(dòng)攝取或被動(dòng)導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過(guò)程。將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因工程菌HB101,JM163目的基因的篩選和鑒定(screening/selection)遺傳學(xué)方法插入滅活法(insertioninactivation):抗藥性標(biāo)志選擇

標(biāo)志補(bǔ)救表達(dá)產(chǎn)物與營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)

α-互補(bǔ)藍(lán)白斑篩選免疫學(xué)方法分子雜交探針原位雜交

PCR限制性酶切圖譜

目的基因的篩選和鑒定(screening/selection64基因工程ppt第八章基因工程課件65基因工程ppt第八章基因工程課件66基因工程ppt第八章基因工程課件67IPTG;X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)IPTG;X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半68基因工程ppt第八章基因工程課件69

bp—1534—994—

695—515—377—237

ABCM

bpAB70基因工程ppt第八章基因工程課件71基因工程ppt第八章基因工程課件72克隆基因的表達(dá)載體有轉(zhuǎn)錄、翻譯的元件；密碼子通用原核表達(dá)體系

原核表達(dá)載體的標(biāo)準(zhǔn)合適的篩選標(biāo)志強(qiáng)啟動(dòng)子翻譯控制序列多克隆位點(diǎn)克隆基因的表達(dá)載體有轉(zhuǎn)錄、翻譯的元件；密碼子通用73融合蛋白（fusionprotein,包涵體）表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽的N末端由原核DNA編碼，C末斷由克隆的真核DNA編目。大腸桿菌表達(dá)體系的不足缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制，只能表達(dá)cDNA缺乏翻譯后加工機(jī)制，不能折疊和糖基化融合蛋白形成包涵體，復(fù)性后才有活性很難表達(dá)大量的可溶性蛋白融合蛋白（fusionprotein,包涵體）74基因工程ppt第八章基因工程課件75真核表達(dá)體系轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣沉淀DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；人造膜顯微注射篩選標(biāo)志tk-NeorG418瞬時(shí)轉(zhuǎn)染目的基因不整合進(jìn)宿主基因組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因整合進(jìn)宿主基因組真核表達(dá)體系轉(zhuǎn)染方法76tk-細(xì)胞突變株篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞胸苷激酶（tk）TTP：從頭合成（氨甲喋呤阻斷），補(bǔ)救合成HAT選擇（H：次黃嘌呤；A：氨甲喋呤；T：胸苷）tk+：生長(zhǎng)tk-+帶tk基因的質(zhì)粒：生長(zhǎng)tk-細(xì)胞突變株篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞胸苷激酶（tk）77藥物篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞neor新霉素：細(xì)菌抗生素，干擾原核生物蛋白質(zhì)合成G418：干擾原核、真核生物neo：磷酸轉(zhuǎn)移酶，使G418失活neo與目的基因連鎖,轉(zhuǎn)染藥物篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞neor78目的基因的定點(diǎn)誘變及其應(yīng)用基因定點(diǎn)誘變技術(shù)基因定點(diǎn)誘變技術(shù)的應(yīng)用目的基因的定點(diǎn)誘變及其應(yīng)用基因定點(diǎn)誘變技術(shù)79基因工程ppt第八章基因工程課件80基因工程ppt第八章基因工程課件81基因工程ppt第八章基因工程課件82基因工程ppt第八章基因工程課件83基因工程ppt第八章基因工程課件84演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！85第八章基因工程基因工程(geneticengineering)、基因克隆、DNA重組、DNA克隆、分子克隆克?。╟lone）無(wú)性繁殖應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將目的基因與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子（復(fù)制子、重組體），繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子拷貝，或其表達(dá)產(chǎn)物。第八章基因工程基因工程(geneticengin86基因克隆示意圖基因克隆示意圖87基因工程ppt第八章基因工程課件88基因工程大事記1973Cohen第一例成功的克隆實(shí)驗(yàn)1978Genentech公司人胰島素世界上第一種基因工程蛋白藥物

1982第一個(gè)基因工程藥物--重組人胰島素在英、美獲準(zhǔn)使用

1985第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），中國(guó)轉(zhuǎn)基因魚(yú)

基因工程大事記1973Cohen第一例成功的克隆實(shí)驗(yàn)891993

基因工程西紅柿在美國(guó)上市1997英國(guó)羅斯林研究所多莉羊1999.9中國(guó)獲準(zhǔn)加入人類(lèi)基因組計(jì)劃.負(fù)責(zé)測(cè)定人類(lèi)基因組全部序列的1%2000.6.26科學(xué)家公布人類(lèi)基因組工作草圖2001.2.11公布人類(lèi)基因組基本信息生物技術(shù)工程：基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程1993基因工程西紅柿在美國(guó)上市90胰島素人生長(zhǎng)激素干擾素白細(xì)胞介素2粒細(xì)胞集落刺激因子粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子紅細(xì)胞生成素EPO組織纖溶酶原激活劑生長(zhǎng)激素促生長(zhǎng)素抗血友病因子Ⅷ脫氧核糖核酸酶葡糖腦苷脂酶鼠單克隆抗體胰島素91自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組基因重組(geneticrecombination)——整段DNA在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間,甚至不同物種間進(jìn)行交換,并能在新的位置上復(fù)制,轉(zhuǎn)錄和翻譯自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組是無(wú)目的基因工程有目的自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組基因重組(geneticrecom92結(jié)合作用質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)化作用transformation

通過(guò)自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型的過(guò)程結(jié)合作用93轉(zhuǎn)導(dǎo)作用transduction病毒、噬菌體介導(dǎo)溶菌途徑；溶原菌途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)作用transduction病毒、噬菌體介導(dǎo)94基因工程工具酶載體重組DNA技術(shù)的基本過(guò)程真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染克隆基因的表達(dá)基因工程工具酶95工具酶限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3′-5′磷酸二酯鍵DNA聚合酶Ⅰ探針標(biāo)記、補(bǔ)平3′末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶3′末端多聚尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基常用的工具酶：工具酶限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3′-5′96一把特殊的剪刀

—限制性?xún)?nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，獲1978年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)一把特殊的剪刀

—限制性?xún)?nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

阿爾伯(Arber)、971953年，Arber研究噬菌體與細(xì)菌（A、B）的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)100-200個(gè)子代噬菌體中，只有1個(gè)可感染B，即其他的噬菌體在B中受到限制，唯有這一個(gè)受到修飾（甲基化）后感染成功。細(xì)菌B：在缺甲硫氨酸的培養(yǎng)基中，細(xì)菌死亡。原因：細(xì)菌無(wú)法對(duì)自己的DNA進(jìn)行修飾。假設(shè)：限制性?xún)?nèi)切酶與修飾酶。1953年，Arber研究噬菌體與細(xì)菌（A、B）的關(guān)系。98基因工程ppt第八章基因工程課件99基因工程ppt第八章基因工程課件1001967年，Smith，分析限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別和切割序列，認(rèn)為它由5-6個(gè)堿基組成原因：限制性酶將T7DNA切成平均長(zhǎng)度為1000堿基的片段。識(shí)別和切割序列：中心對(duì)稱(chēng)的回文結(jié)構(gòu)。限制性酶：HindⅡNathans：用限制性酶切割猴子SV40DNA，DNA測(cè)序。1967年，Smith，分析限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別和切割序列，認(rèn)101限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)部特異位點(diǎn)并裂解磷酸二酯鍵分類(lèi)：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型命名：EcoRⅠ(E：屬名；co：種名；R：株；Ⅰ：發(fā)現(xiàn)次序)限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)識(shí)別102識(shí)別和切割位點(diǎn)回文結(jié)構(gòu)4～6bp出現(xiàn)兩種末端粘性末端粘端

平頭末端平端

同工異源酶：來(lái)源不同，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)同尾酶：識(shí)別序列不同，但產(chǎn)生相同的粘性末端識(shí)別和切割位點(diǎn)103粘性末端與平頭末端粘性末端與平頭末端104修飾酶DNA聚合酶Ⅰ逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)T4DNA連接酶(T4ligase)堿性磷酸酶(alkalinephosphatase)末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)TaqDNA聚合酶修飾酶DNA聚合酶Ⅰ105DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)的活性5′至3′的聚合活性5′→3′方向核酸外切酶活性5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性polⅠ經(jīng)枯草桿菌蛋白酶裂解可得大、小兩個(gè)片段大片段（Klenow片段）：聚合活性、3′→5′外切活性常用的工具酶DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)的活性5′至3′的聚合活性106核酸外切酶活性3′→5′外切酶活性5′→3′外切酶活性核酸外切酶活性3′→5′外切酶活性107基因工程ppt第八章基因工程課件108基因工程ppt第八章基因工程課件109基因工程ppt第八章基因工程課件110末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(TDT)末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(TDT)111載體vectorDNA，能在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制和表達(dá)克隆載體、表達(dá)載體原核載體：質(zhì)粒(pBR322,pUC…）噬菌體（λ，M13）等真核載體：動(dòng)物病毒載體pLXSN等載體vectorDNA，能在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制和112基因工程ppt第八章基因工程課件113常用的克隆載體質(zhì)粒(plasmid)—存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子理想的質(zhì)粒

拷貝數(shù)多;兩三個(gè)遺傳標(biāo)志，如抗藥性基因：抗氨芐青霉素基因(ampr)

、抗四環(huán)素基因(terr)；β-半乳糖苷酶基因(lacZ)篩選標(biāo)志多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsites,MCS)常用的克隆載體質(zhì)粒(plasmid)—存在于細(xì)菌染色體外的小114基因工程ppt第八章基因工程課件115基因工程ppt第八章基因工程課件116基因工程ppt第八章基因工程課件117基因工程ppt第八章基因工程課件118常用的克隆載體λ噬菌體(λphage)基因組分三個(gè)區(qū)域：左側(cè)區(qū)、中間區(qū)（非必需區(qū)）、右側(cè)區(qū)DNA，替換型載體，外源DNA：9~23kb常用：EMBL系列、λgt系列、charon系列粘性質(zhì)粒(cosmid)：λDNA的cos區(qū)+質(zhì)粒，雙鏈環(huán)狀DNA，克隆容量：40~50kbM13噬菌體最大優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)生單鏈DNA常用的克隆載體λ噬菌體(λphage)119基因工程ppt第八章基因工程課件120基因工程ppt第八章基因工程課件121基因工程ppt第八章基因工程課件122基因工程ppt第八章基因工程課件123基因工程ppt第八章基因工程課件124基因工程ppt第八章基因工程課件125cos:cohesive-endsite特點(diǎn)：cos:cohesive-endsite特點(diǎn)：126基因工程ppt第八章基因工程課件127基因工程ppt第八章基因工程課件128RFDNA:replicationalformDNA優(yōu)點(diǎn)：RFDNA:優(yōu)點(diǎn)：129表達(dá)載體(expressingvector)特點(diǎn)：帶表達(dá)構(gòu)件—轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的DNA序列大腸桿菌表達(dá)載體：含啟動(dòng)子—核糖體結(jié)合位點(diǎn)—克隆位點(diǎn)—轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)啟動(dòng)子：trp-lac(tac)啟動(dòng)子、λ噬菌體PL啟動(dòng)子、T7噬菌體啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome-bindingsite,RBS)：起始密碼子(ATG)和SD序列轉(zhuǎn)錄終止序列表達(dá)載體(expressingvector)特點(diǎn)：帶表達(dá)構(gòu)130基因工程ppt第八章基因工程課件131基因工程ppt第八章基因工程課件132基因工程ppt第八章基因工程課件133哺乳動(dòng)物表達(dá)載體真核表達(dá)元件：?jiǎn)?dòng)子/增強(qiáng)子—克隆位點(diǎn)—終止信號(hào)和加poly(A)信號(hào)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體真核表達(dá)元件：?jiǎn)?dòng)子/增強(qiáng)子—克隆位點(diǎn)—終止134重組DNA技術(shù)的基本過(guò)程目的基因的制備載體的選擇和制備DNA分子的體外連接將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞目的基因的篩選和鑒定重組DNA技術(shù)的基本過(guò)程目的基因的制備135目的基因(targetDNA)的制備目的基因（外源基因）制備基因組DNA基因文庫(kù)(genomiclibrary)—存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌中、克隆載體攜帶的所有基因組DNA的集合制備cDNAcDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)制備用于表達(dá)的基因片段：PCR技術(shù)、化學(xué)合成目的基因(targetDNA)的制備目的基因（外源基因）136基因工程ppt第八章基因工程課件137基因工程ppt第八章基因工程課件138基因工程ppt第八章基因工程課件139基因工程ppt第八章基因工程課件140基因工程ppt第八章基因工程課件141載體的選擇和制備：λ噬菌體、粘性質(zhì)粒、pUC系列、M13噬菌體DNA分子的體外連接（DNA連接酶）粘性末端連接連接效率高相同酶切末端平端連接連接效率低人工接頭(linker)法同聚物接尾法載體的選擇和制備：λ噬菌體、粘性質(zhì)粒、pUC系列、M13噬142基因工程ppt第八章基因工程課件143基因工程ppt第八章基因工程課件144基因工程ppt第八章基因工程課件145基因工程ppt第八章基因工程課件146同聚物接尾法同聚物接尾法147將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因工程菌HB101,JM109轉(zhuǎn)化(transformation)制備感受態(tài)細(xì)胞冷的氯化鈣處理，細(xì)胞處于最適攝取和容忍外來(lái)DNA的生理狀態(tài)感染(infaction)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：由噬菌體和細(xì)胞病毒介導(dǎo)的遺傳信息轉(zhuǎn)移過(guò)程轉(zhuǎn)染(transfection)：真核細(xì)胞主動(dòng)攝取或被動(dòng)導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過(guò)程。將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因工程菌HB101,JM1148目的基因的篩選和鑒定(screening/selection)遺傳學(xué)方法插入滅活法(insertioninactivation):抗藥性標(biāo)志選擇

標(biāo)志補(bǔ)救表達(dá)產(chǎn)物與營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)

α-互補(bǔ)藍(lán)白斑篩選免疫學(xué)方法分子雜交探針原位雜交

PCR限制性酶切圖譜

目的基因的篩選和鑒定(screening/se