第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件

第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法NucleicAcid第15章NucleicAcid1一、核酸的水解

酸、堿、酶水解作用于磷酸二酯鍵和糖苷鍵DNA/RNA對酸/堿的耐受程度有差別一、核酸的水解酸、堿、酶水解2二、核酸的酸堿性質(zhì)具有芳香環(huán)結構特點能發(fā)生酮式/烯醇式、氨式/亞氨式互變嘌呤和嘧啶堿基都具有弱堿性______主要是環(huán)內(nèi)氨基的貢獻1、堿基的解離二、核酸的酸堿性質(zhì)具有芳香環(huán)結構特點1、堿基的解離3

胞嘧啶中尿嘧啶及胸腺嘧啶中胞嘧啶中4鳥嘌呤和次黃嘌呤中質(zhì)子則結合到N7上鳥嘌呤和次黃嘌呤中質(zhì)子則結合到N7上52、核苷的解離戊糖可增強堿基的酸性解離核糖中的羥基也可發(fā)生解離3.核苷酸的解離磷酸基使核苷酸具有很強的酸性2、核苷的解離6第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件7DNA等電點為4～4.5；RNA等電點為2～2.5第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件8三、核酸的紫外吸收

堿基含有共軛雙鍵最大吸收峰260nm左右三、核酸的紫外吸收堿基含有共軛雙鍵9核酸溶液紫外吸收以摩爾磷的吸光度表示，摩爾磷即相當于摩爾核苷酸。ε：摩爾吸光系數(shù)A：吸收值W：每升溶液磷重量

L：比色杯內(nèi)徑核酸溶液紫外吸收以摩爾磷的吸光度表示，摩爾磷即相當于摩爾核苷10OD260的應用：1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相當于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0含雜蛋白及苯酚，降低3.判斷DNA是否變性OD260的應用：11四、核酸的變性、復性與雜交(一)核酸的變性（denaturation）

1、DNA的變性：

在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。四、核酸的變性、復性與雜交(一)核酸的變性（denatur12某些理化因素破壞了氫鍵和堿基堆積力，使核酸分子高級結構改變、理化性質(zhì)及生物活性發(fā)生改變。

不涉及磷酸二酯鍵斷裂，一級結構不變2、變性的實質(zhì)某些理化因素破壞了氫鍵和堿基堆積力，2、變性的實質(zhì)13降解：核苷酸骨架上3’，5’-磷酸二酯鍵的斷裂DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂降解：核苷酸骨架上3’，5’-磷酸二酯鍵的斷裂DNA變性的14

高溫（一般＞75℃）—熱變性

強酸、堿—酸堿變性

甲醛（Agarose中RNA）

尿素（PAGE中DNA）3、變性因素高溫（一般＞75℃）—熱變性3、變性因15

OD260增高 粘度下降比旋度下降 浮力密度升高酸堿滴定曲線改變 生物活性喪失4、變性后理化性質(zhì)變化RNA變性：從螺旋到線團之間的轉(zhuǎn)變RNA的變性引起的性質(zhì)變化沒有DNA明顯OD260增高 粘度下降4、變性后理化16第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件17完全變性后核酸紫外吸收值增加：天然DNA25－40%、RNA約1.1%實質(zhì)：堿基暴露由于變性或降解引起紫外吸收增加的現(xiàn)象稱增色效應完全變性后核酸紫外吸收值增加：由于變性或降解引起紫外吸收增加18DNA變性DNA變性195、DNA熱變性的特征變性過程是“躍變式”的，而非漸變解鏈曲線：連續(xù)加熱DNA，以溫度對A260作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。5、DNA熱變性的特征變性過程是“躍變式”的，而非漸變解鏈曲20指增色效應達50%時的溫度一般DNATm值在85-90C之間Tm：DNA變性時，OD260達到最大值的50%時的溫度稱為DNA的解鏈溫度或融解溫度(Tm)。大小與G+C含量成正比。Tm：DNA變性時，OD260達到最大值的50%時的溫度稱21第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件22（1）DNA的均一性：（2）G－C含量：

經(jīng)驗公式：XG+C＝（Tm－69.3）×2.44（3）介質(zhì)中的離子強度：

Tm值大小與下列因素有關：（1）DNA的均一性：Tm值大小與下列因素有關：23(二)核酸的復性（renaturation）變性DNA在適當?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈重新締合成雙鏈——復性。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復性，這一過程稱為退火(annealing)。(二)核酸的復性（renaturation）變性DNA在適當24DNA復性DNA復性25第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件26分子量越大復性越難；濃度越大，復性越容易；DNA復性也與它本身組成和結構有關（具有很多重復序列DNA，復性快）。減色效應（低色效應）——復性時紫外吸收減少的現(xiàn)象分子量越大復性越難；復性時紫外吸收減少的現(xiàn)象27(三)核酸的雜交(三)核酸的雜交28第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件29DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復性不同來源的DNA分子DNA-DNA變性復性不同來源的DNA分子30第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件31

Southern雜交Northern雜交Western雜交Southern雜交32Southern雜交是分子生物學的經(jīng)典實驗方法。其基本原理是將待檢測的DNA樣品固定在固相載體上,與標記的核酸探針進行雜交,在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號。通過Southern雜交可以判斷被檢測的DNA樣品中是否有與探針同源的片段以及該片段的長度。

一．基因組DNA的限制酶切

二．基因組DNA消化產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

三．DNA從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物

四.探針標記與雜交

五.洗膜與檢測

/bio101/2006/6908.htmSouthern雜交是分子生物學的經(jīng)典實驗方法。其基本原理是33第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件34Northern雜交是用來測量真核生物RNA的量和大小估計其豐度的實驗方法，可以從大量的RNA樣本同時獲得這些信息。其基本步驟包括：1.完整mRNA的分離2.根據(jù)RNA的大小通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA進行分離3.將RNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上，在轉(zhuǎn)移的過程中，要保持RNA在凝膠中的相對分布4.將RNA固定到支持物上5.固相RNA與探針分子雜交6.除去非特異結合到固相支持物上的探針分子7.對特異結合的探針分子的圖像進行檢測、捕獲和分析Northern雜交是用來測量真核生物RNA的量和大小估計35第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件36Western雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測定融為一體的特異性蛋白質(zhì)的檢測方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先從生物細胞中提取總蛋白或目的蛋白，將蛋白質(zhì)樣品溶解于含有去污劑和還原劑的溶液中，經(jīng)SDS電泳將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，再把分離的各蛋白質(zhì)條帶原位轉(zhuǎn)移到固相膜（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，接著將膜浸泡在高濃度的蛋白質(zhì)溶液中溫育，以封閉其非特異性位點。然后加入特異抗性體（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）與一抗結合后，再加入能與一抗專一性結合的帶標記的二抗（通常一抗用兔來源的抗體時，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗體），最后通過二抗上帶標記化合物（一般為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶）的特異性反應進行檢測。根據(jù)檢測結果，從而可得知被檢生物（植物）細胞內(nèi)目的蛋白的表達與否、表達量及分子量等情況。

Western雜交方法靈敏度高，通?？蓮闹参锟偟鞍字袡z測出50ng的特異性的目的蛋白。第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件37第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件38

核酸的研究方法NucleicAcidNucleicAcid39制備天然核酸必需采用溫和的條件，防止過酸、過堿，避免劇烈攪拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用.一、核酸的分離、提純和定量測定制備天然核酸必需采用溫和的條件，防止過酸、過堿，避免40真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高鹽溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低鹽溶液（0.14mol/LNaCl去除蛋白質(zhì)：水飽和酚，氯仿異戊醇。DNA沉淀：0.3MNaAC-70%乙醇（一）DNA分離純化（一）DNA分離純化41制備RNA時，最重要的是使RNase滅活：①所有容器都要經(jīng)過高溫處理，不能高溫高壓的用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）處理。②加入強變性劑（如胍鹽）使RNase失活；③在RNA的反應體系內(nèi)加入RNase的抑制劑（如RNasin)（二）RNA的分離制備RNA時，最重要的是使RNase滅活：（二）RNA的分離422、定糖法RNA：核糖→糠醛→→綠色物質(zhì)（670-680nm）DNA：脫氧核糖+二苯胺→蘭色物質(zhì)（595-620nm）苔黑酚/地衣酚濃HCl濃硫酸1、紫外吸收法1個A～50μg/ml雙鏈DNA～40μg/mlRNA或單鏈DNA（三）核酸含量的測定2、定糖法苔黑酚/地衣酚濃HCl濃硫酸1、紫外吸收法（三）核433、定磷法核酸含磷量為9.5%1g磷相當于10.5g核酸4、瓊脂糖凝膠電泳溴乙錠能插入DNA分子的堿基對間形成復合物在紫外線照射下溴乙錠發(fā)橘紅色熒光熒光強度與DNA含量成正比3、定磷法44純DNA比值1.8，＜1.8Pr、苯酚污染純RNA比值2.0，<2.0DNA、Pr、苯酚污染（四）、核酸純度的測定OD260／OD280純DNA比值1.8，＜1.8Pr、苯酚污染（四）、核酸45二、核酸的沉降特性與超速離心不同構象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度離心可以將不同構象DNA、RNA與蛋白質(zhì)區(qū)分開來二、核酸的沉降特性與超速離心不同構象的核酸（線形、環(huán)形468MCsCl，45000rpm，16h密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml平衡時：浮力密度=CsCl密度=離心力ρ=ρ0+4.2ω2（r2-r02）×10-10ρ：浮力密度ω：角速度（弧度/秒）r：樣品到轉(zhuǎn)軸的距離（一）核酸密度的測定8MCsCl，45000rpm，16h（一）核酸密度的測定47G-C含量與DNA的浮力密度之間呈正比關系ρ=0.1xG-C+1.658xG-C=（ρ-1.658）×10

（二）測定DNA的G-C含量G-C含量與DNA的浮力密度之間呈正比關系（二）測定DNA的48RNA＞DNA變性DNA＞雙鏈DNA＞蛋白質(zhì)，變性程度越大，浮力密度越大（三）研究核酸的構象RNA＞DNA（三）研究核酸的構象49（四）用于核酸的制備超螺旋DNA或（四）用于核酸的制備超螺旋DNA或50用于大片段DNA的分離，精度低，但分離范圍廣。三、核酸的凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳用于大片段DNA的分離，精度低，但分離范圍廣。三、核酸的凝膠51第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件52用于小片段DNA的分析相對分子質(zhì)量小于1000bp的DNA片斷和RNA的電泳。PAGE中一般不含RNase，用于RNA分析時不會分解樣品。（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）用于小片段DNA的分析（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）53（一）DNA的酶法測定四、核酸的核苷酸序列測定英國Sanger1955確定牛胰島素結構，1958獲諾貝爾化學獎1975設計出DNA測序法，1980獲諾貝爾化學獎合成一段與待測DNA序列互補的DNA片段群。

（一）DNA的酶法測定四、核酸的核苷酸序列測定英國Sa54第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件55末端終止法——Sanger2’，3’雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）是DNA合成鏈延伸的抑制劑。末端終止法——Sanger56第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件57第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件58MOV:MCB4.0\DideoxysequencingofDNAMOV:MCB4.0\Dideoxysequencin59DNA序列分析儀：四色熒光基團標記的dNTPDNA序列分析儀：60（二）DNA的化學法測序：由Maxam和Gilbert所發(fā)明。其基本原理是用特異的化學試劑作用于DNA分子中的不同堿基，然后用哌啶切斷反應堿基的多核苷酸鏈。用4組不同的特異反應，可使末端標記的DNA分子切成不同長度的片斷，其末端都是該特異的堿基。經(jīng)變性膠電泳和放射自顯影得到測序圖譜

（二）DNA的化學法測序：614組特異的反應如下：（1）G反應：用硫酸二甲酯DMS使鳥嘌呤上的N7原子甲基化，加熱引起鳥嘌呤脫落，多核苷酸鏈可在此處斷裂（2）G+A反應：用甲酸使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質(zhì)子化，從而使其糖苷鍵變得不穩(wěn)定，再用哌啶使鍵斷裂（3）T+C反應：用肼使T和C的嘧啶環(huán)斷裂，再用哌啶除去堿基（4）C反應：當有鹽存在時，只有C與肼反應，并被哌啶除去。嘧啶使修飾堿基脫落，并使去掉堿基的磷酸二酯鍵斷裂4組特異的反應如下：62

32P-GCTACGTA：在A處：32P-GCT和32P-GCTACGT在G處：32p，32p-GCTAC在C處：32P-G和32P-GCTA在T處：32P-GC和32P-GCTACG第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件63硫酸二甲酯（G）：*ACTTCG*ACTTCGACAG甲酸（G+A）：*A*ACTTCG*ACTTCGA*ACTTCGACA*ACTTCGACAG肼/Nacl（C）：*AC*ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG

肼（C+T）：*AC*ACT*ACTT*ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG從下往上讀：CTACGTA，末端G不能讀出。32P*ACTTCGACAG硫酸二甲酯（G）：肼/Nacl（C）：從下往上讀：C64（三）RNA的測序RNA的測序方法有3個：（1）用酶特異切斷RNA鏈：（2）用化學試劑裂解RNA（3）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（三）RNA的測序651995年K.Mullis發(fā)明?；静襟E為：1.設計一對引物以便有效擴增所需要的DNA序列，并盡量減少可能產(chǎn)生的非特異產(chǎn)物2.優(yōu)化反應體系：包括適量模板、引物、4種dNTP、TaqDNA聚合酶和適量Mg2+/video/2008/2616.htm五、DNA聚合酶鏈式反應（PCR）1995年K.Mullis發(fā)明?；静襟E為：五、DNA聚合酶663.選擇3個溫度進行熱循環(huán)：變性94℃，45－60s；退火，根據(jù)引物的Tm，1min；延伸，72℃，1min。循環(huán)4.擴增完成后取出一定量的反應產(chǎn)物，檢測擴增結果：先進行凝膠電泳，用溴化乙啶染色，紫外光下檢測結果3.選擇3個溫度進行熱循環(huán)：67y=產(chǎn)物；x=擴增效率；n＝循環(huán)次數(shù)y=產(chǎn)物；x=擴增效率；n＝循環(huán)次數(shù)68(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的擴增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互補鏈引物1互補鏈單位長度的鏈不同長度的鏈5’3’3’5’引物1互補鏈引物2互補鏈目的片段（不同長度的鏈未示出）聚合酶鏈式反應示意圖(e)(f)(g)(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’369溫度（℃）時間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應的溫度循環(huán)周期如此周而復始，重復進行，直至擴增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實驗需求為止。溫度（℃）時間（min）9494℃變性（1min）60℃退70①模板DNA（單鏈）②引物③DNA聚合酶（Taq）④dNTP⑤Mg2+MOV:MCB4.0\POLYMERASECHAINREACTION①模板DNA（單鏈）MOV:MCB4.0\POLYMERAS71六、DNA的化學合成圖15-6固相合成法（亞磷酸三酯法）合成DNA合成方向：3’→5’端5’-OH用二對甲氧三苯甲基（DMT）保護。3’-OH用氨基亞磷酸化合物活化堿基上氨基用苯甲酸保護六、DNA的化學合成圖15-6固相合成法（亞磷酸三酯法）合72第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件73第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件74第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件75第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件76第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法NucleicAcid第15章NucleicAcid77一、核酸的水解

酸、堿、酶水解作用于磷酸二酯鍵和糖苷鍵DNA/RNA對酸/堿的耐受程度有差別一、核酸的水解酸、堿、酶水解78二、核酸的酸堿性質(zhì)具有芳香環(huán)結構特點能發(fā)生酮式/烯醇式、氨式/亞氨式互變嘌呤和嘧啶堿基都具有弱堿性______主要是環(huán)內(nèi)氨基的貢獻1、堿基的解離二、核酸的酸堿性質(zhì)具有芳香環(huán)結構特點1、堿基的解離79

胞嘧啶中尿嘧啶及胸腺嘧啶中胞嘧啶中80鳥嘌呤和次黃嘌呤中質(zhì)子則結合到N7上鳥嘌呤和次黃嘌呤中質(zhì)子則結合到N7上812、核苷的解離戊糖可增強堿基的酸性解離核糖中的羥基也可發(fā)生解離3.核苷酸的解離磷酸基使核苷酸具有很強的酸性2、核苷的解離82第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件83DNA等電點為4～4.5；RNA等電點為2～2.5第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件84三、核酸的紫外吸收

堿基含有共軛雙鍵最大吸收峰260nm左右三、核酸的紫外吸收堿基含有共軛雙鍵85核酸溶液紫外吸收以摩爾磷的吸光度表示，摩爾磷即相當于摩爾核苷酸。ε：摩爾吸光系數(shù)A：吸收值W：每升溶液磷重量

L：比色杯內(nèi)徑核酸溶液紫外吸收以摩爾磷的吸光度表示，摩爾磷即相當于摩爾核苷86OD260的應用：1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相當于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0含雜蛋白及苯酚，降低3.判斷DNA是否變性OD260的應用：87四、核酸的變性、復性與雜交(一)核酸的變性（denaturation）

1、DNA的變性：

在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。四、核酸的變性、復性與雜交(一)核酸的變性（denatur88某些理化因素破壞了氫鍵和堿基堆積力，使核酸分子高級結構改變、理化性質(zhì)及生物活性發(fā)生改變。

不涉及磷酸二酯鍵斷裂，一級結構不變2、變性的實質(zhì)某些理化因素破壞了氫鍵和堿基堆積力，2、變性的實質(zhì)89降解：核苷酸骨架上3’，5’-磷酸二酯鍵的斷裂DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂降解：核苷酸骨架上3’，5’-磷酸二酯鍵的斷裂DNA變性的90

高溫（一般＞75℃）—熱變性

強酸、堿—酸堿變性

甲醛（Agarose中RNA）

尿素（PAGE中DNA）3、變性因素高溫（一般＞75℃）—熱變性3、變性因91

OD260增高 粘度下降比旋度下降 浮力密度升高酸堿滴定曲線改變 生物活性喪失4、變性后理化性質(zhì)變化RNA變性：從螺旋到線團之間的轉(zhuǎn)變RNA的變性引起的性質(zhì)變化沒有DNA明顯OD260增高 粘度下降4、變性后理化92第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件93完全變性后核酸紫外吸收值增加：天然DNA25－40%、RNA約1.1%實質(zhì)：堿基暴露由于變性或降解引起紫外吸收增加的現(xiàn)象稱增色效應完全變性后核酸紫外吸收值增加：由于變性或降解引起紫外吸收增加94DNA變性DNA變性955、DNA熱變性的特征變性過程是“躍變式”的，而非漸變解鏈曲線：連續(xù)加熱DNA，以溫度對A260作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。5、DNA熱變性的特征變性過程是“躍變式”的，而非漸變解鏈曲96指增色效應達50%時的溫度一般DNATm值在85-90C之間Tm：DNA變性時，OD260達到最大值的50%時的溫度稱為DNA的解鏈溫度或融解溫度(Tm)。大小與G+C含量成正比。Tm：DNA變性時，OD260達到最大值的50%時的溫度稱97第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件98（1）DNA的均一性：（2）G－C含量：

經(jīng)驗公式：XG+C＝（Tm－69.3）×2.44（3）介質(zhì)中的離子強度：

Tm值大小與下列因素有關：（1）DNA的均一性：Tm值大小與下列因素有關：99(二)核酸的復性（renaturation）變性DNA在適當?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈重新締合成雙鏈——復性。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復性，這一過程稱為退火(annealing)。(二)核酸的復性（renaturation）變性DNA在適當100DNA復性DNA復性101第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件102分子量越大復性越難；濃度越大，復性越容易；DNA復性也與它本身組成和結構有關（具有很多重復序列DNA，復性快）。減色效應（低色效應）——復性時紫外吸收減少的現(xiàn)象分子量越大復性越難；復性時紫外吸收減少的現(xiàn)象103(三)核酸的雜交(三)核酸的雜交104第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件105DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復性不同來源的DNA分子DNA-DNA變性復性不同來源的DNA分子106第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件107

Southern雜交Northern雜交Western雜交Southern雜交108Southern雜交是分子生物學的經(jīng)典實驗方法。其基本原理是將待檢測的DNA樣品固定在固相載體上,與標記的核酸探針進行雜交,在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號。通過Southern雜交可以判斷被檢測的DNA樣品中是否有與探針同源的片段以及該片段的長度。

一．基因組DNA的限制酶切

二．基因組DNA消化產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

三．DNA從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物

四.探針標記與雜交

五.洗膜與檢測

/bio101/2006/6908.htmSouthern雜交是分子生物學的經(jīng)典實驗方法。其基本原理是109第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件110Northern雜交是用來測量真核生物RNA的量和大小估計其豐度的實驗方法，可以從大量的RNA樣本同時獲得這些信息。其基本步驟包括：1.完整mRNA的分離2.根據(jù)RNA的大小通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA進行分離3.將RNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上，在轉(zhuǎn)移的過程中，要保持RNA在凝膠中的相對分布4.將RNA固定到支持物上5.固相RNA與探針分子雜交6.除去非特異結合到固相支持物上的探針分子7.對特異結合的探針分子的圖像進行檢測、捕獲和分析Northern雜交是用來測量真核生物RNA的量和大小估計111第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件112Western雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測定融為一體的特異性蛋白質(zhì)的檢測方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先從生物細胞中提取總蛋白或目的蛋白，將蛋白質(zhì)樣品溶解于含有去污劑和還原劑的溶液中，經(jīng)SDS電泳將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，再把分離的各蛋白質(zhì)條帶原位轉(zhuǎn)移到固相膜（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，接著將膜浸泡在高濃度的蛋白質(zhì)溶液中溫育，以封閉其非特異性位點。然后加入特異抗性體（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）與一抗結合后，再加入能與一抗專一性結合的帶標記的二抗（通常一抗用兔來源的抗體時，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗體），最后通過二抗上帶標記化合物（一般為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶）的特異性反應進行檢測。根據(jù)檢測結果，從而可得知被檢生物（植物）細胞內(nèi)目的蛋白的表達與否、表達量及分子量等情況。

Western雜交方法靈敏度高，通?？蓮闹参锟偟鞍字袡z測出50ng的特異性的目的蛋白。第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件113第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件114

核酸的研究方法NucleicAcidNucleicAcid115制備天然核酸必需采用溫和的條件，防止過酸、過堿，避免劇烈攪拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用.一、核酸的分離、提純和定量測定制備天然核酸必需采用溫和的條件，防止過酸、過堿，避免116真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高鹽溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低鹽溶液（0.14mol/LNaCl去除蛋白質(zhì)：水飽和酚，氯仿異戊醇。DNA沉淀：0.3MNaAC-70%乙醇（一）DNA分離純化（一）DNA分離純化117制備RNA時，最重要的是使RNase滅活：①所有容器都要經(jīng)過高溫處理，不能高溫高壓的用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）處理。②加入強變性劑（如胍鹽）使RNase失活；③在RNA的反應體系內(nèi)加入RNase的抑制劑（如RNasin)（二）RNA的分離制備RNA時，最重要的是使RNase滅活：（二）RNA的分離1182、定糖法RNA：核糖→糠醛→→綠色物質(zhì)（670-680nm）DNA：脫氧核糖+二苯胺→蘭色物質(zhì)（595-620nm）苔黑酚/地衣酚濃HCl濃硫酸1、紫外吸收法1個A～50μg/ml雙鏈DNA～40μg/mlRNA或單鏈DNA（三）核酸含量的測定2、定糖法苔黑酚/地衣酚濃HCl濃硫酸1、紫外吸收法（三）核1193、定磷法核酸含磷量為9.5%1g磷相當于10.5g核酸4、瓊脂糖凝膠電泳溴乙錠能插入DNA分子的堿基對間形成復合物在紫外線照射下溴乙錠發(fā)橘紅色熒光熒光強度與DNA含量成正比3、定磷法120純DNA比值1.8，＜1.8Pr、苯酚污染純RNA比值2.0，<2.0DNA、Pr、苯酚污染（四）、核酸純度的測定OD260／OD280純DNA比值1.8，＜1.8Pr、苯酚污染（四）、核酸121二、核酸的沉降特性與超速離心不同構象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度離心可以將不同構象DNA、RNA與蛋白質(zhì)區(qū)分開來二、核酸的沉降特性與超速離心不同構象的核酸（線形、環(huán)形1228MCsCl，45000rpm，16h密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml平衡時：浮力密度=CsCl密度=離心力ρ=ρ0+4.2ω2（r2-r02）×10-10ρ：浮力密度ω：角速度（弧度/秒）r：樣品到轉(zhuǎn)軸的距離（一）核酸密度的測定8MCsCl，45000rpm，16h（一）核酸密度的測定123G-C含量與DNA的浮力密度之間呈正比關系ρ=0.1xG-C+1.658xG-C=（ρ-1.658）×10

（二）測定DNA的G-C含量G-C含量與DNA的浮力密度之間呈正比關系（二）測定DNA的124RNA＞DNA變性DNA＞雙鏈DNA＞蛋白質(zhì)，變性程度越大，浮力密度越大（三）研究核酸的構象RNA＞DNA（三）研究核酸的構象125（四）用于核酸的制備超螺旋DNA或（四）用于核酸的制備超螺旋DNA或126用于大片段DNA的分離，精度低，但分離范圍廣。三、核酸的凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳用于大片段DNA的分離，精度低，但分離范圍廣。三、核酸的凝膠127第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件128用于小片段DNA的分析相對分子質(zhì)量小于1000bp的DNA片斷和RNA的電泳。PAGE中一般不含RNase，用于RNA分析時不會分解樣品。（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）用于小片段DNA的分析（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）129（一）DNA的酶法測定四、核酸的核苷酸序列測定英國Sanger1955確定牛胰島素結構，1958獲諾貝爾化學獎1975設計出DNA測序法，1980獲諾貝爾化學獎合成一段與待測DNA序列互補的DNA片段群。

（一）DNA的酶法測定四、核酸的核苷酸序列測定英國Sa130第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件131末端終止法——Sanger2’，3’雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）是DNA合成鏈延伸的抑制劑。末端終止法——Sanger132第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件133第15章核酸的物理化學性質(zhì)和研究方法課件134MOV:MCB4.0\DideoxysequencingofDNAMOV:MCB4.0\Dideoxysequencin135DNA序列分析儀：四色熒光基團標記的dNTPDNA序列分析儀：136（二）DNA的化學法測序：由Maxam和Gilbert所發(fā)明。其基本原理是用特異的化學試劑作用于DNA分子中的不同堿基，然后用哌啶切斷反應堿基的多核苷酸鏈。用4組不同的特異反應，可使末端標記的DNA分子切成不同長度的片斷，其末端都是該特異的堿基。經(jīng)變性膠電泳和放射自顯影得到測序圖譜

（二）DNA的化學法測序：1374組特異的反應如下：（1）G反應：用硫酸二甲酯DMS使鳥嘌呤上的N7原子甲基化，加熱引起鳥嘌呤脫落，多核苷酸鏈可在此處斷裂（2）G+A反應：用甲酸使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質(zhì)子化，從而使其糖苷鍵變得不穩(wěn)定，再用哌啶使鍵斷裂（3）T+C反應：用肼使T和C的嘧啶環(huán)斷裂，再用哌啶除去堿基（4）C反應：當有鹽存在時，只有C與肼反應，并被哌啶除去。嘧啶使修飾堿基脫落，并使去掉堿基的磷酸二酯鍵斷裂4組特異的反應如下：138

32P-GCTACGTA：在A處：32P-GCT和32P-GCTACGT在G處：32p，32p-GCTAC在C處：32P-G和