選3基因工程 第一節(jié)課件

專題1基因工程

1.什么叫基因？思考討論？3.遺傳信息是如何表達(dá)的？

2.基因、DNA、染色體之間是怎樣的關(guān)系？非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)下游編碼區(qū)上游

RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控遺傳信息的表達(dá)基因的結(jié)構(gòu)（原核細(xì)胞）

RNA聚合酶能夠識(shí)別調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn)，并與其結(jié)合。轉(zhuǎn)錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動(dòng)，并與DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。轉(zhuǎn)錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子，內(nèi)含子能轉(zhuǎn)錄為信使RNA

。內(nèi)含子:外顯子:真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA

聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。不能編碼蛋白質(zhì)的序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子基因工程又叫基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)，是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細(xì)胞內(nèi)，定向的改造生物的遺傳性狀。一、基因工程的定義：理論基礎(chǔ)：基本原理：1.不同生物的基因結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性：（1）基因的基本單位相同（2）具有相同的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則（3）都是雙螺旋結(jié)構(gòu)2.不同生物共用一套密碼子?；蛑亟M基因工程的別名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過程結(jié)果基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平剪切→重組（拼接）→導(dǎo)入→表達(dá)人類需要的基因產(chǎn)物

3.作用結(jié)果：切割DNA分子產(chǎn)生兩種類型的末端----黏性末端和平末端2.作用：識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列并使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。大多數(shù)限制酶能夠識(shí)別的序列均為6個(gè)核苷酸（個(gè)別4、5、8）1.來源：這類酶主要來自于原核生物（分離純化），如：大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)可分離出EcoRI限制酶，目前已從近300種微生物分離出約4000種限制酶（一）“分子手術(shù)刀”-----限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”

T1234512345

ADNA連接酶——“分子縫合針”DNA分子的切割和連接E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶（二）DNA連接酶——“分子縫合針”區(qū)別：E·coliDNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間連接起來，不能將雙鏈DNA片段平末端之間進(jìn)行連接T4DNA連接酶既可“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端，但連接平末端之間的效率比較低DNA連接酶——“分子縫合針”“分子縫合針”－－DNA連接酶種類來源功能EcoliDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體只能連接黏性末端形成磷酸二酯鍵既能連接黏性末端也能連接平末端形成磷酸二酯鍵DNA連接酶和DNA聚合酶的區(qū)別DNA連接酶是在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。

DNA聚合酶是在單個(gè)脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵。大腸桿菌的質(zhì)粒：

最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒，常含有抗藥基因（標(biāo)記基因）。質(zhì)粒能夠“友好”地“借居”在宿主細(xì)胞中。一般來說，質(zhì)粒的存在與否對(duì)宿主細(xì)胞生存沒有決定性的作用。但是，質(zhì)粒的復(fù)制則只能在宿主細(xì)胞內(nèi)完成?；蚬こ痰幕静僮鞒绦?P8)1.目的基因的獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建

3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

4.目的基因的檢測(cè)與鑒定三、基因工程的基本操作程序（3）提取辦法：（2）基因文庫的種類：（1）基因文庫：1.從基因文庫中獲取目的基因目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。（一）目的基因的獲取將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫?；蚪M文庫（含有一種生物所有的基因）和部分基因文庫（如cDNA）含有一中生物的一部分基因根據(jù)目的基因的有關(guān)信息（基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA以及基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性）（2）構(gòu)建cDNA文庫反轉(zhuǎn)錄法：

用某種生物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的多種互補(bǔ)DNA（也叫cDNA）片段，與載體連接后儲(chǔ)存在受體菌群中，該受體菌群體叫這種生物的cDNA文庫。mRNA單鏈DNAcDNA反轉(zhuǎn)錄合成文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小小大基因中啟動(dòng)子（具有啟動(dòng)作用的DNA片段）無有基因中內(nèi)含子（位于編碼蛋白質(zhì)序列中的非編碼DNA片段）無有基因多少某種生物的部分基因某種生物的全部基因物種間的基因交流可以部分可以2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（1）PCR是聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。（2）原理：DNA雙鏈復(fù)制的原理。（3）利用PCR技術(shù)獲取目的基因的前提：是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。（4）PCR的反應(yīng)步驟

PCR一般經(jīng)歷三十多次重復(fù)循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個(gè)基本步驟──高溫變性（90℃-95℃）、低溫復(fù)性（55℃-60℃）和適溫延伸（70℃-75℃）①高溫變性（90℃-95℃）

（模板DNA解旋）模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解鏈為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備.（5）循環(huán)過程靶序列靶序列PCR循環(huán)第一步：加熱變性(90-95℃)②低溫復(fù)性（55℃-60℃）（退火）模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到55-600C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。PCR擴(kuò)增儀靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步：引物與靶序列結(jié)合(55-60℃)③適溫延伸（70℃-75℃）

DNA模板——引物結(jié)合在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，合成一條新的DNA鏈.靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步：引物延伸(70-75℃)靶序列靶序列第1個(gè)PCR循環(huán)完成后：得到兩個(gè)拷貝的靶序列循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201,048,576301,073,741,82430次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量PCR循環(huán)的結(jié)果②DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增;①從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸;3、通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成條件：基因比較小核苷酸序列已知

根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基因核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成小結(jié)目的基因的獲取

1、從基因文庫中獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、通過化學(xué)方法人工合成:(1)反轉(zhuǎn)錄法(2)氨基酸----mRNA----脫氧核苷酸序列（推測(cè)）----化學(xué)合成(3)通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成（條件）（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建

─基因工程的核心2.結(jié)構(gòu)組成：3.啟動(dòng)子：4.終止子：5.標(biāo)記基因：1.目的：（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建

─基因工程的核心使目的基因在受體細(xì)胞中中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。啟動(dòng)子、目的基因、終止子、標(biāo)記基因等位于基因的首端，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的開始。位于基因的尾端，控制轉(zhuǎn)錄的結(jié)束。作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否有目的基因。（三）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化：是指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：a.農(nóng)桿菌的感染對(duì)象：可感染雙子葉植物、裸子植物，而對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。b.感染原理：農(nóng)桿菌具有趨化性：植物體受損時(shí)，會(huì)分泌大量的酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌移向這些細(xì)胞，農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。方法：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法等。c.過程：2.基因槍法：3.花粉管通道法：2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞--顯微注射法

（1）顯微注射法是最常用、最有效的方法（2）操作程序：①提純目的基因的表達(dá)載體，保持DNA的濃度為1-3μg/ml②取卵，體內(nèi)或體外受精，采用顯微注射儀把基因的表達(dá)載體注射進(jìn)入受精卵③移植受精卵到雌性動(dòng)物的輸卵管或子宮內(nèi)，發(fā)育為具有新性狀的動(dòng)物3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞（1）原核細(xì)胞的特點(diǎn)：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少。（2）轉(zhuǎn)化過程：以大腸桿菌作為受體細(xì)胞的應(yīng)用最廣泛，其最常用轉(zhuǎn)化方法是：①用Ca2+處理大腸桿菌細(xì)胞成為感受態(tài)細(xì)胞──能吸收周圍環(huán)境中的DNA分子②將重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子。（四）目的基因的檢測(cè)與鑒定目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳性狀，只有通過檢測(cè)與鑒定才能知道。這是檢查基因工程是否成功的一步。分子水平的檢測(cè)個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定首先，要檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因，這是目的基因能否在真核生物中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵。檢測(cè)方法是采用DNA分子雜交技術(shù)（基因探針）其次，還需要檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，這是檢測(cè)目的基因是否發(fā)揮功能作用的第一步。檢測(cè)方法是采用分子雜交技術(shù)（基因探針）最后，檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)。檢測(cè)方法是進(jìn)行抗原---抗體雜交分子水平的檢測(cè)個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定：一個(gè)抗蟲或抗病的目的基因?qū)胫参锛?xì)胞后，是否賦予了植物抗蟲或抗病特性，需要做抗蟲或抗病的接種實(shí)驗(yàn)，以確定是否具有抗性以及抗性的程度。細(xì)菌的檢測(cè)，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)形成菌落，檢測(cè)菌落中是否有目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。淘汰無表達(dá)產(chǎn)物的菌落，保留有表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。有的基因工程產(chǎn)品需要與天然產(chǎn)品的功能進(jìn)行活性比較，以確定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的功能活性是否與天然產(chǎn)品相同。無表達(dá)產(chǎn)物無表達(dá)產(chǎn)物有表達(dá)產(chǎn)物無表達(dá)產(chǎn)物獲取目的基因基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定小結(jié)1）以下說法正確的是（）

A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列

B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體

C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接

D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)