腫瘤個體化治療檢測技術(shù)指南(試行)

1122腫瘤個體化治療檢測技術(shù)指南（試行）前言腫瘤的個體化治療基因檢測已在臨床廣泛應(yīng)用，實現(xiàn)腫瘤個體化用藥基因檢;醫(yī)學(xué)實驗室為患者或臨床醫(yī)護(hù)本指南是參考現(xiàn)行相關(guān)的法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及腫瘤個體化治療靶點基因的不斷發(fā)現(xiàn),本技術(shù)規(guī)范相關(guān)內(nèi)容也將進(jìn)行適時調(diào)整。本指南起草單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室、蘇專家修訂。本指南起草人：詹啟敏、曾益新、王玨、姬云、錢海利、李曉燕、孫石磊目錄1.本指南使用范圍 12。簡介 1標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語和基因突變命名 1標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語 13。2基因突變命名 2參考序列 2各類變異 24。分析前質(zhì)量保證 5樣本類型及獲取 5采樣質(zhì)量的評價 64。3樣本采集中的防污染 64。4樣本運(yùn)送和保存 65。分析中質(zhì)量保證 75.1實驗室設(shè)計要求 75。2檢測方法 75.3DNA提取方法與質(zhì)量控制 135。4RNA提取方法與質(zhì)量控制 14試劑的選擇、儲存及使用注意事項 14核酸擴(kuò)增質(zhì)量控制 14設(shè)備維護(hù)和校準(zhǔn) 155。8人員培訓(xùn) 155.9方法的性能驗證 156。分析后質(zhì)量保證 176。1檢測結(jié)果的記錄 176.2失控結(jié)果的記錄與分析 176。3報告及解釋 17記錄保留 18檢測后基因咨詢 18樣本（及核酸）保留與處理 186。7檢測與臨床數(shù)據(jù)收集與分析 187。腫瘤個體化醫(yī)學(xué)檢測的質(zhì)量保證 197.1標(biāo)準(zhǔn)操作程序 197。2質(zhì)控品 19室內(nèi)質(zhì)量控制 20室間質(zhì)量評價 207。5PCR污染控制 20附錄A：常見的檢測項目 22A。1基因突變檢測項目 22A.2基因表達(dá)檢測項目 30A。3融合基因檢測項目 33A。4基因甲基化檢測項目 34參考文獻(xiàn)： 371.本指南使用范圍測的醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床分子檢測實驗室。2。簡介腫瘤個體化治療以疾病靶點基因診斷信息為基礎(chǔ),以循證醫(yī)學(xué)研究結(jié)果為依據(jù),為患者提供接受正確治療方案的依據(jù)，已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的趨勢。臨床SNP,指導(dǎo)臨床個體化治療，能夠提高療效,減輕不良反應(yīng)，促進(jìn)醫(yī)療資源的合理利用.3。標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語和基因突變命名標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語1）基因（Gene：DNA。突變（Mutation）:DNA3)（新的基因的過程。融合基因的表達(dá)產(chǎn)物為融合蛋白。新的基因的過程。融合基因的表達(dá)產(chǎn)物為融合蛋白?；虮磉_(dá)(GeneExpression):DNADNAmRNA開始，一直到對于蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾為止?；驍U(kuò)增（geneamplification):為一特異蛋白質(zhì)編碼的基因的拷貝數(shù)選擇性地增加而其他基因并未按比例增加的過程。增加而其他基因并未按比例增加的過程。DNA甲基化(DNAMethylation）:DNA化學(xué)修飾的一種形式，將甲基添加DNADNA分子上,5碳上.DNADNA序列的DNA甲基化狀態(tài)遺傳至下一代細(xì)胞或個體。聚合酶鏈反應(yīng)PCRDNA片段的技術(shù)。利用DNA在體外攝氏高溫時變性會變成單鏈,低溫時引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對的原則結(jié)體外攝氏高溫時變性會變成單鏈,低溫時引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對的原則結(jié)DNADNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖的方向合成互補(bǔ)鏈。8)8),這種物質(zhì)通常與其他雜質(zhì)混在一起，專門用于質(zhì)量控制目的的樣本或溶液。這種物質(zhì)通常與其他雜質(zhì)混在一起，專門用于質(zhì)量控制目的的樣本或溶液。基因突變命名人類基因組突變學(xué)會（HGVS)已建立系統(tǒng)的基因突變命名方法。具體基因突變命名方法可查閱網(wǎng)站/mutnomen/index.html.HGVS基因突變命名指南根據(jù)需求不斷更新.本文以2011年8月更新版本為準(zhǔn)..例如“g?！北硎净蚪M序列，“c."表示cDNA序列，“m.”表示線粒體DNA序列,“r。”表示RNA序列列出，當(dāng)兩種突變在反式（intrans）中檢測到，則用方括號表示。例如，CF變?yōu)殡s合性突變（5081303)，則在DNA水平規(guī)范描述方式為c。[1521_1523delCTT]+［3909C〉G］.3。3參考序列美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI）收錄的參考序列編碼具有權(quán)威性及唯一性。其中前綴“NM_”表示為mRNA序列,“NP_”表示多肽序列,“NG_”表示.5以及3'當(dāng)使用某段編碼DNA參考序列描述突變時,應(yīng)選擇合適的轉(zhuǎn)錄體，且轉(zhuǎn)錄體的起,數(shù)據(jù)庫里注釋最全面的版本.3。4各類變異3。4.1DNA序列變異術(shù)語規(guī)范DNAA（腺嘌呤)、C（胞嘧啶、G（鳥嘌呤)T（腺嘧啶）DNADNA>變方式時，數(shù)字、字母、箭頭、上標(biāo)以及下標(biāo)之間不應(yīng)出現(xiàn)空格.PAGEPAGE33。4。2RNA序列變異術(shù)語規(guī)范RNA腺嘌呤c(胞嘧啶)鳥嘌呤尿嘧啶）行描述.RNADNAHGVS網(wǎng)站（http：///mutnomen/index.html）.3.4。3蛋白質(zhì)序列變異術(shù)語規(guī)范蛋白質(zhì)序列改變通常以單個字母或三個字母（第一個字母大寫）管單個字母描述氨基酸明確無誤,但是由于三聯(lián)密碼子相對于其編碼的氨基酸存在冗余性,具體給出發(fā)生突變的三聯(lián)體密碼子可以更清楚地描述氨基酸改變方A（丙氨酸、C（半胱氨酸)、G（甘氨酸)T（蘇氨酸)A（腺嘌呤、C（胞嘧啶、G（鳥嘌呤）T（胸腺嘧啶）相混淆.3.4.4錯義突變及無義變異術(shù)語規(guī)范DNADNA水平對某一突變位點的描述方式包括堿基位點，正常堿基551（甘氨酸）（天冬氨酸DNA水c.1652G>A。在氨基酸水平,由于錯義突變的產(chǎn)物以氨基酸殘基位點以及表示氨基酸的單字母或三聯(lián)體密碼子來描述。表示方法是野生型的氨基酸、位點、突變氨基酸，三者之間不要有空格。例如,p.Gly551Asp551號甘氨酸殘基（G)被天冬氨酸殘基（D)所代替。無義突變表示方法與之相類似.542位點的甘氨酸殘基被終止密碼子所代替.3。4。5缺失和插入術(shù)語規(guī)范del”和“ins”來表示，并注明突變位點以及堿基.例如，c.441delADNA441A堿基缺失.c241_243delATCDNA241243ATC三個堿基。p。Ile24del24號的indels”則表示該段序列缺失的同時有片段插入.DNA234239號位點缺失AATTCG六個堿基，同時該段位點被新插入的TA堿基所替代.3。4。6移碼突變術(shù)語規(guī)范符號來表示His62Profs*21表示該蛋白發(fā)生移碼突變,62號氨基酸由組氨酸突變?yōu)楦彼?221p.His62fs62號密碼子發(fā)生移碼突變。3.4。7堿基重復(fù)序列HGVS推薦，核苷酸重復(fù)序列基因多態(tài)性描述時通常以一個重復(fù)序列為單元[]CG［55。當(dāng)重復(fù)序列的次數(shù)在一個范圍之內(nèi)（,如某個人HTT1215CAG:+[15］，蛋白水平則表示為:p。Gln18［12]+［15］。HTT則描述為：c。52CAG（27_35)或p.Gln18（27_35）。3。4.8遺傳藥理學(xué)基因型術(shù)語規(guī)范最廣泛使用的命名法描述遺傳藥理學(xué)基因型不同于其他遺傳學(xué)基因檢測，例如代謝相關(guān)基因細(xì)胞色素p450家族，人類細(xì)胞色素P450（CYP）等位基因命名委員會（http：//www.cypalleles。ki.se）推薦用“*”命名，見圖1。在該系統(tǒng)中，最常見的等位基因被指定為“＊1”.圖1.細(xì)胞色素P4502D6等位基因命名規(guī)范3.4。9其他對于更復(fù)雜的突變，可參考HGVS（/mutnomen）建議的命名規(guī)則，解決其他復(fù)雜的變異的命名。4PAGEPAGE37PAGEPAGE364。分析前質(zhì)量保證樣本類型及獲取新鮮組織(包括手術(shù)和活檢組織）腫瘤新鮮冷凍材料可提取出最高品質(zhì)的DNA、RNA,以免產(chǎn)生假陰性結(jié)果。切割后取其中一半，并利用另一半切面制作組織標(biāo)本,然后進(jìn)行確認(rèn)?！姹?，這一過程應(yīng)在手術(shù)樣本離體后30需先進(jìn)行病理學(xué)分析,在分析完成后應(yīng)盡早將組織樣本置于穩(wěn)定劑中,避免核酸降解。。2石蠟包埋組織（formalin-fixedparaffin-embedded，F(xiàn)FPE）10%中性福爾馬林固定手術(shù)切除樣本,按病理學(xué)操作規(guī)范進(jìn)行取材。5片連續(xù)切片,1HE的含量。在高靈敏度檢測方法中，可考慮使用活檢標(biāo)本。DNA容易受固定的影響，長時間（1周以上）浸泡在福爾馬林中的樣本的DNA會被片段化,246～24小時為佳。胸腹水等細(xì)胞學(xué)樣本/冷凍保存，也可在含有細(xì)胞成（AL公司)等室,血漿樣本DNA(circulatingfreeDNADNA的比例在不同腫瘤及病例中相差懸殊（0。01～93%，從而限制了外周血在腫瘤分子檢測時的應(yīng)用。目前已有多篇文獻(xiàn)證實可DNA檢出突變,ARMS法。DNA6~10ml全血，冷藏運(yùn)輸，6小時內(nèi)分離血漿，提取游離DNA，保存到—80℃冰箱中,并避免反復(fù)凍融。如外周血需長時間運(yùn)輸，建議用DNA樣本保存管，在常溫條件下，cfDNA7天。采樣質(zhì)量的評價腫瘤細(xì)胞是否存在,是開展腫瘤個體化治療基因檢測的重要前提.如果要確認(rèn)腫瘤細(xì)胞存在,與病理診斷醫(yī)生密切合作是非常必要的.運(yùn)輸。評價方法包括肉眼觀察、顯微鏡下觀察和濃度分析等。腫瘤組織切片等應(yīng)經(jīng)病理醫(yī)師審閱，取一張切片HE染色后顯微鏡下觀察,確保腫瘤細(xì)胞存在，并記錄腫瘤組織含量，標(biāo)注腫瘤細(xì)胞密集區(qū)域.4。3樣本采集中的防污染樣本采集最好采用一次性材料，不用處理便可直接使用;的殘留；采集中要特別注意防止污染，防止混入操作者的毛發(fā)、表皮細(xì)胞、痰液等；如使用玻璃器皿,必須經(jīng)高壓滅菌，以使可能存在的DNase失活；如提取RNA樣品，必須采用RNase抑制劑措施和無RNase材料.4。4樣本運(yùn)送和保存原則上按照《個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南》要求進(jìn)行。實驗室應(yīng)建立詳細(xì)的樣本運(yùn)送標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP需要轉(zhuǎn)送的樣本:RNA后，放在干冰中運(yùn)送。經(jīng)過適當(dāng)穩(wěn)定化處理的樣本可在常溫下運(yùn)送，如用于DNA擴(kuò)增檢測的EDTA抗凝全血樣本及用于RNA擴(kuò)增檢測的經(jīng)穩(wěn)定化處理的樣本。5。分析中質(zhì)量保證實驗室設(shè)計要求原則上按照《個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南》要求進(jìn)行.在符合國家衛(wèi)生計生委要求的個體化醫(yī)學(xué)檢測實驗室和通過審核驗收的臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室完成。5。2檢測方法5。2。1Sanger5。2。1.1技術(shù)原理Sanger（ChainTerminationMethodDNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物.直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。3—OH基團(tuán)，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在GATC處終止.終止點由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定.dNTPsddNTPs的相對濃度可以調(diào)整,使反應(yīng)得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上,可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測.5.2。1。2技術(shù)特點DNADNA的序列,因此被認(rèn)為是基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)。形式及突變的確切類型,如點突變、片段缺失.20%細(xì)胞的含量和比例要求較高，一般要求腫瘤細(xì)胞含量不低于50％，如果腫瘤細(xì)胞比例低于50％，則假陰性出現(xiàn)的概率會顯著增加；不適用于活檢或細(xì)胞學(xué)樣本.5.2.2焦磷酸測序法（Pyrosequencing）5。2.2。1技術(shù)原理4DNADNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和4dNTP聚合時（PPi)與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來,通過檢測熒光的釋放和DNA序列和定量分析序列變化的目的.5。2.2.2技術(shù)特點焦磷酸測序技術(shù)是一種新型的酶聯(lián)級聯(lián)測序技術(shù)，其重復(fù)性和精確性可與Sanger測序相媲美,序分析.主要優(yōu)點：檢測靈敏度為10％，相對Sanger測序法高,對體細(xì)胞突變和甲基化等可實現(xiàn)定量檢測;分型準(zhǔn)確可靠,通量較高，實驗設(shè)計靈活，可發(fā)現(xiàn)新的突變或遺傳變異。局限性：測序長度較短，不能對長片段進(jìn)行分析。檢測靈敏度中等，難以檢出低于10%的突變.不適用于活檢或細(xì)胞學(xué)樣本.5。2。3新一代測序（nextgenerationsequencing,NGS）。3.1技術(shù)原理NGS又稱大規(guī)模平行測序MPS，包含多種可以一次性產(chǎn)生大量數(shù)字化基因序列的測序技術(shù),Sanger測序的革命性進(jìn)步,DNA分子進(jìn)行測序，實現(xiàn)了大規(guī)模、高通量測序的目標(biāo)。不同廠家的產(chǎn)品測序原理不同,主要分為邊合成邊測序（SequencingbysynthesiSBS、基于A簇和可逆性末端終結(jié)（ReversibleTerminato）大45。2。。2技術(shù)特點高通量測序技術(shù)不僅可以進(jìn)行大規(guī)?；蚪M測序,還可用于基因表達(dá)分析、RNADNA主要優(yōu)點：高通量測序技術(shù)有三大優(yōu)點是傳統(tǒng)Sanger測序法所不具備的。第序技術(shù)有定量功能,DNADNA的豐度。第三、利用傳統(tǒng)Sanger27在利用高通量測序技術(shù)進(jìn)行人類基因組測序,1千美金。,10%;NGS化和質(zhì)量控制尚未形成共識。5.2。4擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS)—PCR法5。2.4。1技術(shù)原理（amplificationrefractorymutationsystemARMSPCR(allele—specificPCR,AS—PCR）5`DNA互補(bǔ),端引物PCR,DNAPCRPCR不能延伸。。2技術(shù)特點ARMS-PCR是目前實驗室常用的基因突變檢測方法。主要優(yōu)點：ARMS-PCR法檢測靈敏度高，可檢測腫瘤細(xì)胞中突變比例為1%甚至更低的突變基因。局限性:只能檢測已知的突變類型，不能發(fā)現(xiàn)一些新的、未知的突變；如果應(yīng)增加;DNA樣本量的需求增加。高分辨率熔解曲線（HRM)法5。2。5。1技術(shù)原理高分辨率熔解曲線（high-resolutionmelting，HRM)PCR新型技HRMDNA雙鏈體的熔解溫度差異反應(yīng)了基因的變異。雙鏈DNA片段在其特定的溫度熔解，熔解的溫度由片段的CG含量、序列組成、長度以及一個和多個雜合堿基決定.DNA嵌合的染料可PCR擴(kuò)增片段，擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過一個快速的可控的加熱處理開始熔解.熒光水平在升溫的過程中實時監(jiān)測，染料隨著雙鏈DNA的熔解，熒光信號逐漸減少。5。2.5.2技術(shù)特點HRM型、序列匹配、DNA甲基化等方面的研究。主要優(yōu)點：檢測靈敏度1%，特異性高，重復(fù)性好；封閉體系，減少污染的可能性;擴(kuò)增和檢測同時進(jìn)行，無需PCR后進(jìn)行處理。需要有測序等補(bǔ)充。PCR（DigitalPCR）技術(shù)原理PCR是一種核酸分子絕對定量技術(shù)。相較于qPCR,PCR能夠直接DNA萬份,(模板)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對各個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)字PCRLIFE、FluidigmRainDancePCR產(chǎn)品。5.2。6.2技術(shù)特點數(shù)字PCR目前的應(yīng)用包括：稀有等位基因檢測、基因表達(dá)絕對定量、核酸標(biāo)準(zhǔn)品絕對定量、二代測序文庫絕對定量等。主要優(yōu)點：靈敏度可達(dá)0.001～0.0001％，高特異性，可檢測復(fù)雜背景下的靶標(biāo)序列；可高度耐受PCR反應(yīng)抑制劑；不必依賴對照品或標(biāo)準(zhǔn)品,可對目標(biāo)拷貝數(shù)直接進(jìn)行精確的鑒定，分析微小的濃度差異;實驗數(shù)據(jù)分析便捷，每個微滴的檢測結(jié)果以陰性、陽性判讀，數(shù)據(jù)分析自動化；可統(tǒng)計突變率，通過統(tǒng)計分析可得出靶點的突變率.PCR儀通量較低,FAMHEX2PCRDNA合泊松分布;PCR,qPCR，也不能代替其他金標(biāo)準(zhǔn)而作為首選方法。QX200PCR.55。2。7熒光原位雜交（FISH)。1技術(shù)原理熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）是通過熒光標(biāo)記的DNADNADNA纖維DNA與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性,即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體.將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報告分子如生物素、地高辛,可利用該報告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化DNA5.2。7.2技術(shù)特點FISH主要可對基因缺失、基因融合、基因擴(kuò)增進(jìn)行檢測。主要優(yōu)點:DNA空間定位精確；靈敏、特異性好,可同時分析分裂期和間期的多個細(xì)胞，并進(jìn)行定量；可以檢測隱匿或微小的染色體畸變及復(fù)雜核型。局限性:FISH檢測對操作和判讀技術(shù)要求較高，診斷醫(yī)師必須經(jīng)過嚴(yán)格的FISHFISH可靠性;FISH檢測的成本昂貴、通量低。5.2。8免疫組化（IHC）5。2。8.1技術(shù)原理其達(dá)到對組織或細(xì)胞中的相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位或定量的研究。5。2。8.2技術(shù)特點IHCFISH,IHC結(jié)果的因素主要包括抗體的選擇、檢測前組織的固定，觀察者解釋方面的差別等。5.2。95.2.9。1技術(shù)原理PCR（reversetranscriptionPCR）PCR(reversetranscription-PCR，R—PCR，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR)RNADNA（cDNA）稱作“逆轉(zhuǎn)錄”,DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶）來完成。隨后，DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引DNADNAPCRRNARNA酶HDNA.技術(shù)特點熒光定量PCR是檢測拷貝數(shù)變化的一種快速且經(jīng)濟(jì)的技術(shù)方法,RNA要不足是對腫瘤組織提取RNA的質(zhì)量要求較高,在檢測基因表達(dá)量時判讀標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一。FISH、IHCQ-RT-PCRALK1。表1：FISH、IHC和Q—RT-PCR檢測ALK基因重排的優(yōu)缺點比較IHCFISHQ-RT-PCR檢測對象蛋白DNARNA特異性++++++發(fā)現(xiàn)的融合類型已知、未知已知、未知已知通量+++++++費(fèi)用++++++++5.2.3檢測方法選擇策略綜合選擇合適的方法。由于腫瘤組織的異質(zhì)性，檢測的組織樣本中混有大量正常組織、石蠟樣本提由于腫瘤組織的異質(zhì)性，檢測的組織樣本中混有大量正常組織、石蠟樣本提取的DNA取的DNA質(zhì)量和數(shù)量有限，就檢測靈敏度而言，目前ARMS—PCR>焦磷酸測序〉Sanger測序.在檢測腫瘤基因突變時，不能一味追求檢測方法的靈敏度,靈敏度高的檢測方法對整個實驗過程中的質(zhì)控要求更為嚴(yán)格，需防止因污染而產(chǎn)生假陽性。在腫瘤靶基因表達(dá)檢測時，由于腫瘤樣本的不可再生性，需謹(jǐn)慎選擇使用的方法，如選用熒光定量PCR要求提取的總RNA量達(dá)1μg以上,如果腫瘤組織過小提取的RNA量可能達(dá)不到檢測要求，此時應(yīng)考慮選用對樣本量要求低的檢測方法。5。2。4檢測項目本指南根據(jù)檢測靶分子（DNARNA）類型及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制類型的不同，將腫瘤個體化治療檢測項目分為基因突變、基因表達(dá)、融合基因、基因甲基1,5。3DNA提取方法與質(zhì)量控制DNA（HE染色（5025%，對于ARMS等敏感性較高的方法，腫瘤細(xì)胞的含量和比例可以低一些。具體視所采用的DNA提取方法和突變檢測方法的敏感度等而定。對于新鮮和凍存的手術(shù)組織樣本,DNADNA的試劑盒。對于商品化核純化的靶核酸的完整性可使用凝膠電泳將樣本的核酸提取物與核酸標(biāo)準(zhǔn)品比較測定。核酸提取的產(chǎn)率:可在A260讀數(shù)測定，DNA可溶于TE溶液中，建議濃度控制在50~100ng/ul,總量20~40μg或以上。核酸純度可通過提取物260/280比率判定,DNA1.8RNA20。若DNA1.8，說明制劑中RNARNADNA溶液中含有酚和蛋白質(zhì)將導(dǎo)致比值降低。5。4RNA提取方法與質(zhì)量控制RNA提取常比較困難，尤其是保存年限較長的腫瘤組織，RNARNA降解的原因有兩個方面:RNA23位置帶有羥基,RNARNA溫后仍然能夠正確折疊恢復(fù)活性。因此從樣本的儲存、RNARNaseRNA的降解作用。RNA提取的經(jīng)典方法是胍鹽提取結(jié)合酚-RNARNARNA類型來選擇。RNase100ng/ul以上，總量達(dá)30μg以上。RNAOD260/OD280比值,RNA：1.7＜OD260/OD280＜20(＜17時表明可能有異硫氰酸殘存DNARNA的完整程度.5。5試劑的選擇、儲存及使用注意事項CFDACFDA批準(zhǔn)的試劑,或具有嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)的自配試劑（LD。IFCCWHO等推薦的方法性能。所用標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)參考物符合國家衛(wèi)生計生委臨床檢驗中心推薦的標(biāo)準(zhǔn)和要求。5。6核酸擴(kuò)增質(zhì)量控制PCR.臨床樣本擴(kuò)增時，經(jīng)常出現(xiàn)假陽性和假陰性，導(dǎo)致檢測結(jié)果得出錯誤結(jié)論，有時可造成嚴(yán)重后果.1DNADNA擴(kuò)增的有效性,1DNAcDNADNARNA.陰性對照樣品檢測為陰性品檢測結(jié)果成立的前提下,才能對檢測樣品擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行判定。5.7設(shè)備維護(hù)和校準(zhǔn)與維護(hù)關(guān)系到儀器的適用率、數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率。術(shù)人員共同完成,驗收內(nèi)容按采購合同中技術(shù)需求部分以服務(wù)協(xié)議書的要求逐項進(jìn)行，并且建立儀器設(shè)備檔案.儀器設(shè)備應(yīng)定期開展校準(zhǔn)計量,未經(jīng)計量檢定、計量檢定不合格或未驗收的對測試有重要影響的儀器設(shè)備不得投入使用.實驗室日常工作中，應(yīng)重視儀器設(shè)備的清潔及維護(hù)，做到日維護(hù)、周維護(hù)、月維護(hù)，并及時記錄.5。8人員培訓(xùn)檢測人員應(yīng)該有相關(guān)的教育背景、相應(yīng)的工作經(jīng)驗，接受過專業(yè)培訓(xùn)。培維護(hù)及校準(zhǔn)、質(zhì)量控制等,檢測人員應(yīng)該有相關(guān)的教育背景、相應(yīng)的工作經(jīng)驗，接受過專業(yè)培訓(xùn)。培維護(hù)及校準(zhǔn)、質(zhì)量控制等,外部培訓(xùn)包括國家衛(wèi)生計生委臨床檢驗中心和國家衛(wèi)生計生委個體化醫(yī)學(xué)檢測培訓(xùn)基地等機(jī)構(gòu)組織開展的各種技術(shù)培訓(xùn)。5.9方法的性能驗證方法學(xué)引進(jìn)初期需對檢測系統(tǒng)測定項目各參數(shù)的實驗或評估性驗證，包括精所有項目的方法驗證應(yīng)形成詳細(xì)的資料備存,資料需詳細(xì)描述方法驗證的目的、過程、檢測結(jié)果、分析判斷及驗證結(jié)論.驗證的結(jié)果及結(jié)論須經(jīng)實驗室負(fù)責(zé)人簽字后才能用于臨床檢測。根據(jù)項目的特性,一些方法驗證指標(biāo)不需進(jìn)行或未進(jìn)行時，需在報告中書面解釋原因。推薦用打印的文稿并在專用文件夾保存.具體的性能驗證方法,CFDA上相應(yīng)的性能指標(biāo)部分進(jìn)行驗證,看是否能在其實驗室內(nèi)復(fù)現(xiàn)說明書所顯示的上LDT立上述性能指標(biāo).以下方法可供參考?！緶?zhǔn)確度】參加國家衛(wèi)生計生委臨檢中心組織的室間質(zhì)評,從室間質(zhì)評統(tǒng)計結(jié)果評價實驗室檢測結(jié)果的偏倚或符合情況，從而評價和驗證實驗室檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。2）20用兩種方法同時測定同樣的樣品.如結(jié)果有不符合時，應(yīng)采用第三種方法或試劑進(jìn)行確認(rèn)。樣本稀釋成不同濃度再檢測，以評估其準(zhǔn)確度?！眷`敏度】分析靈敏度:就是確定檢測方法的檢測下限：將一份已知定值的標(biāo)準(zhǔn)品，用野3管，3管全部檢出且其線性∣r∣≥0.98的最低稀釋濃度即為該方法的檢測下限.(10倍以下的稀釋2)臨床靈敏度：主要是驗證方法的假陰性率。從三甲醫(yī)院或?qū)I(yè)權(quán)威檢測機(jī)構(gòu)收20～50例樣本,進(jìn)行檢測分析，其靈敏度應(yīng)滿足臨床檢測要求，靈敏度=[TB/TB+FN］10（TB=truepositiveFN=falsenegativeCFDA試劑,20例陽性樣本進(jìn)行驗證;CFDA批文的檢測試劑或自己實驗室研LDT50例陽性樣本進(jìn)行驗證，并應(yīng)進(jìn)行室間比對?！咎禺愋浴?）特異性的驗證主要是確認(rèn)該方法的假陽性率，特異性=［TN/（TN+FP)]×100(TN=truenegative、FN=falsepositive）.20～50例陰性樣本,特異性應(yīng)滿足臨床檢測要求。有CFDA20CFDA批文的檢測項目或自己研發(fā)的項目,50驗證。6。分析后質(zhì)量保證6。1檢測結(jié)果的記錄1）檢測結(jié)果的報告應(yīng)準(zhǔn)確、清晰、明確、客觀和及時，杜絕虛假報告。儀器原始數(shù)據(jù)要仔細(xì)分析,PCR擴(kuò)增的有效性，只有當(dāng)質(zhì)控品的擴(kuò)增結(jié)果符合項目SOP有關(guān)條件時，才可發(fā)出報告，否則應(yīng)重新測定。3）報告內(nèi)容至少應(yīng)包括：實驗室失控結(jié)果的記錄與分析如發(fā)現(xiàn)質(zhì)控數(shù)據(jù)違背了控制規(guī)則，操作員應(yīng)填寫失控記錄或失控報告單，上質(zhì)控品測定合格后再簽字發(fā)出.報告及解釋1),需提供紙質(zhì)版檢測,送檢醫(yī)生通過登陸網(wǎng)站進(jìn)行檢測結(jié)果的查詢。2）檢驗報告單的應(yīng)具有患者基本信息、樣本情況（采集、送檢及檢測時間、樣本性質(zhì)及狀態(tài)等、檢測項目、檢測方法、結(jié)果、結(jié)果的意義、用藥建議、檢測核者對檢驗報告的質(zhì)量負(fù)責(zé)。核者對檢驗報告的質(zhì)量負(fù)責(zé)。3）結(jié)果解釋的責(zé)任屬于臨床實驗室，應(yīng)根據(jù)所檢測的人群解釋結(jié)果。臨床解釋.綜合.綜合義，為個體化用藥提出建議。記錄保留患者和樣本信息:接收樣本后,,11年以上.《檢測過程實驗記錄》保存于擴(kuò)增區(qū)的專用文件6。5檢測后基因咨詢單上提供咨詢服務(wù)的方式和途徑，如客戶服務(wù)專線,配置專業(yè)的咨詢服務(wù)人員；方便臨床醫(yī)生和患者隨時反饋意見和提出咨詢。6。6樣本（及核酸）保留與處理并按規(guī)定存放，保存好樣本的原始標(biāo)碼,建立配套的樣本存放信息管理系統(tǒng)。醫(yī)療廢物管理辦法》及國家、地區(qū)的相關(guān)要求。6。7檢測與臨床數(shù)據(jù)收集與分析節(jié)。臨床的檢測結(jié)果應(yīng)定期統(tǒng)計分析,如基因突變的陽性率，如果發(fā)現(xiàn)陽性率高于資料報道值,,如果陽性率偏低,測方法的局限性考慮假陰性的可能,并進(jìn)行針對性的改進(jìn)。腫瘤個體化治療檢測的質(zhì)量保證標(biāo)準(zhǔn)操作程序原則上按照《個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南》的要求進(jìn)行。腫瘤個體化治SOP測方法、結(jié)果分析和報告、儀器操作、實驗室安全措施等臨床檢驗的所有環(huán)節(jié)。SOPSOP中的步驟要求進(jìn)行操作,應(yīng)每年定期根據(jù)實驗室的運(yùn)行狀況進(jìn)行SOP且規(guī)范進(jìn)行，并防止無效或作廢版本文件使用。7。2質(zhì)控品樣本等，都應(yīng)合理設(shè)置質(zhì)控品。7。2.1質(zhì)控品類型陽性對照：以含有目的片段的DNA(或質(zhì)粒)作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，證明PCR試劑是否有效、擴(kuò)增過程是否正確.但陽性樣品擴(kuò)增效率高,應(yīng)嚴(yán)格控制其濃度和存放位置，避免其成為潛在的污染源。例如，檢測基因突變時，應(yīng)根據(jù)選用的檢測方法，選擇該方法最低檢測限的陽性樣本.陰性對照：以不含有目的片段的陰性樣品作為模板進(jìn)行擴(kuò)增,用于證明擴(kuò)增過程中無假陽性現(xiàn)象。空白對照:以純水作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用于證明擴(kuò)增過程中無假陽性現(xiàn)象.PCR抑制物對照：在與陽性對照相同的反應(yīng)體系中,DNADNAPCR抑制物。,DNA提取試劑或過程中可能受到污染。陽性提取對照:陽性提取對照擴(kuò)增結(jié)果為陰性，說明提取過程可能有誤。如DNA陽性對照擴(kuò)增結(jié)果為陰性,DNA性,PCR.基因檢測單核苷酸多態(tài)性（SNP)時，需要設(shè)置多個陽性對照用于檢測野生.本，如基質(zhì)或采樣方法與待測樣本相同.7。3室內(nèi)質(zhì)量控制則設(shè)定室內(nèi)質(zhì)量控制：如果只檢測1個基因突變，定性測定有一份接近倍的弱陽性和一份陰性質(zhì)控樣本即可.質(zhì)控品的設(shè)置數(shù)量隨檢測樣本數(shù)的增加而按50~60,可以根據(jù)實驗室自身的條件，可只設(shè)立能23如果每次質(zhì)控品的檢測結(jié)果均成立，說明結(jié)果可信,報告可以發(fā)出;的基因突變和其相應(yīng)的對照重新檢測。"7。4室間質(zhì)量評價臨床檢測實驗室應(yīng)參加室間質(zhì)評EQA過程，根據(jù)反饋結(jié)果了解本實驗室的能力、自查存在的問題,及時尋求改進(jìn)方法解決問題，完善實驗室質(zhì)量控制體系。7.5PCR污染控制PCRPCRPCRPCR和質(zhì)粒分子很容易造成實驗室的污染,導(dǎo)致假陽性現(xiàn)象發(fā)生.通過規(guī)范實驗室設(shè)計、規(guī)范試劑耗材管理、規(guī)范實驗室操作和技術(shù)處理來控制污染.PCRPCRPCR氣溶膠污染和實驗室中克隆質(zhì)粒的污染.PCR擴(kuò)增實驗中使用dUTPdTTP。AA。1基因突變檢測項目A。1。1EGFR基因突變檢測【基因簡介】EGFR是原癌基因c-erbB1的表達(dá)產(chǎn)物,【基因簡介】EGFR是原癌基因c-erbB1的表達(dá)產(chǎn)物,HEREGFR/HER1/erbB1HER2/neu/erbB2HER3/erbB3HER4/erbB4要的調(diào)節(jié)作用?！境Ｒ娡蛔儭縀GFR的突變主要發(fā)生在胞內(nèi)酪氨酸激酶(TK)區(qū)域的前四個外顯子上(18~21），TK30多種.缺失突變主要發(fā)生在外顯子19delE746-A75021上的L858R2020上的替代突變T790M為耐藥突變,L858Q、D761Y、T854A等耐藥突變.EGFR—KTI的有效性也因突變類型而【EGFREGFR—KTI的有效性也因突變類型而不同,19不同,1981%，L858R71％，G719X的56%.50%患19L858R790位密碼子蘇氨酸向蛋氨酸的突變（T790M)1～3TKIT790MTKI治療難以有效。10%10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋的非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織?？?。【檢測方法】推薦ARMSSangerEGFR一代測序技術(shù)同時進(jìn)行肺癌驅(qū)動基因的檢測。（1)預(yù)測藥物療效:EGFRHER/ErbB家族信號通路的首要分子，吉非替尼、厄洛替尼等小分子TKI進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，直接作用于EGFR胞內(nèi)的激酶區(qū)，干擾吉非替尼、厄洛替尼等小分子TKI進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，直接作用于EGFR胞內(nèi)的激酶區(qū)，干擾ATP合成，抑制酪氨酸激酶的活性，阻斷激酶的自身磷酸化及底物的信號通路的激活，阻滯細(xì)胞在G1期，促進(jìn)凋亡，抑制新生血管形成、侵襲和轉(zhuǎn)TKIEGFRTKI療效預(yù)測因子。(2(2）EGFR-TKI對肺癌切除后患者進(jìn)行預(yù)后分析，EGFRTKIEGFRTKI基因突變與女性、非吸煙者等這些傳統(tǒng)的預(yù)后良好因子有交叉，只分析基因突變進(jìn)行預(yù)后評價幾乎是不可能的.【用藥建議（1EGFR191921外顯子突變18外顯子突變（G719X）TKI可獲益。1~3%TKINSCLC20T790MTKI治療后超過50%TKI治療后超過50%后耐藥的患者出現(xiàn)T790M突變陽性，導(dǎo)致TKI治療失敗.L747SD76IYT854A突變陽性時，患者也會對吉非替尼、厄洛替尼等小分子酪氨酸激酶抑制劑耐藥?！揪窒扌浴颗R床實踐表明，并不是所有攜有EGFRNSCLC患者都對酪氨酸激酶抑制劑有效,EGFR—TKI的有效性因突變類型而不同，如對外顯子19酸激酶抑制劑有效,EGFR—TKI的有效性因突變類型而不同，如對外顯子19缺81%，L858R71％,G719X的有效率為5620TKI10％的EGFRNSCLC患者對酪氨酸激酶抑制劑有效，但其機(jī)制尚不明確。A。1。2KRAS基因突變檢測RASK-RASN-RASRASK-RASN-RAS90%的氨基酸同源序列，分子RASp21G苷（GDP）結(jié)合為非活性狀態(tài)，與三磷酸尿苷(GTP）結(jié)合為活性狀態(tài)，RASp21GTPase活性，位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)參與跨膜信號傳遞作用.KRAS基RAS124個編碼外15’189RAS蛋白.KRAS是表皮生長因子受體功能信號的下游分子，屬膜結(jié)合型GTP／GDP結(jié)合蛋白,通過GTP和GDP的相互轉(zhuǎn)化作用有節(jié)制的調(diào)節(jié)KRAS傳遞細(xì)胞生長分化信號?！綤RAS基因的常見突變】KRAS基因突變發(fā)生在腫瘤惡變的早中期，并且原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的KRAS基因狀態(tài)基本保持一致.目前研究發(fā)現(xiàn)，KRAS基因在膀胱、乳腺、直腸、腎、肝、肺、卵巢、胰腺、胃,還有造血系統(tǒng)等均在一定頻率的突變，其中以結(jié)直腸癌、胰腺癌和肺癌的發(fā)生率比較高,灶和轉(zhuǎn)移灶的KRAS基因狀態(tài)基本保持一致.目前研究發(fā)現(xiàn)，KRAS基因在膀胱、乳腺、直腸、腎、肝、肺、卵巢、胰腺、胃,還有造血系統(tǒng)等均在一定頻率的突變，其中以結(jié)直腸癌、胰腺癌和肺癌的發(fā)生率比較高,在胰腺癌組織高達(dá)90%以上，在肺癌中則以肺腺癌為主，突變率為20～30%,結(jié)直腸癌患者突變率為27~43KRAS基因催化活性區(qū)突變時,RASRASEGFRRAS信號通路的異?；罨?影響細(xì)胞的生長、增殖和分化，促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控而癌變.KRAS基因最常見的突變方式為點突變，90%KRAS2號外12131～4%61146密碼子突變.其中結(jié)直12密碼子(82%)是最常見的突變位點。一般中國人群樣本檢測數(shù)據(jù)G12AG12S/C，西方人群相反.經(jīng)10經(jīng)10％中性福爾馬林固定石蠟包埋的結(jié)腸癌/肺癌腫瘤組織,或者與原發(fā)灶具有同樣病理形態(tài)的轉(zhuǎn)移組織?；蛘吲c原發(fā)灶具有同樣病理形態(tài)的轉(zhuǎn)移組織。【檢測方法】可以采用Sanger測序法，也可采用靈敏度高的ARMS—PCR等。EGFREGFR從而發(fā)揮抗腫瘤的KRAS狀態(tài)的影響,KRAS無需接受上游EGFR信號KRASKRAS狀態(tài)的影響,KRAS無需接受上游EGFR信號KRAS基因野生型的患EGFR的治療中獲益,而突變型的患者則不能?！居盟幗ㄗh】KRAS野生型患者使用西妥昔單克隆抗體和帕尼單克隆抗體治療效果確切，可顯著提高患者的生存率和改善生活狀態(tài),KRAS2號12號密碼子和（或號密碼子或其他密碼子任意突變型患者使用西靶向藥物治療時,應(yīng)詢問所有結(jié)腸癌患者的家族史，如果懷疑患者有遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC）、家族性腺瘤性息肉病（FAP)和輕表型家族性腺瘤性息肉?。ˋFAP），除非是進(jìn)行臨床試驗，否則不應(yīng)使用貝伐珠單克隆抗體、西妥昔單克隆抗體、帕尼單克隆抗體或伊立替康?！揪窒扌浴颗R床實踐表明,只有50％的野生型KRAS患者對抗EGFR治療有效，EGFREGFRKRASEGFR靶向藥物的治療效果.A.1。3BRAF基因突變檢測【基因簡介】BRAF1988Ikawa等首先在人類尤因肉瘤中發(fā)現(xiàn)并克NIH3T3DNA序列。BRAFARAFCRAFRAFB1，位于人7q34,NIH3T3DNA序列。BRAFARAFCRAFRAFB1，位于人7q34,783CR1、CR2CR3.BRAFRas—Raf-MEK-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路重要2510對堿基組成，主要通過有絲蛋白激酶通路中的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶來發(fā)揮作用,該酶將細(xì)胞表面的受體和RAS蛋白通MEKERK與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子相連接，啟動多種因子參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)事件,.,如惡性,BRAF突變。【常見突變】BRAF突變主要有兩種類型:1.11%exon11上的甘氨酸環(huán)，如G463、G465、G468的點突變；2。89exon15,其中921799導(dǎo)致其編碼的谷氨酸由纈氨酸取代(V600EV599E)1％BRAFRAS突變,1突變幾乎均為非V600EBRAFNIH3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力提高，但以后者更為重要。V600ET598S601兩個位點的磷酸化作用,BRAF蛋白激活.BRAF突變與維羅非尼(vemurafeni】2011FDA批準(zhǔn)維羅非尼用于治療晚（轉(zhuǎn)移性（轉(zhuǎn)移性)BRAFV600E該藥的安全性和療效評估基于一項國際單中心研究。該研究納入675例BRAFV600E8個月的患者生存）。該藥最常見副作用為關(guān)節(jié)痛、皮疹、脫發(fā)、疲乏、惡心和皮膚光敏感.中國黑色素瘤患者中BREF關(guān)節(jié)痛、皮疹、脫發(fā)、疲乏、惡心和皮膚光敏感.中國黑色素瘤患者中BREFV600E變異率接近26％，雖然不如白種人（約1/4黑色素瘤患者,因此該藥物對于黑色素瘤患者的治療有著十分重要的意義?！緳z測樣本類型】經(jīng)10％中性福爾馬林固定石蠟包埋的結(jié)腸癌腫瘤組織和黑色素瘤組織。素瘤組織。BRAFSangerARMS-PCRARMS-PCR等方法進(jìn)行檢測。【臨床意義】（1）BRAFKRAS下游級聯(lián)信號通路上的一個重要蛋白，BRAFEGFRBRAFEGFR抑制劑西妥昔單克隆抗體和帕尼單克隆抗體等療效減弱或無效。V600E突變患者呈現(xiàn)預(yù)后更差的趨勢。(3）BREFV600E基因突變的黑色素瘤患者對維羅非尼治療有效。KRASBRAFKRASBRAFV600E突變的患者,EGFR單克隆抗體靶向藥物治療可能無效。(2）回顧性亞組分析顯示，BRAF患者,EGFR單克隆抗體靶向藥物治療可能無效。(2）回顧性亞組分析顯示，BRAFV600E是否存在突變,EGFR單克隆抗體聯(lián)合有,一線治療后病情進(jìn)展的患者,BRAFV600EEGFR（3)50％以上表達(dá)BRAFV600突變的晚期黑色素瘤患者在維羅非尼治療中可獲得臨床應(yīng)答。【局限性】(1）BRAF基因突變的檢測用于預(yù)測結(jié)直腸癌抗EGFR單克隆抗體靶向藥物的治療效果和預(yù)后,NRASKRASPI3KCA等基因的突變的檢測BRAFV600BRAFL597K601BRAF步開展研究來證實這些發(fā)現(xiàn)。A.1。4C-KIT基因突變檢測【基因簡介】C—KIT基因位于人染色體4q11-21,屬于原癌基因，其cDNA全長5230bp,21145KD的跨膜酪氨酸激酶受體(tyrosinekinasereceptor，RTK)CD1171號外顯子編碼起始密碼子和信號2—910號外顯子編碼疏水跨膜結(jié)構(gòu)域,11-2011號外顯子編碼近膜區(qū)段。5230bp,21145KD的跨膜酪氨酸激酶受體(tyrosinekinasereceptor，RTK)CD1171號外顯子編碼起始密碼子和信號2—910號外顯子編碼疏水跨膜結(jié)構(gòu)域,11-2011號外顯子編碼近膜區(qū)段。C-KIT受IIIRTK家族，分布于細(xì)胞表面，可以用CD117單克隆抗體檢測,與血小板衍生生長因子受體(platelet-derivedgrowthfactor有很強(qiáng)的同源性?！境Ｒ娡蛔儭慷鄶?shù)胃腸道間質(zhì)瘤(GIST）發(fā)生源于C—KIT基因突變,C-KIT突變131417也可以發(fā)生突變.8～50GIST中可觀察到典型的突變,35%GIST中，C—KIT基因突變型式并不完11號外顯子突變，導(dǎo)致其編碼的近膜結(jié)構(gòu)域的空間結(jié)構(gòu)改變，消弱或喪失對激酶結(jié)構(gòu)域的抑制功能.【C-KIT基因突變與伊馬替尼療效】甲磺酸伊馬替尼商品ablv—abl、PDGFRC-KIT蛋白等。伊馬替2001511月在歐洲上市,20024月在中國上市.最初被應(yīng)用于費(fèi)城染色體陽性的（Ph+）慢性粒細(xì)胞白血病(CML）的治療，GIST治療進(jìn)入了分子靶向時代.一般認(rèn)為C—KIT/PDGFRA突變類型可以預(yù)測伊馬替尼的療效，其中C-KIT11PDGFRAD842V突變可能對伊馬替尼與舒尼替尼GISTC-KIT9C—KIT野生型者C-KIT11C-KIT1314突變患者療效C-KIT17、18突變者.CSCO胃腸間質(zhì)瘤專家委員會推薦存在以下情況時,應(yīng)該進(jìn)行基因?qū)W分析：GIST-C-KITPDGFRA突變分析，以明確GIST的診斷；④鑒別NF1GIST、完全性或不CarnesCarnesGISTGIS；⑤鑒別同時性和異時性多GIST。C—KIT91317號外顯PDGFRA1218號外顯子。由于大多數(shù)C-KIT119號外顯子，對于經(jīng)濟(jì)承受能力有限的,C—KIT13、14、1718外顯子.【檢測樣本類型】經(jīng)10%中性福爾馬林固定石蠟包埋的GIST腫瘤組織。推薦檢測的樣本類型為治療前的原發(fā)癌腫瘤組織或轉(zhuǎn)移的腫瘤組織.【檢測方法】C-KITSanger測序法、ARMS-PCR等方法檢測特定的突變位點.(1）KIT受體功能，從而抑制腫瘤的形成。已有研究證實，C-KITC—KITGIST診斷，也可以進(jìn)一步CD117GISTGIST，指導(dǎo)化療,預(yù)測化療的效果.（2)C-KIT11外顯子發(fā)生突變后，患者預(yù)C—KITPDGFRA基因突變的患者或者未檢測到C—KITPDGFRA基因突變的患者預(yù)后更差.來源于小腸或結(jié)腸的CIST如C—KIT9C-KIT11外顯子突變者更具有侵襲性.C—KIT9、、1217C-TKI靶向藥物治療中獲益。當(dāng)13、14、17、18外顯子的繼發(fā)性突變時，則使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑出現(xiàn)耐藥?！揪窒扌浴坑捎诖嬖谀[瘤異質(zhì)性,或腫瘤組織中混有大量正常組織,或壞死組織過多等，均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果的產(chǎn)生.同時還有部分患者無法提供檢測所需的C-KIT基因狀態(tài)的變化，均可導(dǎo)致治療的失敗.此外，C-KIT基因的突變CYP4503A4C-KITA。1。5PDGFRA基因【基因簡介】PDGFR是分子量為180kD的單鏈膜糖蛋白，細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)含5,激酶區(qū)斷裂處，為親水氨基酸插入序列。受體分子由α,β兩種亞基組成5,激酶區(qū)斷裂處，為親水氨基酸插入序列。受體分子由α,β兩種亞基組成,成熟后PDGFR以二聚體穩(wěn)態(tài)形式PDGF(platelet-derivedgrowthfactor，PDGF)相應(yīng)異構(gòu)體(PDGF—AA，AB,BB)結(jié)合。結(jié)直腸癌組織中PDGFRαPDGFRβ均有表達(dá)分布，PDGFRα分布于結(jié)直腸正常組織、息肉組織及腫瘤組織上;PDGFRβ表達(dá)于腫瘤細(xì)胞、腫瘤間質(zhì)細(xì)胞和微血管細(xì)胞（包括微血管周細(xì)胞）上?！綪DGFRAPDGFRAGIST、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、惡性GISTPDGFRA5~10％左右，突變主PDGFRA（12)和激酶區(qū)(14和外顯子0.8%39％,18突變?yōu)橹?PDGFRA常見突變類型見。PDGFRA基因突變后則通過活化AKTMAPK及STAT蛋白中STAT3A—RafPLCG1PDCFR依賴途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),PI3KPDCFR非依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)?！緳z測樣本類型】經(jīng)10％中性福爾馬林固定石蠟包埋的腫瘤組織。推薦檢測的樣本類型治療前的原發(fā)癌腫瘤組織或轉(zhuǎn)移的腫瘤組織.【檢測方法】PDGFRA基因突變的檢測方法可以采用Sanger測序法、ARMS—PCR等方法檢測特定的突變位點?！九R床意義】(1）輔助診斷和預(yù)測療效:伊馬替尼是一種酪氨酸蛋白酶抑制劑,能阻斷酪氨酸蛋白激酶KIT受體功能,從而抑制腫瘤的形成。已有研究證實，PDGFRA基因突變的位置能影響腫瘤患者對伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑的反應(yīng)。研究表明，PDGFRA1218大部分基因位點突變后使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑治療時GIST18D842V、RD841—842KID1842—843IM突變使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑治療時GIST（2）PDGFRAKIT因突變的患者侵襲性低。PDGFRA12Tyr555CysAsp56lVal18Asp846Tyr18外顯子中的D842VRD841—842KI和DI842—843IM突變時，使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑則出現(xiàn)耐藥。,或壞死組織過多等,無法避免假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。同時還有部分患者無法提供檢測所需的組PDGFRA基因狀態(tài)的變化，均可導(dǎo)致治療的失敗。此外，PDGFRA基CYP4503A4狀態(tài)PDGFRA基因的突變，使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑不一定能達(dá)到預(yù)期臨床療效，需要考慮其他因素的干擾.基因表達(dá)檢測項目HER2基因表達(dá)HER2HER2HER2HER2neu基因或基因。編碼分子量185kD的跨膜蛋白,p185HER2，是具HER2受體介導(dǎo)的信號通路是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),包括輸入細(xì)胞層(配體或生長因子）、信息加工層(受體,SH2蛋白,轉(zhuǎn)錄因子)和輸出層(細(xì)胞生長，分化和轉(zhuǎn)移）。配體介導(dǎo)受體的二聚體是關(guān)鍵，使HER2在整個信號網(wǎng)絡(luò):RasRaf-Mek-MAPKPBKAkt激酶、激酶、cAMP（蛋白激酶A）、磷脂酶C-r和src等。HER2通過這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路使細(xì)胞增殖周期變短，惡性表現(xiàn)增強(qiáng)和抗凋亡路使細(xì)胞增殖周期變短，惡性表現(xiàn)增強(qiáng)和抗凋亡.【HER2基因過表達(dá)與乳腺癌等】HER2基因在乳腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、胃癌和非小細(xì)胞肺癌等中均存在表達(dá)上調(diào)。許多研究資料表明，在20～30％的乳HER2基因明顯擴(kuò)增或過表達(dá),HER2基因過表達(dá)的乳腺癌患HER2基因位于細(xì)胞表面，易被抗體接HER2基因可作為抗腫瘤治療的一個靶點?！緳z測樣本類型】經(jīng)10％中性福爾馬林固定石蠟包埋的乳腺癌腫瘤組織。治療前的原發(fā)腫瘤組織或轉(zhuǎn)移的腫瘤組織。HER2FISHIHCPCR法用于檢測HER2基因的表達(dá)尚未得到認(rèn)可。一般來說，實驗室首先采用HER22+，則進(jìn)行原位雜交方法進(jìn)HER2基因檢測確認(rèn).【結(jié)果判讀】【結(jié)果判讀】免疫組織化學(xué)（IHC）檢測：1）免疫組織化學(xué)（IHC）檢測：1）3+，HER2表達(dá)陽性；2）1+或陰性，表達(dá)陰性；3）2+FISH檢測。FISH檢測：HER2CEP17信號數(shù)比值：≥2。0為陽性,HER-2/neu基因擴(kuò)增；HER2CEP17信號數(shù)比值:＜2.0時，HER2拷貝數(shù)≥6。0HER2拷貝數(shù)＜4.0基因擴(kuò)增；若HER2拷貝數(shù)≥4.0，但＜6.0時為不確定，不能確定HER-2/neu基因狀態(tài).3)若眾多信號HER2信號連接成簇時可不計算，即視為基因擴(kuò)增。HER2療方案的先決條件，對乳腺癌的診療具有重要的指導(dǎo)作用。（1)預(yù)后評價:研究顯示,HER2還是一個重要的臨床預(yù)后指標(biāo),HER2基因擴(kuò)增的乳腺癌浸潤性強(qiáng)、無進(jìn)展生存期(progressfreesurvivalPFS）短、預(yù)后差。而且這部分患者就診時HER2基因擴(kuò)增與導(dǎo)管原位癌（ductalcarcinomainsitu，DCIS)的預(yù)后相關(guān)。（2),HER2而言,HER2HER2CMF化療方案的反應(yīng)性降低，宜采用高劑量的蒽環(huán)類藥物方案.（3）靶向藥物療效預(yù)測：大量臨床研究數(shù)據(jù)提示，使用曲妥珠單克隆抗體HER2基因擴(kuò)增或蛋白過表達(dá)患者的生存，使乳腺癌患者獲益。即使在使用曲妥珠單抗治療過程中出現(xiàn)疾病進(jìn)展而需要進(jìn)一步治療的乳腺HER2增的乳腺癌患者，使用曲妥珠單抗療效不佳.HER2HER2HER2PI3KCA基因突變、PTENHER2生突變時，則會對曲妥珠單抗和拉帕替尼等酪氨酸激酶抑制劑耐藥?！揪窒扌浴坑捎诜椒▽W(xué)本身的局限性，IHCFISHHER2基因狀態(tài)做出明確判斷.即使經(jīng)IHC或FISHHER2身所造成的假陽性，也可能是HER2基因的信號通路中還存在其他異常的位點IHCFISH分患者無法提供檢測所需的組織樣本，或組織樣本無法滿足進(jìn)行檢測的基本要HER2IHCHER2基因狀態(tài)進(jìn)行動態(tài)、實時的監(jiān)測.融合基因檢測項目A。3。1EML4-ALK融合基因檢測項目（anaplasticlymphoma1994AMS31620個氨基酸組成的跨膜蛋白,屬于胰島素受體家族。EML4是人類棘皮動物微管相關(guān)蛋白4（echinodermmicrotubule—associatedprotein-like（anaplasticlymphoma1994AMS31620個氨基酸組成的跨膜蛋白,屬于胰島素受體家族。EML4是人類棘皮動物微管相關(guān)蛋白4（echinodermmicrotubule—associatedprotein-like4，EML4)，屬于棘皮動物N末端堿基區(qū)、疏水的棘皮動物微管相關(guān)蛋白區(qū)（hydrophobicechinodermmicrotubule-associatedprotein—likeprotein，HELP)及WD2（2p215EML4的片段,3ALK的片段,EML4基因片段與殘ALKEML4BASIC區(qū)域，疏水的棘WD（后兩部分在部分亞型中缺失ALKKinase功能區(qū).EML4-ALKPI3—K/Akt、STAT3/5Ras-MEKPLC-γ/PIP2等，這些通路與細(xì)胞存活、增殖和遷移密切相關(guān)?！綞ML4—ALK融合與克唑替尼】克唑替尼是一種酪氨酸激酶受體抑制劑，靶向ALK、肝細(xì)胞生長因子受體（HGFR，c