微生物降解石油烴

微生物降解石油烴微生物降解石油烴微生物降解石油烴V:1.0精細整理，僅供參考微生物降解石油烴日期：20xx年X月唐山學院畢業(yè)設計設計題目：微生物降解石油烴最適條件研究系別：環(huán)境與化學工程系班級：09石油化工生產(chǎn)技術2班姓名：張賀松指導教師：程磊2012年6月11微生物降解石油烴最適條件研究摘要從學校腐蝕質土囊中篩選到2株對機油等相關石油制品具有高效降解能力的菌種ZL1ZL2。通過生長條件正交實驗測定了溫度、油量和pH值對其降解能力的影響。實驗表明：4天對于含油300mg/L的去除率分別達到67.9%和76.2%，其中ZL2菌對底物濃度和PH值有較廣的適應范圍。關鍵詞：正交實驗高效降解菌菌種篩選MicrobialdegradationofpetroleumhydrocarbonsintheoptimumconditionsAbstractCorrosionfromtheschoolthequalityofsoilinthebagfiltertothe2strainsofbacteriadegradingabilityofoilandotherpetroleumproductsZL1ZL2.Orthogonalexperimentaldeterminationofthegrowthconditionsoftemperature,substrateconcentrationandPHvalueoftheirdegradationability.Theexperimentalresultsshowthat:fourdaysforoily300mg/L,theremovalrateof67.9%and76.2%,whichZL2bacteriahaveawiderrangeofsubstrateconcentrationandpHvalue.Keywords：OrthogonalexperimentEfficientdegradationbacteriaStrainscreening目錄1引言 11.1石油污染的危害 11.2微生物法治理石油污染 21.3微生物降解石油途徑 41.4微生物降解石油影響因素 51.5各國對微生物降解石油烴的研究 61.6微生物降解石油烴類污染物的代謝機制 61.7微生物降解菌的種類 62試驗 82.1材料 82.1.1菌種 82.1.2培養(yǎng)基 82.1.3試驗藥品 82.1.4試驗儀器 92.2優(yōu)勢菌篩分試驗 92.2.1取樣 92.2.2準備實驗用品 92.2.3制作培養(yǎng)基 92.2.3高溫滅菌 92.2.4初次富集分離 102.2.5連續(xù)富集分離 102.2.6平板分離 102.2.7劃線分離 102.3生長條件正交實驗 102.4混合菌機油降解效率 112.5分析方法 113結果分析 123.1優(yōu)勢菌篩分實驗 123.2生長條件正交試驗 123.3混合菌種實驗 134結論 15謝辭 16參考文獻 17外文資料 18 1引言上世紀初以來,石油的重要性日益突顯。如今,被稱為“工業(yè)血液”的石油,更是一個國家的經(jīng)濟命脈。但石油及其產(chǎn)品在生產(chǎn)、運輸和使用的各個環(huán)節(jié)中,都容易產(chǎn)生泄露,對環(huán)境造成污染。目前由于油田附近土壤污染及油輪事故造成的海域大面積石油污染已引起人們高度關注,對原油的生物降解研究的文獻也比較多,已有一些成果得到了應用,如BalticGeneralInvestment公司的一項專利就是利用混合菌群來促進石油烴類的生物降解[1]。但石油及其制品在自然界很難被有效降解。研究表明,對碳氫化合物有降解作用的微生物只占微生物總量的不到1%,即使在受到石油制品污染的場所,此類微生物的百分含量也不超過10%[2]。機油是重要的石油制品。隨著經(jīng)濟的持續(xù)高速發(fā)展,越來越多的企業(yè)在進行機器自動化生產(chǎn),機油的使用也早已司空見慣。作為潤滑油的機油,在使用過程中會不可避免地產(chǎn)生泄露和廢棄,這不僅有損市容,還會對環(huán)境造成嚴重的污染。機油的主要成分是一系列長鏈烷烴,屬于難降解的有機物,目前對于機油這一重要石油制品的生物降解的研究鮮見報道。MorganP等人曾利用微生物菌群處理受機油污染的土壤,但卻沒有分離到單菌[3]。為此,我們從活性污泥和腐蝕質土壤中分離了微生物菌種,從中篩選到2株對機油具較高降解能力的菌種,并對其除油效果與條件進行了初步研究以期進一步應用于含油污水的治理。1.1石油污染的危害油作為重要能源之一已被世界各國廣泛使用。由于在石油的開采、儲存、運輸、加工和石化產(chǎn)品生產(chǎn)等過程中的漏油以及突發(fā)性泄油事故,致使大量的石油進入環(huán)境,造成污染。石油是由各種碳氫化合物組成的復雜混合物,主要含有3類烴化合物:鏈烷烴、環(huán)烷烴和芳香烴。石油產(chǎn)品包括汽油、煤油、柴油、潤滑油及各類油的分解產(chǎn)物等。石油烴中的芳香烴對人及動物的毒性較大,多環(huán)芳烴可通過呼吸、皮膚接觸、飲食攝入方式進入人或動物體內(nèi),影響肝、腎等器官的正常功能,甚至引起癌變。人如果較長時間接觸較大濃度的石油中的苯、甲苯、酚類等物質,會引起惡心、頭疼、眩暈等癥狀。石油烴對植物也具有較強的危害性,其中低分子烴的危害性比高分子烴強,主要是因為低分子烴能穿透到植物組織內(nèi)部,破壞正常的生理機能;高分子烴可能因分子較大而穿透能力差,但高分子烴易在植物表面形成一層薄膜,阻塞植物氣孔,影響植物的蒸騰和呼吸作用。同樣石油污染對海洋的危害更大。海洋石油污染不僅影響海洋生物的生長、降低海濱環(huán)境的使用價值、破壞海岸設施，還可能影響局部地區(qū)的水文氣象條件和降低海洋的自凈能力。據(jù)實測，每滴石油在水面上能夠形成0.25平方米的油膜，每噸石油可能覆蓋5×106平方米的水面。油膜使大氣與水面隔絕，減少進入海水的氧的數(shù)量，從而降低海洋的自凈能力。油膜覆蓋海面還會阻礙海水的蒸發(fā)，影響大氣和海洋的熱交換，改變海面的反射率，減少進入海洋表層的日光輻射，對局部地區(qū)的水文氣象條件可能產(chǎn)生一定的影響。海洋石油污染的最大危害是對海洋生物的影響，油膜和油塊能粘住大量魚卵和幼魚，使魚卵死亡、幼魚畸形，還會使魚蝦類產(chǎn)生石油臭味。據(jù)統(tǒng)計，每年通過各種渠道泄入海洋的石油和石油產(chǎn)品，約占全世界石油總產(chǎn)量的0.5％，傾注到海洋的石油量達200萬噸~1000萬噸，由于航運而排入海洋的石油污染物達160萬噸~200萬噸，其中1/3左右是油輪在海上發(fā)生事故導致石油泄漏造成的。海洋石油污染危害是多方面的，如在水面形成油膜，阻礙了水體與大氣之間的氣體交換；油類粘附在魚類、藻類和浮游生物上，致使海洋生物死亡，并破壞海鳥生活環(huán)境，導致海鳥死亡和種群數(shù)量下降。石油污染還會使水產(chǎn)品品質下降，造成經(jīng)濟損失。1.2微生物法治理石油污染石油烴類化合物被微生物氧化成為低分子化合物或完全分解為二氧化碳和水的作用。

石油入海后發(fā)生一系列物理、化學和生物的變化，其中微生物對石油烴的降解起重要作用。微生物降解烴類是19世紀末發(fā)現(xiàn)的。20世紀50年代前，以美國C.E.佐貝爾為代表，對海洋微生物降解石油烴進行了廣泛的研究。50年代初氣相色譜問世，放射性同位素示蹤法的普遍應用[13]，對研究石油烴的微生物降解機制起了積極的作用。60年代以來，由于海上石油污染日趨嚴重，促使不少沿海國家，如美國、加拿大、日本、英國和蘇聯(lián)等國，積極開展了有關海洋微生物降解石油烴的研究工作。70年代中期，美國學者還用基因工程的技術培育了“超級微生物”，以期能有效地降解石油烴。

中國自1975年起，先后對青島膠州灣、渤海、廈門港、黃海和東海石油降解微生物的數(shù)量、分布、種類組成和影響降解因素等進行了調(diào)查研究。

烴類微生物廣泛分布于海洋的各個角落，但其種類和數(shù)量，則因時間、地點和環(huán)境條件的不同有較大的差異。一般來說，細菌的數(shù)量大于真菌和酵母，近海烴類微生物的數(shù)量高于大洋，表層水膜和海底沉積物的菌量高于水體，油污水域的菌量大于非油污水域。在油污水樣中，每毫升海水的菌量可高達103～106，每毫克沉積物菌量可達106～109。因此，烴類微生物的菌量往往可以反映環(huán)境受油污的情況[13]。20世紀80年代以前．治理石油烴污染土壤還僅限于物理和化學方法，即熱處理和化學浸出法。熱處理法是通過焚燒或煅燒，可凈化土壤中大部分有機污染物。但同時亦破壞土壤結構和組分，且價格昂貴而很難實施?；瘜W浸出和水洗也可以獲得較好的除油效果。但所用的化學試劑的二次污染問題限制了其應用[7]。早在20世紀70年代。為了解決輸油管線和儲油罐發(fā)生故障漏油和溢油時土壤被石油污染的問題，美國埃索研究和工程公司就已經(jīng)開始尋找清潔的生物解決方法，并且其實驗室研究找到一種有效的“細菌播種法[14]，開了生物修復石油污染土壤先河。上世紀80年代以來，污染土壤的生物修復技術越來越引起人們的關注．生物修復技術也取得了很大進步，正在逐漸成熟。生物修復是利用生物的生命代謝活動減少土壤環(huán)境中有毒有害物的濃度，使污染土壤恢復到健康狀態(tài)的過程。目前，治理石油烴類污染土壤的生物修復技術主要有兩類：一類是微生物修復技術，按修復的地點又可分為原位生物修復和異位生物修復；另一類是植物修復法。原位生物修復技術原位處理方法是將受污染土壤在原地處理。處理期間[8]．土壤基本不被攪動，最常見的就地處理方式是土壤的水飽和區(qū)進行生物降解。除了要加人營養(yǎng)鹽，氧源外還需引入微生物以提高生物降解的能力。有時，在污染區(qū)挖一組井．并直接注入適當?shù)娜芤?，這樣就可以把水中的微生物引入到土壤中。地下水經(jīng)過一些處理后，可以恢復和再循環(huán)使用，在地下水循環(huán)使用前，還可以/JnA+壤改良劑。污染土壤經(jīng)過處理，所有多環(huán)芳烴的降解都很明顯，但是．三環(huán)和多環(huán)芳烴的降解率一般明顯低于60%。因為就地處理對溫度較敏感。所以只能在氣溫大于8℃的月份進行。在一定的時間內(nèi)。原位處理不可能有效地去除大多數(shù)多環(huán)芳烴，而且這種方法因受溫度和土壤類型的影響而具有一定的局限性。異位生物修復主要包括現(xiàn)場處理法、預制床法、堆制處理法、生物反應器和厭氧生物處理法?，F(xiàn)場處理法近年來國外石油烴污染生物處理的研究很多，其中土壤耕作處理是現(xiàn)場處理土壤污染常用的方法。被污染的廢物施在土壤上。通過施肥、灌溉和加石灰等管理措施，保持氧氣、水分和pH的最合適值，并進行耕作以改善土壤的通氣狀況，確保在污染廢物和下面土層中污染物的降解。降解過程所用的微生物多為土著微生物。但是要提高效果還需要引入馴化的微生物。預制床法現(xiàn)場處理中土壤耕作處理最大的缺陷是污染物可能從處理區(qū)遷移。預制床的設計可以使污染物的遷移量減至最小，因為它具有濾液收集和控制排放系統(tǒng)。預制床的底面為滲透性低的物質，如高密度的聚乙烯或粘土。將污染土壤轉移到預制床上，通過施肥、灌溉，調(diào)節(jié)pH，有時還加入微生物和表面活性劑，使其最適合污染物的降解。與同一區(qū)域的原位處理技術相比，預制床處理對三環(huán)和三環(huán)以上的多環(huán)芳烴的降解率明顯提高。堆制處理法土壤的堆制處理就是將受污染的土壤從污染地區(qū)挖掘起來，防止污染物向地下水或更大的地域擴散．運輸?shù)揭粋€經(jīng)過處理的地點(布置防止?jié)B漏底，通風管道等)堆放，形成上升的斜坡，并進行生物處理。堆制法是生物修復技術中的一種新型替代技術。堆制處理過程對污染土壤中的多環(huán)芳烴降解，多環(huán)芳烴的降解隨著苯環(huán)數(shù)的增加而降低。當多環(huán)芳烴的初始濃度提高約50倍時，除熒、蒽外，其他多環(huán)芳烴的降解隨著污染濃度的提高而降低。生物反應器法生物反應器法是將污染土壤置于一專門的反應器中處理。生物反應器一般建在現(xiàn)場或特定的處理區(qū)。通常為臥鼓形和升降機形，有間隙式和連續(xù)式兩種。因為反應器可使土壤與微生物及其他添加物如營養(yǎng)鹽，表面活性劑等徹底混合，能很好的控制降解條件，因而處理速度快，效果好。生物反應器處理的過程為：先挖出土壤與水混合為泥漿，然后轉入反應器。為了提高降解速率，常在反應器先前處理的土壤中分離出已被馴化的微生物，并將其加入到準備處理的土壤中．厭氧生物修復法修復受石油烴污染土壤的研究已開發(fā)了生物堆層、堆肥及土壤泥漿反應器等好氧修復工藝，但分離獲得某些降解菌時。一些降解菌伴有產(chǎn)生高生態(tài)風險的產(chǎn)物。最近的研究表明以厭氧還原脫氯為特征的厭氧微生物修復技術有很大的潛力。植物修復技術目前，對土壤有機污染的生物修復研究較多，但是，多集中在微生物作用上[9]。事實上，植物對污染物的去除起著直接和間接的重要作用。植物生物修復是利用植物體內(nèi)對某些污染物的積累、植物代謝過程對某些污染物的轉化和礦化，植物根圈與根莖的共生關系增加微生物的活性的特點。加速土壤污染物降解速度的過程。植物修復的方式包括植物提取、植物降解和植物穩(wěn)定化三種。植物提取是指利用植物吸收積累污染物，待收獲后才進行處理。收獲可以進行熱處理，微生物處理和化學處理。植物降解是利用植物及相關微生物區(qū)系將污染物轉化為無毒物質。植物穩(wěn)定化是指植物在同土壤的共同作用下．將污染物固定，以減少其對生物與環(huán)境的危害。植物根際使土壤環(huán)境發(fā)生變化，起到了改善和調(diào)節(jié)作用，從而有利于污染物的降解。因此通過選擇適當植物和調(diào)控土壤條件等手段．可以實現(xiàn)污染土壤的快速修復。植物生物修復是一項利用太陽能動力的處理系統(tǒng)．具有處理費用低，減少場地破壞等優(yōu)點而受到普遍重視。據(jù)美國實踐，種植管理的費用在每公頃200～1000美元之間．即每年每立方米的處理費為0．02～1．00美元．比物理化學處理的費用低幾個數(shù)量級。1.3微生物降解石油途徑

石油是多種烴類組成的混合物，包括烷烴、環(huán)烷烴和芳烴等。在石油烴類中，以直鏈的烴類最易被氧化，芳烴和環(huán)烷烴的氧化較難。微生物對直鏈烴的氧化有多種方式：單末端氧化、雙末端氧化和次末端氧化等。其中單末端氧化是最主要的方式。如微生物對正鏈烷的氧化，首先是在單氧化酶系的酶促下[10]，將氧分子的一個氧原子加入到烴中去，使其形成相應的醇，另一個氧原子與烴類脫下的氫結合形成水。已知在細菌中有兩種類型的氧化酶系，其氧化作用如反應圖式。正鏈烷被氧化成相應的醇后,在脫氫酶的作用下,接著被氧化成相應的醛和酸。脂肪酸再通過β氧化和三羧酸循環(huán)進一步氧化成二氧化碳和水。

苯是芳烴的代表，微生物對苯的氧化，首先是在氧化酶系的作用下，將氧的分子加到苯環(huán)上形成鄰苯二酚，然后經(jīng)一系列酶促反應，相繼生成順-順粘糠酸、β-酮基巳二酸、琥珀酸等。烴類被微生物氧化后，約有20～70％的組分轉化為微生物細胞的組分。1.4微生物降解石油影響因素微生物對石油烴的降解取決于：①原油的組分、數(shù)量、物理特性和油污方式；②微生物的種類、數(shù)量及生理特性；③海域的溫度、氧含量、營養(yǎng)鹽、鹽度、海流和pH等[15]。環(huán)境因素，既影響微生物的生長和代謝活動，也影響石油入海后的理化特性。

烴類氧化菌分解輕質原油的能力要高于重質原油。而原油的化學成分又能影響細菌的種類組成。曾在4種不同的原油中接種含有烴類氧化菌的相同水樣，經(jīng)培育，微生物的種類組成出現(xiàn)了差異。又據(jù)試驗，中溫菌對柴油在20°C時的氧化速度比10°C時快3倍，而在5°C時幾乎不發(fā)生降解作用。在海水中加入氮和磷，有利于烴類微生物的繁殖，促進對烴類的降解作用。大多數(shù)烴類微生物降解石油需要氧，理論上推算，氧化1升原油大約要消耗3.2×105升海水中的溶解氧。據(jù)佐貝爾計算，在適宜條件下，細菌氧化海水中油的速率可達到100～960毫克/（米3·天），入海石油的30％可被微生物降解。

①用混合培養(yǎng)微生物消除油污。由于石油含有成千上百種烴，一種細菌又只能降解一種或幾種烴，因此要消除海上油污必須添加微生物的混合培養(yǎng)物。據(jù)試驗，若在添加烴類微生物混合培養(yǎng)物的同時，又加入含氮和磷的營養(yǎng)劑可在幾天內(nèi)降解原油中60～80％的烴類。

②用“超級微生物”消除油污。已知對烴類的降解受菌體質粒的控制。70年代中期，人們采用生物工程培育出了“超級石油菌”。這種細菌能夠降解原油中的大部分烴類，給應用烴類微生物消除海洋油污染帶來了希望。但這種細菌尚不穩(wěn)定，其質粒易丟失，要在現(xiàn)場中實際應用尚需進行深入研究。1.5各國對微生物降解石油烴的研究石油作為現(xiàn)代工業(yè)的“血液”,已被世界各國廣泛使用。目前全球每年石油產(chǎn)量達30億t,而在其開采、儲運、加工和使用過程中不可避免地會有泄漏油事故發(fā)生[11],造成土壤及水體的嚴重污染。據(jù)統(tǒng)計,全球每年傾注到海洋的石油總量在200—1000萬t。世界各國都非常重視石油污染的修復技術研究,如美國、日本等發(fā)達國家都制定了相應的修復計劃。石油污染的修復技術主要有物理修復、化學修復和生物修復。物理修復法和化學修復法研究較成熟,處理石油污染物的效果好,但由于費用高、易產(chǎn)生二次污染等問題使其應用受到限制。生物修復法具有處理效果好、成本低、應用簡單、無二次污染、應用范圍廣、不需大型設備等優(yōu)點,是目前處理石油烴類污染的較好方法。所謂生物修復是利用微生物、植物或動物將土壤、水體中的污染物降解、吸附或富集的生物工程技術,其中微生物修復技術是生物修復中最重要的組成部分。1.6微生物降解石油烴類污染物的代謝機制微生物降解石油烴類的規(guī)律為：直鏈烷烴>支鏈烷烴>單環(huán)芳烴>環(huán)烷烴>多環(huán)芳烴。微生物降解直鏈烷烴時，可對單末端、雙末端和次末端進行氧化。降解過程為石油降解菌先將直鏈烷烴氧化為醇，醇經(jīng)過脫氫酶氧化變?yōu)槿?，醛氧化變?yōu)橹舅幔舅嵬ㄟ^B一氧化降解為乙酰輔酶A，后者或進入三羧酸循環(huán)，分解成CO2和H20，并釋放出能量，或進入其他生化過程[12]。支鏈烷烴不易被微生物降解，且支鏈越多，越不易被降解烯烴再進一步氧化成醇、醛，最后形成脂肪酸或氧化成為一種烷基過氧化氫，鏈烷烴也可直接脫氫形成烯烴直接轉化成脂肪酸。環(huán)烷烴是石油烴中較難被微生物降解的烴類[16]，但經(jīng)混合功能氧化酶氧化后產(chǎn)生環(huán)烷醇，然后脫氫形成酮，再進一步氧化為內(nèi)酯，或直接開環(huán)生成脂肪酸。芳香烴包括單環(huán)芳烴和多環(huán)芳烴：單環(huán)芳烴結構簡單，易降解；多環(huán)芳烴結構復雜，難于降解，首先應通過微生物產(chǎn)生的加氧酶進行定位氧化反應。1.7微生物降解菌的種類在土壤和水體環(huán)境中，微生物種類極其豐富，但在未遭受石油烴類污染的生態(tài)環(huán)境中，石油降解菌僅占微生物總數(shù)的0．1％以下，而在石油污染的生態(tài)環(huán)境中幾乎可達10％，..泄油后短時間內(nèi)降解菌數(shù)量可升高幾個數(shù)量級。據(jù)統(tǒng)計，長期受石油污染的地區(qū)不但降解菌的數(shù)量高，而且降解能力明顯高于無污染區(qū)。到目前為止，發(fā)現(xiàn)能降解石油的微生物有20多種以上。主要有：假單胞菌屬節(jié)桿菌屬不動桿菌屬產(chǎn)堿桿菌屬微球菌屬黃桿菌屬、棒狀桿菌屬紅球菌屬無色桿菌屬、芽孢桿菌屬、黃單胞桿菌屬諾卡氏菌屬鏈霉菌屬、分支桿菌屬；真菌主要有木霉屬、青霉屬、曲霉屬毛霉屬鐮刀菌屬地霉屬輪枝菌屬叢梗孢屬、紅酵母、假絲酵母、擲孢酵母藻類主要有：小魚腥藻屬球藻屬鞘藻屬念珠藻屬顫藻屬等。目前在降解石油污染方面研究較多的是細菌。由于石油成分非常復雜，沒有任何一種微生物能降解石油中的所有組分，因此在石油污染的修復上通常利用具有降解不同組分的多種微生物組合制成修復劑，或者采用微生物—植物聯(lián)合修復[18]，或構建高效降解石油烴的工程菌進行降解修復。石油烴類污染的微生物修復技術近幾年在國內(nèi)外得到了較快的發(fā)展，但由于石油烴類降解速度慢，治理過程需要較長時間，因此尋找高效降解菌是目前微生物修復技術的熱點。目前，用于修復的微生物有土著微生物、外來微生物和基因工程菌3類。但在天然受污染區(qū)域，土著微生物生長緩慢、代謝活性低，或由于污染物毒性過高造成微生物數(shù)量下降，因此修復時可人為投加與土著微生物具有很好相容性的高效菌，形成復合菌群，從而提高降解率，縮短降解時間。2試驗2.1材料2.1.1菌種菌種來源：唐山學院圖書館附近土壤，唐山學院生化實驗室前的土壤2.1.2培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基：K2HPO4:1．0g，KH2PO4:1．0g，MgSO4:0.5g，NH4NO3:1．0g，CaC12:0．02g，F(xiàn)eCl2痕量，蒸餾水1000ml，自然pH，121℃滅菌20m菌種保存和種子液培養(yǎng)基：采用加入瓊脂的富集培養(yǎng)基。篩選培養(yǎng)基：NaNO:1．5g，(NH)2SO4:1．5g，K2HPO4:1g，MgSO4:0．5，KC1:0．5g，F(xiàn)eSO4:0．01g，CaC120．002g，蒸餾水1000ml，自然pH，121℃滅菌20min，冷卻后加入2．5g機油。培養(yǎng)基中加入1．22.1.3試驗藥品試驗所用藥品見表2-1表2-1試驗所用藥品實驗藥品類別生產(chǎn)廠家K2HPO4分析純天津市永大化學試劑有限公司KH2PO4分析純天津市永大化學試劑有限公司MgSO4分析純上海試劑四廠NH4NO3分析純天津市鐘表二廠CaCl2分析純天津市北方化玻購銷中心FeSO4分析純天津市北方化玻購銷中心KCl分析純天津市北方化玻購銷中心Na2SO4分析純天津市永大化學試劑開發(fā)中心瓊脂生化試劑天津市光復精細化工研究所營養(yǎng)瓊脂生化試劑北京陸橋技術有限公司2.1.4試驗儀器試驗所用儀器見表2-2表2-2試驗所用主要器材儀器名稱規(guī)格型號生產(chǎn)廠家立式壓力蒸汽滅菌器YXQ-LS-50SⅡ上海博迅實業(yè)有限公司振蕩培養(yǎng)箱ZDP-250上海精宏實驗設備有限公司生化培養(yǎng)箱SHP-250上海精宏實驗設備有限公司雙人單面潔凈工作臺SW-CJ-2FD蘇州凈化設備有限公司離心沉淀器800型上海手術器械廠可見分光光度計VIS-7220北京第二光學儀器廠調(diào)速多用振蕩器JPT-2型天津市天平儀器廠托盤天平JPT-2天津市天馬儀器廠2.2優(yōu)勢菌篩分試驗2.2.1取樣用小鏟子在學校圖書館附近的土壤中和學校實驗室前土壤中挖一個10cm深的坑，從各自坑底取土樣。2.2.2準備實驗用品天平、電子天平、砝碼、鑷子、稱量紙、藥匙、玻璃棒、燒杯（1000ml）、三角瓶（250ml10個）、蒸餾水、機油、吸氣球、刻度吸管2.2.3制作培養(yǎng)基用天平分別稱取K2HPO4:1．0g，KH2PO4:1．0g，MgSO4:0.5g，NH4NO3:1．0g，用電子天平（電子天平使用方法見附錄）稱取CaC12:0．02g。FeCl2痕量，加入裝有1000ml蒸餾水的燒杯中，用玻璃棒攪拌加速溶解，待充分溶解后，用pH試紙測量其pH（pH約為7.0），在自然pH情況下將液體培養(yǎng)基分別裝入10個250ml洗凈的三角瓶中，每瓶100ml，將8層紗布放于瓶口，用鋁箔紙封口。等待高溫滅菌。2.2.3高溫滅菌將刻度吸管和10個三角瓶放入高溫滅菌鍋中滅菌。在培養(yǎng)基滅菌的過程中對實驗操作臺進行滅菌工作。并將所需用品放入操作臺面上，進行滅菌。2.2.4初次富集分離將高溫滅菌后的物品放入操作臺面上，待培養(yǎng)基冷卻后，取其中四個分別加入0.5g機油，然后分別將5g土壤放入以機油為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中，共兩組，標記為A1，A2；B1，B2。A：實驗室前土壤；B：圖書館前土壤。用紗布封住三角瓶口，放入30℃、130r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天2.2.5連續(xù)富集分離將在震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天的培養(yǎng)液用刻度吸管吸取5ml轉接至新的以機油為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中，再進行震蕩培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)共16天。整個轉接過程在無菌操作臺面上進行。2.2.6平板分離將滅菌后的實驗用品放入滅菌后的無菌操作臺面上，待培養(yǎng)基冷卻至40℃左右，加入機油（1000ml培養(yǎng)基加入3g），搖勻，然后倒平板。待培養(yǎng)基凝固后，對10-4,10-5，10-6，三個梯度進行涂布，每個梯度涂布三個。標注記號。將標注好的培養(yǎng)皿放入30℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)箱操作。2.2.7劃線分離準備物品：培養(yǎng)皿（若干）、天平、電子天平、砝碼、稱量紙、藥匙、玻璃棒、燒杯（1000ml）、三角瓶（若干個250ml）、無菌水、蒸餾水、機油、吸氣球、刻度吸管（1個10ml，若干個1ml）、酒精燈、火柴、托盤、涂布玻璃棒、試管架、試管、膠塞接種環(huán)將物品放入高溫滅菌鍋中滅菌20min后，放入無菌操作臺，待培養(yǎng)基冷卻至35℃左右，加入機油（1000ml培養(yǎng)基加入3g），搖勻，然后倒平板；待培養(yǎng)基凝固后，挑取不同形態(tài)的單菌落，進行劃線分離，每個單菌落劃線3個，以作平行試驗。然后標注記號。標號后放入已經(jīng)設置好溫度為30每天注意觀察等有較好的菌落長出時重復此劃線分離操作直至得到單菌落。分離純化得到的單菌落移到含機油的富集培養(yǎng)劑斜面上培養(yǎng)保存。并進行菌種初步分析。2.3生長條件正交實驗在保證供氧和氮磷鉀鈣鐵營養(yǎng)的前提下，選擇溫度、底物濃度和pH作為本次實驗的三個因素進行三水平實驗，方案見表3-2、表3-3。將平板培養(yǎng)48h的菌體刮下，5000r/min;離心分離5min得到濕菌體，向方案中每個樣品加入0.5g，培養(yǎng)4天后測定其含油量2.4混合菌機油降解效率ZL1ZL2菌雖然具有較強的機油降解能力,但后期降解速率顯著下降,5天后的去除率分別為67.9%76.2%?；旌暇N由于相互之間可能存在的共生與協(xié)同效應,較單一細菌而言,環(huán)境適應能力和生長能力有可能顯著提高,因此對難降解有機物的降解能力也可能有顯著提高[6]。為了進一步提高機油的生物降解能力,嘗試了2株菌的混合降解技術。分別取等量2種單菌混合后分別加入含機油1g/L的培養(yǎng)基中,2.5分析方法采用標準的萃取稱量法[4]測定培養(yǎng)液中的機油含量。由于在600nm處的吸光度OD值可以反映菌體生長量[5],采用北京第二光學儀器廠生產(chǎn)的分光光度計7220測定培養(yǎng)液的OD600以確定細菌的生長情況。為使讀數(shù)準確,所測得的OD600值均為稀釋10倍時的讀數(shù)。微生物培養(yǎng)液對機油的去除率可由公式1表示:η(%)=(1-Ct/C0)×100(公式1)微生物培養(yǎng)液對機油的降解速率可由公式2表示:μ(g/d·L)=C03η/ΔT3V(公式2)式中,η———機油去除率(%)Ct———剩余機油含量(g/L)C0———初始機油含量(g/L)μ———機油降解速率(g/d·L)ΔT———取樣時間間隔(d)V———培養(yǎng)液體積(L)3結果分析3.1優(yōu)勢菌篩分實驗富集培養(yǎng)過程中，土樣的液出現(xiàn)的泡沫較多，乳化現(xiàn)象明顯，菌液也較為粘稠，分離出較多的菌株，說明土壤中的石油烴能刺激石油降解菌的生長。經(jīng)過選擇富集培養(yǎng)涂布平板劃線分離細致的篩選分離工作,最終從固體選擇培養(yǎng)基上分離得到3株能以機油作為唯一碳源的優(yōu)勢微生物菌株，編號為ZL1、ZL2、ZL3，菌種基本性質見表3-1。表中所有菌種的適合培養(yǎng)溫度在25～37℃。從菌落形態(tài)和基本性質分析,可能為細菌。進一步培養(yǎng)篩先出降解性能較好的ZL1和ZL2進行正交實驗和混合培養(yǎng)實驗。表3-13株機油降解菌形態(tài)特征特征ZL1ZL2ZL3菌落形態(tài)圓形圓形圓形菌落顏色淺黃白色淺黃革蘭氏染色陰性陰性陰性菌體形態(tài)桿狀桿狀桿狀3.2生長條件正交試驗ZL1ZL2菌株按設定的正交實驗方案進行實驗，測定其剩余含油量，以降解油量作為考察指標，計算結果見表3-2、表3-3?？梢钥闯觯簻囟仁怯绊懡到庑Ч闹饕蛩?。25℃ZL1菌降解機油能力較強；油濃度越低降解效果越好；pH值為7時，降解效果最好,說明ZL1菌適于在中性條件下生長。30℃ZL2菌降解機油能力較強；機油含量在300ml/L-700ml/L范圍內(nèi)對降解效果影響不大，以含油500ml/L時降解效果最明顯，還應進一步擴大實驗油含量范圍以確定油含量對ZL2菌降解能力的影響；對pH值在4-8范圍內(nèi)對降解效果的影響也不顯著，其中pH為6時降解效果最好，說明ZL2表3-2ZL1菌株正交實驗方案及實驗結果表分組號溫度(℃)油量(mg/L)pH降解油量(mg/L)1254005.02322256007.02643258009.01944304007.02045306009.01736308005.01707354009.01278356005.01119358007.069表3-3ZL2菌株正交實驗方案及實驗結果表分組號溫度(℃)油量(mg/L)pH降解油量(mg/L)1253004.02292255006.03073257008.02884303006.03145305008.02786307004.03057353008.02268355004.02329357006.02193.3混合菌種實驗混合菌的除油效率較ZL1ZL2單個菌高,經(jīng)6天培養(yǎng),機油的去除率可95%以上,殘留機油濃度已低于50mg/L。這些說明這2株菌之間存在著某種共生與協(xié)同作用,使搖瓶中的生態(tài)系統(tǒng)既有利于微生物的生長,也有利于對機油的降解。這些協(xié)同作用可能包括基因水平的協(xié)同、酶與蛋白質水平的協(xié)同以及代謝產(chǎn)物水平的協(xié)同。例如某些微生物在代謝過程中產(chǎn)生的一些有害代謝產(chǎn)物可以被另一些菌作為底物消化,從而延緩了培養(yǎng)環(huán)境惡化的程度,有利于微生物的持續(xù)生長代謝和機油的降解。研究2株菌之間的最佳比例及其協(xié)同機理將有助于進一步提高混合菌的機油降解效率。4結論1學校腐蝕質土壤較適于做高效石油降解菌馴化菌源。篩選到兩株高效機油降解菌ZL1、ZL2。通過正交實驗得出ZL1菌適于在25℃，含油400mg/L左右，中性條件下生長。ZL2菌適于在30℃含油5002溫度對ZL1、ZL2菌的機油降解能力影響較大。ZL2菌pH值、機油濃度適應范圍較廣，應進一步擴大實驗范圍以確定其影響。3ZL1、ZL2菌對機油的去除率分別達到67.9%和.76.2%。4ZL1與ZL2株菌存在共生與協(xié)同效應?；旌暇某托Ч^單一菌株有顯著提高,機油去除率可達95%上。謝辭三年的讀書生活在這個季節(jié)即將劃上一個句號，而于我的人生卻只是一個逗號，我將面對又一次征程的開始。三年的求學生涯在師長、親友的大力支持下，走得辛苦卻也收獲滿囊，在論文即將付梓之際，思緒萬千，心情久久不能平靜。偉人、名人為我所崇拜，可是我更急切地要把我的敬意和贊美獻給一位平凡的人，我的導師程老師。我不是您最出色的學生，而您卻是我最尊敬的老師。您治學嚴謹，學識淵博，思想深邃，視野雄闊，為我營造了一種良好的精神氛圍。授人以魚不如授人以漁，置身其間，耳濡目染，潛移默化，使我不僅接受了全新的思想觀念，樹立了宏偉的學術目標，領會了基本的思考方式，從論文題目的選定到論文寫作的指導,經(jīng)由您悉心的點撥,再經(jīng)思考后的領悟,常常讓我有“山重水復疑無路,柳暗花明又一村”。

感謝我的爸爸媽媽，焉得諼草，言樹之背，養(yǎng)育之恩，無以回報，你們永遠健康快樂是我最大的心愿。在論文即將完成之際，我的心情無法平靜，從開始進入課題到論文的順利完成，有多少可敬的師長、同學、朋友給了我無言的幫助，在這里請接受我誠摯謝意！

同時也感謝學院為我提供良好的做畢業(yè)設計的環(huán)境。

最后再一次感謝所有在畢業(yè)設計中曾經(jīng)幫助過我的良師益友和同學，以及在設計中被我引用或參考的論著的作者。

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strains.Respectivelybymeansofmorphologicalobservationandphysiologicalandbiochemicalexperimentsidentified.Theresultsshowthat:forfixedbacteriumofW1bacteria,W2forbacteriaofthegenusbacillus,W3forpseudomonasofbacteria.2.2oildegradationbacteriumoilremovalabilityandthequantitychangeDeterminationstrainsW.WandWin1Odaysdegradationofoil(petroleuminitialcontentfor4000mg/L)efficiency.Alsorecordedinthedegradationofmicrobialintheprocessofdynamicchangethenumberthatearlyinthedegradation,themicrobesareinadaptingperiod,butW1goodadaptability,theseconddayofthedegradationratereached31.2%,andW2andW3only15.86%and9.66%.Thisandtheirgrowthinthenumber,thefirstldaystoreachW11.15xlO6,morethantheinitialnumbernearlyl0times,whiletheothertwokindsofbacteriaincreasedonlyslightly.Butthewholethreekindsofbacteriaarein2daysatfullgrowth,thenquantitychangeisnotbig.Andinthefirstfourdaysofmicroorganismonoildecompositionrateofthefastest,especiallythenextdayinthefourthday.2.3ultravioletmutationThroughtheoildegradationtest,weontheadvantageofw2,asastrainw1strains,ultravioletmutation.2.3.1thebacteriatonotgetmutantscomparedtoilluminate,willbeindifferentirradiationtimemutagenesisprocessafterthegroupdilutedwithflat,calculationofthebacteriumfluidpermilliliterlivingbacteriumnumber,andcalculationofsurvivalafteruvmutagenesis:surial(%)=treatmenteverymilliliterlivingbacteriumnumberpermilliliterWeiZhaolivingbacteriumnumber*100.Lbestirradiationtimefor40s.Wlandw2mutantswillthe40s,reoccupyselectionculturemediumscreening,getaseriesofmutantswas,throughtheperformanceevaluationandcomparison,fromwhichisusedtomakew1mutantsofywlandwmutantswasywinducedbythegrowthofbacteriacurveultravioletirradiationmutantsofthegrowthofbacteriaandnotmutagenesiscurveasshowninfigure2,mutantswastostabilizegrowthperiodareaslongas18h,fasterthanmutagenesisbefore6h.Thisshowseffectivemutagenesisstrainsofbacteriatogrowafterspeedwithaimproved.2.4mutantswasdifferenttimeoilandgeneticstabilitydegradationratedeterminationMorestrainsofdegradationefficiencyofoilbeforeandaftermutagenesis,thenmutantswascontinuedhighaftertheoilwasl5anddegradationrate.That,twostrainsofmutantsdegradationspeedthannotobviousmutantswasfast,degradationdegreehasalsoimproved.yw2hadthedegradationofl0dayoftheconcentrationofoilfromthe4000mg/Ldegradationto507.7mg/L,degradationratereached87.3%,increasedby9.72%thanw2;Andyw1ofmutantsdegradationrateis79.9%higherthanwl5.56%.Aftergenerationstocultivatel5afteryw1andyw2mutantswasforoilisstillatahighrateofdegradation,respectively,reachedto85.2%and78.6‰visibleultravioletmutagenesisgetstrainshavebettergeneticstability.Fromthegrowthcurvetosee,toenhancetheefficiencyofdegradationandthebreedingstrainsmayspeedrelevant.Thisalsomakesuseofperformanceforoilstrainshavebeenimproved.2.5MutantswasdifferentconcentrationofthedegradationofoileffectNotwithmutantswasW1,W2andmutantswastodifferentconcentrationsofoilrespectivelyfordegradation,l0daysaftertherestoftheoilcontentdetermination,tocomparetheirdifferentconcentrationsofthetreatmenteffectsoftheoil,itisknownthattheconcentrationofmutantswasdifferentthedegradationofoilarehighefficiency.Infrontofthemutantsstrain.Inthelowconcentrationinthedegradationofthestrainsefficiencyquite,mutantswasnoobviousadvantages,butwiththeincreaseofconcentration,ofmutantsefficiencyisalsomoreandmoreobvious.W1W2andthedegradationofwiththeincreaseofconcentrationefficiencyisdegressivetendency,whenconcentrationreach8000mg/Lthedegradationratewere66.29%and55,88%,explainahighconcentrationofoiltobacteriawhichthepoisonouseffect,makingthemdifficulttoadapt.Andofmutantstolerabilityobviouslyimproved,inconcentrationfor8000mg/L,yw1/yw2degradationratesashighas74,%andstill84.24%.Byultravioletradiationthatbacteriaafterbacteriastructurechanges,itisthevariationofbacteriaintheabilityoftoxicityisimproved.Mutantswasdifferentconcentrationofthedegradationofoileffect3conclusions3.1Throughthescreenseparationandenrichment,thedegradationofoilcaneffectivestrainsw1,w2andw3.3.2Thedegradationofstrainsofabilityandtheirrelationshipbetweencertainbiomass,bymeansofmeasuringthechangeofbiomasstoevaluatetheefficiencyofbioremediation.3.3W1,w2andw3.AfterthedegradationoflOday,degradationratereached74.34%,77.58%and65.48%respectivelyforfuturereferenceforthepracticalapplication.3.4W1andw2foruvmutagenesisgetmutantsofyw1,yw2gro