PCR原理及檢測說課講解課件

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的基本聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的基本

多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR：PolymeraseChainReaction)

KaryB.Mullis

PCR是由美國科學(xué)家穆利斯提出的一種體外簡化條件下模擬DNA體內(nèi)復(fù)制的DNA快速擴增的方法，此技術(shù)獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎。多聚酶鏈式反應(yīng)KaryB.MullPCR的概念PCR體系的組成常見的PCR分類PCR產(chǎn)物常見的檢測方法PCR原理及檢測說課講解課件

聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR：PolymeraseChainReaction)

它是一個在體外特異地復(fù)制一段已知/未知（？）序列的DNA片段的過程，這項技術(shù)使人們很快從試管中獲得大量拷貝的特異核酸片段。

聚合酶鏈式反應(yīng)它是一個在體外特異地復(fù)制PCR的基本原理變性、復(fù)性、半保留復(fù)制一生二，二生四，四生萬物

PCR三步曲變性90～97℃退火45～55℃延伸72℃左右PCR過程PCR的基本原理變性、復(fù)性、半保留復(fù)制一生二，二生四，PCR反應(yīng)循環(huán)72℃95℃55℃PCR循環(huán)變性退火延伸PCR反應(yīng)循環(huán)72℃95℃55℃PCR循環(huán)變性退火延伸1234522557294時間（min）溫度（℃）2.PCR的反應(yīng)過程適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍1234522557294時間（min）溫度（℃）2.PCPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件1234522557294時間PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件95℃50℃引物1引物2DNAPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件50℃引物1引物2DNA引物7PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件95℃50℃72℃TaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結(jié)束PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件72℃第2輪結(jié)束3.PCR技術(shù)的特點1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍3.PCR技術(shù)的特點1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴增量達232）特異性引物引物引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。引物設(shè)計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。2）特異性引物引物引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決引物設(shè)計原則：（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴增區(qū)無同源序列。（2）引物長度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機分布,G+C占50-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補序列。（6）引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無嚴格限制。引物設(shè)計原則：3’5’3’5’限制性內(nèi)切酶的識別序列啟動子序列定點突變探針標記3’5’3’5’限制性內(nèi)切酶的識別序列3）操作簡便易行

PCR擴增法,只需要數(shù)小時,就可以用電泳法檢出1μg基因組DNA中僅含數(shù)個拷貝的模板序列。通常的DNA擴增法是分子克隆法,首先要構(gòu)建含有目的的基因的載體,然后將它導(dǎo)入細胞后進行擴增,還要用同位索探針進行篩選;這種方法,要經(jīng)過DNA內(nèi)切、連接、轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)等相關(guān)的過程,操作復(fù)雜,一般需要數(shù)周時間。3）操作簡便易行PCR擴增法,只需要數(shù)小時,就可以用4）用途廣泛生命學(xué)科醫(yī)學(xué)工程遺傳工程疾病診斷法醫(yī)學(xué)考古學(xué)4）用途廣泛生命學(xué)科PCR的特點靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞病毒檢測的靈敏度可達3個RFU細菌檢測的最小檢出率為3個細菌簡便、快速一次性加好反應(yīng)液，2～4小時完成擴增擴增產(chǎn)物一般用電泳分析對標本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提DNAPCR的特點靈敏度高4.PCR的反應(yīng)體系和方法

PCR管加熱使模板變性,退火使引物與模板DNA互補,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫(72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP為原料,以引物為復(fù)制的起點,合成新鏈。如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,即高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;將擴增產(chǎn)物進行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的DNA帶。

4.PCR的反應(yīng)體系和方法PCR管加熱使模板變性,

總體積

50-100l

Buffer

緩沖液

dNTP

原料

Primer

引物

DNA分子

模板

Taq

DNA聚合酶

1）反應(yīng)體系總體積PCR技術(shù)的基本過程(1)模板DNAdNTP引物Buffer預(yù)變性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5’2）基本過程PCR技術(shù)的基本過程(1)模板DNA預(yù)變性模板DNATaPCR技術(shù)的基本過程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循環(huán)儀94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min循環(huán)25～35次PCR技術(shù)的基本過程(2)Taq酶循94℃Taq酶72瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)的基本過程(3)瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)的基本過程(3)1）PCR反應(yīng)成分（1）模板

單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。3）PCR反應(yīng)條件1）PCR反應(yīng)成分（1）模板3）PCR反應(yīng)條件提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)（2）引物濃度

0.1-0.5mol/L濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配,反應(yīng)特異性下降。

引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增（2）引物濃度引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)天然酶：從棲熱水生桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U（指總反應(yīng)體積為100ul時）濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少（3）Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)

0.5-2.5U/50l目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)（3）TaqDN（4）dNTP

dNTP濃度取決于擴增片段的長度四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。（4）dNTPdNTP的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系dNTP呈顆粒狀，保存不當易變性失活dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1MNaOH或1MTris-HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)到7.0-7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50-200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低dNTP的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。2）循環(huán)參數(shù)變性

使雙鏈DNA解鏈為單鏈94oC20-30秒(2)退火

溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。2）循環(huán)參數(shù)（3）延伸

70-75℃,一般為72℃延伸時間由擴增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù)

主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴增效率降低錯誤摻入率增加（3）延伸經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃7min42℃forever經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）94℃303）PCR反應(yīng)條件的選擇PCR反應(yīng)條件:溫度時間循環(huán)次數(shù)3）PCR反應(yīng)條件的選擇PCR反應(yīng)條件:溫度與時間的設(shè)置：設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點標準反應(yīng)中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸對于較短靶基因（長度為100～300bp時）可采用二溫度點法，將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸溫度與時間的設(shè)置：設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性若低于93℃則需延長時間但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導(dǎo)致PCR失?、僮冃詼囟扰c時間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的

②退火(復(fù)性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想②退火(復(fù)性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較引物的復(fù)性溫度

通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值（解鏈溫度）=4（G+C）＋2（A+T）在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性復(fù)性時間一般為30-60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合引物的復(fù)性溫度

通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值（解鏈③延伸溫度與時間：TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：

70-80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時，DNA合成幾乎不能進行③延伸溫度與時間：TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：

③延伸溫度與時間：延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間常用溫度為72℃過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。延伸反應(yīng)時間：根據(jù)待擴增片段長度而定1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min（足夠）3～4kb的靶序列需3～4min擴增10Kb需延伸至15min延伸進間過長會導(dǎo)致非特異性擴增對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些③延伸溫度與時間：延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度循環(huán)次數(shù)：選在30～40次之間循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)三、常見的PCR技術(shù)名稱主要用途簡并引物擴增法擴增未知基因片斷巢式PCR提高pcr敏感性、特異性，分析突變復(fù)合PCR同時檢測多個突變或病原反向PCR擴增已知序列兩側(cè)的未知序列，致產(chǎn)物突變單一特異引物PCR擴增未知基因組DNA單側(cè)引物PCR通過已知序列擴增未知cDNA錨定PCR分析具備不同末端的序列三、常見的PCR技術(shù)名稱主要用途簡并引物擴增法擴增未知基因片名稱主要用途增效PCR減少引物二聚體，提高PCR特異性固著PCR有利于產(chǎn)物的分離膜結(jié)合PCR去除污染的雜質(zhì)或PCR產(chǎn)物殘留表達盒PCR產(chǎn)生合成或突變蛋白質(zhì)的DNA片斷連接介導(dǎo)PCRDNA甲基化分析、突變和克隆等RACE-PCR擴增cDNA末端定量PCR定量mRNA或染色體基因原位PCR研究表達基因的細胞比例等臆斷PCR鑒定細菌或遺傳作用通用引物PCR擴增相關(guān)基因或檢測相關(guān)病原信使擴增表型分型同時分析少量細胞的mRNA名稱主要用途增效PCR減少引物二聚體，提高PCR特異性固著P定量PCR：熒光實時定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。常用的熒光標記方法可簡單分為兩大類：非特異檢測——雙鏈DNA內(nèi)插式熒光染料；代表是SYBRGreenI熒光染料擴增序列專一檢測——主要指熒光探針。TaqMan探針、和分子信標MolecularBeacon熒光染料技術(shù)成本低廉，實驗設(shè)計簡便；而探針雜交技術(shù)在原理上嚴格，所得數(shù)據(jù)特異性高、更為精確定量PCR：SYBRGreenI工作原理：SYBRGreen1

結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen1

染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA

SYBRGreenI只與DNA雙鏈結(jié)合，插入DNA雙鏈時發(fā)出熒光；DNA雙鏈解鏈時釋放出來，熒光信號急劇減弱。在一個加入過量SYBRgreen1熒光染料的體系內(nèi)，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量SYBRGreenI工作原理：SYBRGreen1GTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACGGTAAT變性DNA未結(jié)合SYBRGreen1dye變性:無熒光信號SYBRGreenI工作原理GTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGMolecularBeacons莖由互補配對的序列組成環(huán)與目標序列完全配對熒光基團淬滅基團分子信標（molecularbeacon）是一類能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(或者叫莖環(huán)結(jié)構(gòu))的探針，序列兩末端序列互補（5—8bp左右），中間環(huán)一般為15-30個核苷酸長，并與目標序列互補。探針一端標記報告熒光基團，另一端結(jié)合淬滅基團，當互補序列出現(xiàn)時，探針與DNA雜交，探針轉(zhuǎn)變成一個開放的線性結(jié)構(gòu)，報告熒光基團與淬滅熒光基團彼此在空間上產(chǎn)生足夠的分離，熒光基團脫離了淬滅基團的影響，從而產(chǎn)生可被檢測到的熒光

當探針游離呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，結(jié)合在其兩端的熒光基團距離上接近，熒光基團激發(fā)的熒光能量被淬滅基團吸收而使檢測探頭無法檢測到。MolecularBeacons莖由互補配對的序列組成環(huán)與延伸:沒有熒光MolecularBeacons延伸:沒有熒光MolecularBeaconsMolecularBeaconsSNPTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQ熒光素目標序列莖淬滅劑MolecularBeaconsSNPTACCGGGGGPCR原理及檢測說課講解課件指擴增時在加入一對引物的同時另外加入一個特異性的熒光探針：該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物之間。探針的5′端標記有熒光報告基團(Reporter,R)，3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q。）當探針完整的時候，5′端報告基團經(jīng)儀器光源激發(fā)的熒光正好被近距離的3′端熒光基團淬滅，儀器檢測不到5′端報告基團所激發(fā)的熒光信號與目標序列互補TaqMan探針法：指擴增時在加入一對引物的同時另外加入一個特異性的熒光探針：與 PCR擴增過程中：Taq酶在鏈延伸時遇到與模板結(jié)合的探針，其5′-3′外切酶活性（此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響）就會將切割探針釋放5′端報告基團游離于反應(yīng)體系中，遠離3′端熒光淬滅基團的屏蔽，5′端報告基團受激發(fā)所發(fā)射的熒光信號就可以被探頭檢測到。每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。報告信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數(shù) PCR擴增過程中：定量原理：熒光信號閾值（threshold）：前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值真正的信號:熒光信號超過閾值定量原理：熒光信號閾值（threshold）：Ct值的定義：PCR擴增過程中熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。實驗操作中，Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。C(t)valueCt值的定義：C(t)value橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量Ct值的特點：相同模板進行96次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性相同模板在同一臺PCR儀上相同條件下重復(fù)96次擴增的擴增曲線圖橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量Ct值的特點：相同模板謝謝大家！謝謝大家！聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的基本聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的基本

多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR：PolymeraseChainReaction)

KaryB.Mullis

PCR是由美國科學(xué)家穆利斯提出的一種體外簡化條件下模擬DNA體內(nèi)復(fù)制的DNA快速擴增的方法，此技術(shù)獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎。多聚酶鏈式反應(yīng)KaryB.MullPCR的概念PCR體系的組成常見的PCR分類PCR產(chǎn)物常見的檢測方法PCR原理及檢測說課講解課件

聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR：PolymeraseChainReaction)

它是一個在體外特異地復(fù)制一段已知/未知（？）序列的DNA片段的過程，這項技術(shù)使人們很快從試管中獲得大量拷貝的特異核酸片段。

聚合酶鏈式反應(yīng)它是一個在體外特異地復(fù)制PCR的基本原理變性、復(fù)性、半保留復(fù)制一生二，二生四，四生萬物

PCR三步曲變性90～97℃退火45～55℃延伸72℃左右PCR過程PCR的基本原理變性、復(fù)性、半保留復(fù)制一生二，二生四，PCR反應(yīng)循環(huán)72℃95℃55℃PCR循環(huán)變性退火延伸PCR反應(yīng)循環(huán)72℃95℃55℃PCR循環(huán)變性退火延伸1234522557294時間（min）溫度（℃）2.PCR的反應(yīng)過程適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍1234522557294時間（min）溫度（℃）2.PCPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件1234522557294時間PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件95℃50℃引物1引物2DNAPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件50℃引物1引物2DNA引物7PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件95℃50℃72℃TaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結(jié)束PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件72℃第2輪結(jié)束3.PCR技術(shù)的特點1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍3.PCR技術(shù)的特點1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴增量達232）特異性引物引物引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。引物設(shè)計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。2）特異性引物引物引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決引物設(shè)計原則：（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴增區(qū)無同源序列。（2）引物長度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機分布,G+C占50-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補序列。（6）引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無嚴格限制。引物設(shè)計原則：3’5’3’5’限制性內(nèi)切酶的識別序列啟動子序列定點突變探針標記3’5’3’5’限制性內(nèi)切酶的識別序列3）操作簡便易行

PCR擴增法,只需要數(shù)小時,就可以用電泳法檢出1μg基因組DNA中僅含數(shù)個拷貝的模板序列。通常的DNA擴增法是分子克隆法,首先要構(gòu)建含有目的的基因的載體,然后將它導(dǎo)入細胞后進行擴增,還要用同位索探針進行篩選;這種方法,要經(jīng)過DNA內(nèi)切、連接、轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)等相關(guān)的過程,操作復(fù)雜,一般需要數(shù)周時間。3）操作簡便易行PCR擴增法,只需要數(shù)小時,就可以用4）用途廣泛生命學(xué)科醫(yī)學(xué)工程遺傳工程疾病診斷法醫(yī)學(xué)考古學(xué)4）用途廣泛生命學(xué)科PCR的特點靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞病毒檢測的靈敏度可達3個RFU細菌檢測的最小檢出率為3個細菌簡便、快速一次性加好反應(yīng)液，2～4小時完成擴增擴增產(chǎn)物一般用電泳分析對標本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提DNAPCR的特點靈敏度高4.PCR的反應(yīng)體系和方法

PCR管加熱使模板變性,退火使引物與模板DNA互補,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫(72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP為原料,以引物為復(fù)制的起點,合成新鏈。如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,即高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;將擴增產(chǎn)物進行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的DNA帶。

4.PCR的反應(yīng)體系和方法PCR管加熱使模板變性,

總體積

50-100l

Buffer

緩沖液

dNTP

原料

Primer

引物

DNA分子

模板

Taq

DNA聚合酶

1）反應(yīng)體系總體積PCR技術(shù)的基本過程(1)模板DNAdNTP引物Buffer預(yù)變性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5’2）基本過程PCR技術(shù)的基本過程(1)模板DNA預(yù)變性模板DNATaPCR技術(shù)的基本過程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循環(huán)儀94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min循環(huán)25～35次PCR技術(shù)的基本過程(2)Taq酶循94℃Taq酶72瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)的基本過程(3)瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)的基本過程(3)1）PCR反應(yīng)成分（1）模板

單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。3）PCR反應(yīng)條件1）PCR反應(yīng)成分（1）模板3）PCR反應(yīng)條件提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)（2）引物濃度

0.1-0.5mol/L濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配,反應(yīng)特異性下降。

引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增（2）引物濃度引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)天然酶：從棲熱水生桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U（指總反應(yīng)體積為100ul時）濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少（3）Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)

0.5-2.5U/50l目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)（3）TaqDN（4）dNTP

dNTP濃度取決于擴增片段的長度四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。（4）dNTPdNTP的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系dNTP呈顆粒狀，保存不當易變性失活dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1MNaOH或1MTris-HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)到7.0-7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50-200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低dNTP的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。2）循環(huán)參數(shù)變性

使雙鏈DNA解鏈為單鏈94oC20-30秒(2)退火

溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。2）循環(huán)參數(shù)（3）延伸

70-75℃,一般為72℃延伸時間由擴增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù)

主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴增效率降低錯誤摻入率增加（3）延伸經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃7min42℃forever經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）94℃303）PCR反應(yīng)條件的選擇PCR反應(yīng)條件:溫度時間循環(huán)次數(shù)3）PCR反應(yīng)條件的選擇PCR反應(yīng)條件:溫度與時間的設(shè)置：設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點標準反應(yīng)中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸對于較短靶基因（長度為100～300bp時）可采用二溫度點法，將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸溫度與時間的設(shè)置：設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性若低于93℃則需延長時間但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導(dǎo)致PCR失?、僮冃詼囟扰c時間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的

②退火(復(fù)性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想②退火(復(fù)性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較引物的復(fù)性溫度

通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值（解鏈溫度）=4（G+C）＋2（A+T）在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性復(fù)性時間一般為30-60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合引物的復(fù)性溫度

通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值（解鏈③延伸溫度與時間：TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：

70-80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時，DNA合成幾乎不能進行③延伸溫度與時間：TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：

③延伸溫度與時間：延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間常用溫度為72℃過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。延伸反應(yīng)時間：根據(jù)待擴增片段長度而定1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min（足夠）3～4kb的靶序列需3～4min擴增10Kb需延伸至15min延伸進間過長會導(dǎo)致非特異性擴增對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些③延伸溫度與時間：延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度循環(huán)次數(shù)：選在30～40次之間循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)三、常見的PCR技術(shù)名稱主要用途簡并引物擴增法擴增未知基因片斷巢式PCR提高pcr敏感性、特異性，分析突變復(fù)合PCR同時檢測多個突變或病原反向PCR擴增已知序列兩側(cè)的未知序列，致產(chǎn)物突變單一特異引物PCR擴增未知基因組DNA單側(cè)引物PCR通過已知序列擴增未知cDNA錨定PCR分析具備不同末端的序列三、常見的PCR技術(shù)名稱主要用途簡并引物擴增法擴增未知基因片名稱主要用途增效PCR減少引物二聚體，提高PCR特異性固著PCR有利于產(chǎn)物的分離膜結(jié)合PCR去除污染的雜質(zhì)或PCR產(chǎn)物殘留表達盒PCR產(chǎn)生合成或突變蛋白質(zhì)的DNA片斷連接介導(dǎo)PCRDNA甲基化分析、突變和克隆等RACE-PCR擴增cDNA末端定量PCR定量mRNA或染色體基因原位PCR研究表達基因的細胞比例等臆斷PCR鑒定細菌或遺傳作用通用引物PCR擴增相關(guān)基因或檢測相關(guān)病原信使擴增表型分型同時分析少量細胞的mRNA名稱主要用途增效PCR減少引物二聚體，提高PCR特異性固著P定量PCR：熒光實時定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。常用的熒光標記方法可簡單分為兩大類：非特異檢測——雙鏈DNA內(nèi)插式熒光染料；代表是SYBRGreenI熒光染料擴增序列專一檢測——主要指熒光探針。TaqMan探針、和分子信標MolecularBeacon熒光染料技術(shù)成本低廉，實驗設(shè)計簡便；而探針雜交技術(shù)在原理上嚴格，所得數(shù)據(jù)特異性高、更為精確定量PCR：SYBRGreenI工作原理：SYBRGreen1

結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen1

染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGA