《抗生素與化學治療》

《抗生素與化學治療》美國微生物協(xié)會版權所有（中譯文初稿）抗病毒劑-愛力諾力克鈣的特異性約翰·海思茲，阿瑟·海厄，菲利普·卡爾英國伊利諾伊州厄巴納伊利諾伊大學微生物系61801愛力諾力克鈣是一種抗病毒刑，可抑制逆轉錄酶，雞胚胎成纖維細胞生長，同時還可抑制大腸桿菌菌株和枯草桿菌菌株。體外的藥劑抑制大腸桿菌DNA聚合酶II和DNA聚合酶III全酶以及其他一些酶。通常的DNA聚合酶鑒定成分，除了亞精胺外，對已觀察到的抑制性沒有影響。藥劑對DNA聚合酶II的抑制性看來是由于對酶直接的，不可逆轉的影響造成的。然而，大腸桿菌里的DNA合成并不比細胞團的增長更容易受藥劑的影響。這些結果表明愛力諾力克鈣是一種低特量抑制劑。愛力諾力克鈣是從經(jīng)過微酸催化的橄欖的汁液中分離出來的一種單帖，—種體外殺病毒刑，可以殺大量RNA和DNA病毒。它也會減少感染副流感病毒的倉鼠所攜帶病毒的生長，應用于動物時，毒性很小。愛力諾力克鈣抑制莫洛尼氏白血病毒和勞舍爾氏白血病病毒的RNA依賴的DNA聚合酶(逆轉錄酶)，當愛力諾力克鈣濃度為20ug/ml時，抑制率達到50％：此藥劑好象不會和核酸制劑或DNA或RNA發(fā)生反應。經(jīng)證明，此藥劑直接抑制逆轉錄酶。在早期潛伏期，用2—M等量的氨基乙酸，離氨酸，半胱氨酸或組氨酸可以使此藥利滅活，用其他氨基酸則無效。要滅活此藥劑，必須有一個游離氨基酸組，然而，此藥劑在濃度高為200ug/ml，不會對埃希氏大腸桿菌RNA聚合酶或DNA聚合酶I起抑制作用。最近曾經(jīng)有過關于愛力諾力克酸的結構和鹽酸甲基愛力諾力克的總合成的報道。我們需要判斷此藥劑是否抑制大腸桿菌DNA聚合酶11或III，因為逆轉酶在很多特性上部和這些酶非常相似。大腸桿菌酶的一種特定抑制劑可能對闡明細胞中這些酶的生理作用很有幫助。然而，兩種酶受到抑制的程度很相近，而且進一步的研究表明此藥劑并非特效材料和方法材料：細胞培養(yǎng)皿是用獵鷹塑科做的。改良細胞培養(yǎng)液干粉，磷酸胰化蛋白稀釋液，小牛血清和雞血清是從格蘭德艾蘭生物化宇公司獲得的。[3H]胸腺嘧啶，7．OCi/mmol是從施瓦茨/曼購買的。[3H]胸甘，5—三磷酸，50Ci/mmol購自NewEnglandNuclear公司。小牛血清DNA(V型)是從西格瑪購得的，將胰去氧核糖核酸水解晦(脫氧核糖核酸酶I)水解(渥新頓，EC3．1．4．5)以便使DNA聚合酶III獲得最大的活性。愛力諾力克鈣，項目9426—JHF2是卡拉麻組，米奇的美國普強公司獻給世人的一個豐厚的禮物。當把此藥利以1：lOmg/ml的濃度溶于水中并冷凍保存時，它可以通過反復的凍結和融化維持至少兩個月的穩(wěn)定性：細菌的滋長：大腸桿菌菌株W3110(thyA36和dra-2)和D)10(polAl，endA—，thyA36和dra—2)是從美國康乃秋克州的紐哈芬市的大腸桿菌基因庫中心獲得的。尤金內斯特分離出來的枯草桿菌原養(yǎng)型菌株WB746是從薩穆爾．卡普蘭處獲得的。細菌生長在M9基本培養(yǎng)基中，并補充以0．2％葡萄糖，lmm無水硫酸鎂和每毫升4ug胸腺嘧啶：平板培養(yǎng)基可以用1.5％的瓊脂(Difco)來使之凝固。細胞團是光學密度在為450nm時由ZeissPMQll分光尤度計確定的。總的細胞數(shù)是通過在Petroff-Hauserchamber記數(shù)200別400個細胞來確定的。成活細胞的數(shù)量是通過適當稀釋以后用M9瓊脂作為平板來確定的：DNA合成是通過把[H]胸腺嘧啶包含列不溶酸含量中去水測定的。雞胚胎成纖維細胞的生長:主要的雞胚胎成纖維細胞，正如前面所描述的那樣，是用十天大的雞胚胎準備的。這些細胞經(jīng)過在38℃下四五天的生長，從細胞培養(yǎng)皿中被移出，浸泡在有0．05％胰蛋白酶的三羥甲基氨基甲烷，三羥甲基鹽酸(25mM三羥甲基鹽酸[pH7．3]，140mM氯化鈉，5mM氯化鉀和0．7mM磷酸二氫鈉)中并置于10個細胞/35mm的細胞培養(yǎng)皿中。細胞被培植在41℃的含10％磷酸胰化蛋白稀釋液，4％小牛血清和1％的遇熱處理使之不活化的雞血清的改良細胞培養(yǎng)液中。所有的實驗在于皿接種24小時后開始。細胞的增長速度是在把細胞用三羥甲基鹽酸中的0．25％的胰蛋白酶和0．1％葡萄糖從培養(yǎng)皿中移走后通過顆粒計數(shù)器來測定的。錐蟲藍和0．9％的鹽水被攝取用來估計細胞的成活率。在幾次實驗中，細胞是用胰化蛋白緩和的鹽水沖洗的，此鹽水中含有140mM氯化鈉，5．4mM磷酸二氫鈉，5mM氯化鉀，1.8mM氯化鈣，lmM磷酸二氫鈉，0．

酶的抑制性研究

雞的蛋白溶菌酶(A等，EC2．3．1.17)是從西格瑪購進的。內切核酸酶(NFCP，EC3．1．4．7)和胰臟脫氧核糖核酸酶{(DPFF，EC3．1．4．5)是從渥新頓購得的。將這些濃度為40—50ugml的酶在37℃下暴露于5mM三羥甲基鹽酸中的酸堿度為8．0的愛力諾力克鈣半個小時，然后按照供應商所描述的進行鑒定。將大腸桿菌DNA聚合酶II用Kornberg和Geftcr的方法進行提純，緊接著是透析，磷酸纖維素層析法和葡聚糖凝膠G—100凝膠過濾法。這種酶有125Ums的最終比活度，并按Ottoet．al所推薦的進行儲存。DNA聚合酶II的標準鑒定含(0．3ml—體積)：33mM三醋酸緩和物(酸堿度7．2，30℃)，50mM氯化鉀，16．7mM二硫蘇糖醇，13．3mM氯化鎂，280uM(核苷酸)經(jīng)過脫氧核糖核酸酶水解過的小牛胸腺DNA，33uM(每個)脫氧腺苷三磷酸二鈉，deoxyeytosine三磷酸二鈉，脫氧胞苷酸和[3H]脫氧胸苷三磷酸二鈉(150counts/min每毫克蛋白)，大約0．7ug酶(通過假定270U/mg比活度的制劑的純度很高來估箅的)和愛力諾力克鈣的濃度。37℃下的潛伏時間為30分鐘，參入核甘酸的不溶酸產品用前面所描述的方法測量。DNA聚合酶III全酶的原提取液是按照Wickner和Kornberg所描述的進行準備的，培植在M9中，并輔以1％的葡萄糖和0．2％的酸水解酪素(Difco)3．5X108／m1。DNA聚合酶III全酶的標準鑒定包含(0．3ml體積)：33mMmoroholinopropane磺酸氫氧化鉀緩和物(酸堿度7．0)，16．7mM二硫蘇糖醇，6．7mM氧化鎂，5mM氯化鈉，1．4mM(核苷酸)經(jīng)過脫氧核糖核酸酶水解過的小牛胸腺DNA，1.3mM腺苷三磷酸二鈉，0．15mg/每毫升大腸桿菌磷脂質，133uM脫氧腺苷三磷酸二鈉，deoxycytoslne三磷酸二鈉，脫氧胞苷酸和[3結果

酶抑制性的光譜:如圖表l中所示，愛力諾力克鈣對大腸桿菌DNA聚合酶II和DNA聚合酶III全酶有抑制作用。和以前發(fā)表的報導相一致的是，控制實驗(數(shù)據(jù)沒有出示)表明愛力諾力克鈣對DNA聚合酶II的抑制性不受任何一個DNA聚合酶II或DNA聚合酶III全酶鑒定因素的影響，除了亞精胺外，這一結果沒有用于DNA聚合酶III全酶在提取液中活性情況的測定，因此，這兩種酶在易受影響狀況方面的明顯差異不能用二者在酶鑒定方面的差異來解釋。

愛力諾力克鈣對DNA聚合酶II活動性的抑制作用，不能通過增加DNA，脫氧核(糖核)苷三磷酸鹽或鎂的濃度來克服，但是可以通過增加酶的濃度來克服(圖表1)。因此，抑制性看來是針對酶自身的。而且，愛力諾力克鈣對DNA聚合酶II的抑制作用看來是不可逆轉的(圖表1)。將DNA聚合酶II在37℃

圖1

愛力諾力克鈣對幾種酶的抑制作用。在無藥劑的情況下所觀察列的酶的活動被視為100％。

符號：△微球菌核酸酶；○雞的蛋白溶菌酶；●大腸桿菌DNA聚合酶II；□大腸桿菌DNA聚合酶III全酶；▲胰臟脫氧核糖核酸酶,圖表l影響愛力諾力克鈣對DNA聚合酶抑制作用的因素指數(shù)條件觀察到的抑制性（%）標準鑒定條件42把DNA濃度增加五倍到1.4mM40把脫氧核（糖核）酸苷三磷酸鹽的濃度增加到每個133uM42把鎂的濃度稀釋四倍到3.3mM39把酶的濃度增加四倍27把酶的濃度增加十倍18將酶在37℃66

此圖表表明了DNA聚合酶II的標準鑒定以及200ugml的愛力諾力克鈣的抑制活動。鑒定配合比中愛力諾力克鈣的最終濃度為17ug/ml，對DNA聚合酶II的抑制作用微乎其微(表1)。然而，在此次實驗中，和暴露于水相比，DNA聚合酶II在暴露于愛力諾力克鈣時受列更強烈的抑制，這表明暴露于500ug/ml的愛力諾力克鈣的影響是不可逆轉的。

表l還表明了愛力諾力克鈣對其他幾種酶活動的影響。盡管胰臟脫氧核糖核酸酶I僅僅在藥劑配制為高濃度時才受到輕微的抑制，溶菌酶和微球菌核酸酶較之DNA聚合酶II更易受到愛力諾力克鈣的抑制。實際上，微球菌核酸酶，50％的活動性在濃度為2ug／ml時受到抑制，受藥劑影響的程度是濾過性毒菌逆轉酶的10倍。

大腸桿菌體內靶的抑制性

對大腸桿菌里的DNA復制至關重要的DNA聚合酶III受到了愛力諾力克鈣的抑制，因此我們想確定大腸桿菌里的DNA合成是不是首先受到體內愛力諾力克鈣的抑制。早期的實驗表明枯草桿菌WB746和大腸桿菌w3110的生長受到了愛力諾力克鈣的抑制。因此我們就愛力諾力克鈣對大腸桿菌生長培養(yǎng)物的指數(shù)增長進行了觀察(表2)。表2A是對照標準，表明這些細胞在快速平衡地增長，就象所有參數(shù)的平行增長所表明的一樣。

表2B表明200ug/ml(0．75mM)的愛力諾力克鈣的作用。此藥劑在這個濃度表現(xiàn)為抑制菌，因為在暴露于此藥劑20分鐘后，所有的參數(shù)從60分鐘倍增時間平行變?yōu)?5分鐘倍增時間。值得注意的是，即使在此藥劑濃度對此菌株的生長產生很小影響的時候，DNA合成看起來比細胞團的增氏更容易受到抑制。

表2C表明500ug/ml(1.88mM)的愛力諾力克鈣的影響。在暴露于此藥劑20分鐘后，DNA合成，細胞分裂和細胞生長全部停止了。此藥劑在這個濃度上看起來是一種高抑制菌，因為在添加了此藥劑后，成活細胞的數(shù)量大幅度下降。

愛力諾力克鈣對雞胚胎成纖維細胞的影響。據(jù)報導，濃度為200ug/m1的愛力諾力克鈣對培養(yǎng)液中的鼠胚胎成纖維細胞無毒性：我們發(fā)現(xiàn)配制為此濃度的藥劑減緩了大腸桿菌的生長速度，同時也對大量體外酶起到了抑制了作用。因為愛力諾力克鈣會受到細胞培養(yǎng)液中氨圣酸的滅活，我們在幾次不同的實驗條件下對此藥劑對培養(yǎng)液中雞胚胎成纖維細胞的影響進行了調查(圖表2)。這些細胞用磷酸生理食鹽水沖洗以去除培養(yǎng)液中的氨基酸后，暴露于磷酸生理食鹽水中的愛力諾力克鈣20分鐘，配制為500ugml濃度的藥劑土觀出毒性，而200ug/ml濃度的藥劑大幅度減緩了細胞的生長速度：配制的濃度為50ug/rnl的藥劑對生長速度則無任何影響。然而，正如圖表2中所示，愛力諾力克鈣對雞胚胎成纖維細胞的影響在很大程度上依賴于培養(yǎng)液和暴露于此藥劑的時間的長短。即使采用最溫和的實驗條件(在生長培養(yǎng)液中暴露30分鐘)生長速度也會受到200ug／ml的愛力諾力克鈣的輕微抑制。

表2:愛力諾力克鈣對在27℃下在M9培養(yǎng)液中的大腸桿菌W3110的指數(shù)增K的影響。按照箭頭所指的時間，[3討論

這些有關愛力諾力克鈣的研究表明此藥劑抑制大腸桿菌菌株和枯草桿菌菌株的生長。此藥劑對體外大腸桿菌DNA聚合酶II和DNA聚合酶III全酶具有抑制作用。酶在受影響程度方面的細微差別不能用酶在鑒定條件方面的差別來解釋，但是可以反映出在酶制劑純度方面的一些差別，因為此藥劑似乎對DNA聚合酶II會起直接的不可逆轉的化學反應，同時抑制幾種不相關的酶。愛力諾力克鈣似乎并不是起著一種傳導阻滯硫基劑的作用，但是會被氨基酸和亞精胺滅活。此藥劑似乎會和自由氨基起化學反應。盡管DNA聚合酶II和III會受到體外愛力諾力克鈣的抑制，大腸桿菌里的DNA合成并不比細胞團的增氏更容易受到此藥劑的影響。這些觀察表明大腸桿菌里愛力諾力克鈣的主要作用可能是通過與自由氨基和蛋白質的共價反應宋抑制生長。圖表2愛力諾力克鈣對雞胚胎成纖維細胞生長的影響指數(shù)愛力諾力克鈣（g/ml）倍增時間率（實驗培養(yǎng)液/對照標準液）1501.00

2003.67

500—b22001.14

5001.213d2001.71

5004.00

a細胞用磷酸生理食鹽水沖洗兩次并在磷酸生理食鹽水中暴露于此藥劑20分鐘，然后再在調濕的介質加入之前用磷酸生理食鹽水洗兩次。

b經(jīng)過五天的時間，細胞數(shù)量有輕微的下降。在暴露于此藥劑12小時后，90%多的細胞滲透到錐蟲藍中。

c細胞暴露于在生長液中的此藥劑30分鐘，然后再在調濕的介質加入之前用磷酸生理食鹽水洗一次。

D細胞不斷地暴露于培養(yǎng)液中的次藥劑。

愛力諾力克鈣也會影響雞胚胎成纖維細胞在培養(yǎng)液中的生長速度．影響的程度依賴于藥劑的濃度和實驗條件。我們的結果表明當我們檢查愛力諾力克鈣的抗病毒效果的時候，必須十分小心，因為不僅很多酶有可能被抑制，而且培養(yǎng)液中的細胞自身有可能受到藥劑的影響，這取決于藥劑的濃度和實驗的原始記錄。

愛力諾力克鈣看來是一種低特量抑制劑。它看起來只和一定氨基酸的氨基發(fā)生反應，