蛋白質相互作用多種方法課件

蛋白質相互作用研究方法Proteininteraction：twoormoreproteins(sameordifferent)interactorformcomplex人類蛋白質組相用

有一些蛋白質可以以單體的形式發(fā)揮作用，但是大部分的蛋白質都是和伴侶分子或是與其他蛋白質一起發(fā)揮作用的。蛋白質相關知識及研究蛋白質相互作用的必要性運用生物信息學的方法由繁入簡實驗分析的方法由簡入繁整體系統(tǒng)部分單體酵母蛋白質相互作用聯(lián)絡圖人蛋白質相互作用聯(lián)絡圖研究蛋白質相互作用的目的是發(fā)現(xiàn)并明確其相互作用的生物學意義蛋白質相互作用是一種表象，通過表象分析規(guī)律，是研究蛋白質相互作用的核心“種瓜得瓜，種豆得豆”是一種表象，反映了遺傳這樣一種本質現(xiàn)象可研究對象合適的研究方法

研究蛋白質相互作用的意義1、蛋白質間的相互作用是細胞生命活動的基礎。2、基因只是決定蛋白質，而蛋白質才是發(fā)揮作用的主體。蛋白質的相互作用是發(fā)揮其功能的主要活動。研究蛋白質相互作用是為了研究相應的生物學功能確定研究目標尋找相互作用建立相互作用網(wǎng)絡和功能體系免疫共沉淀噬菌體展示技術酵母雙雜交技術基因外抑制子合成致死篩選分子生物學方法Pulldown試驗遺傳學方法蛋白質相互作用研究方法生物物理學方法串聯(lián)親和純化

免疫共沉淀

（co-immunoprecipitation，CO-IP）

當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質－蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內結合的蛋白質Y也可能沉淀下來。蛋白質Y的沉淀是基于與蛋白質X的物理性相互作用，稱為免疫共沉淀。

Westernblot：變性抗原，主要用于檢測蛋白質的存在與否。免疫共沉淀：非變性抗原，用于鑒定不同蛋白質間的相互作用。多采用非離子變性劑（NP40或TritonX-100)免疫共沉淀檢測蛋白質的原理和常見問題YABAYBY非特異性實驗過程實驗關鍵1、實驗最需要注意點就是抗體的性質。抗體不同和抗原結合能力也不同，特別是多抗的特異性是問題。2、為防止蛋白的分解、修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進行實驗。3、考慮抗體/緩沖液的比例?？贵w過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。主要用于：兩種感興趣蛋白質是否在體內存在相互作用；也用于鑒定一個特定蛋白質的未知相互作用蛋白。

注意：1要求在一系列清洗過程中保持蛋白質復合體不變。因為出現(xiàn)假陽性的概率比較高。

2設置的對照：在對照組中使用對照抗體，以缺失目的蛋白的細胞系作為陰性對照等等。優(yōu)點：1、相互作用的蛋白質都是經翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；2、蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響；3、可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。缺點：1、可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質－蛋白質相互作用；2、兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；3、如用westernblot檢驗，必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，若預測不正確，實驗就得不到結果，方法本身具有冒險性，靈敏度不如親和色譜高。靶蛋白X基因亞克隆到帶有GST基因的原核表達載體中，并在細菌中表達GST融合蛋白（GST-X）把GST融合蛋白(探針、誘餌蛋白)掛到帶有GST底物的Sepharosebeads上，然后把另一種含目的蛋白質（捕獲蛋白）的溶液加入其中。由于谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀GST融合蛋白，如發(fā)生相互作用則形成復合物：GST-X-Y，沉淀收集下來，洗脫非特異結合的蛋白后采用SDS鑒定與誘餌蛋白質相互作用的蛋白質。原理GST-Pulldown

Assay右：對照，中間翻轉混合時發(fā)生相互作用，膠上只與GST融合蛋白結合而不與GST結合的特異性條帶表示新的相互作用蛋白。GSTpulldownGSTFusionProteinPurificationbindingwashelution檢測GST融合蛋白與靶蛋白相互作用：1、放射性標記融合蛋白：快速簡單易行2、抗GST抗體檢測3、生物素標記融合蛋白：沒有放射性，但可能對探針蛋白和其他蛋白的相互作用有影響。應用：一確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間的新的相互作用；一是鑒定兩個已知蛋白質之間是否存在相互作用。特點：比較簡便，如果用抗GST抗體檢測或生物素標記融合蛋白避免了使用同位素等危險物質，在蛋白質相互作用研究中有很廣泛的應用。融合蛋白具有高通量性、高選擇性的特點，由于融合蛋白的多樣性以及表達系統(tǒng)的多樣性(如細菌、果蠅、哺乳動物)，該方法能夠研究蛋白質在復雜體系中的相互作用。

注意：該方法的成功應用取決于是否能夠得到足夠多，并且保持蛋白質活性的重組融合蛋白，且無過度降解（探針蛋白變成不同降解產物的混合物）和不溶，以及如何避免內源性誘餌蛋白的干擾。串聯(lián)親和純化（TAP）近年來質譜技術發(fā)展迅速，其功能強大且靈敏度高，常用來鑒定相互作用的蛋白質復合體或復合體亞基，但通常難以獲得足夠量純化的蛋白質復合體，成為質譜在這方面應用的一個限速步驟。1999年Rigaut（德國）等人共同提出了一套分離復合蛋白的新方法—串聯(lián)親和純化(Tandemaffinitypurification，TAP)，兼具標準親和純化（可以得到高純度地拷貝數(shù)的蛋白質復合體）和免疫共沉淀（用于特異性的標記蛋白與親和柱之間的相互作用）兩種生化方法的優(yōu)點，為蛋白質復合體的分離鑒定提供了一條新路徑。

適用：研究蛋白質復合體中多個蛋白質間的相互作用，特別適用于研究蛋白質在生理條件下的相互作用首先通過基因工程給被分離純化蛋白的一端加一個TAP標簽，該標簽由IgG結合結構域(ProtA)及一個鈣調蛋白結合多肽(CBP)組成，結構域與多肽之間由一個TEV蛋白酶切位點隔開。原理方法

1、基因重組將細胞內源性的目標蛋白基因置換為帶有TAP標簽的基因，溫和裂解細胞，獲取細胞抽提物。

2、將抽提物加入IgG親和柱，TAP標簽的ProtA端會與IgG形成強結合，在用洗脫液洗脫掉大部分非特異性結合物和雜蛋白。

實驗流程3、含有TEV蛋白酶的洗脫夜將蛋白質復合體切割下來。在鈣離子參與下，被切割下來帶有CBP的蛋白質復合體與鈣調蛋白緊密結合，充分洗脫，就可以進一步去除非特異作用的蛋白質雜質，最后純化出高純度的目的蛋白復合體。4、經過串聯(lián)親和純化的目的蛋白，通過SDS或者雙向電泳分離之后，找出與目的蛋白相互作用的蛋白質，采用質譜分析的方法對其進行分析鑒定。Mammalian

Tap-tag-LC-MS/MS

method

TAP優(yōu)點加工和修飾過的蛋白可以作誘餌，相互作用發(fā)生在天然環(huán)境和細胞部位，一次操作可以分離和分析多組分的復合物，得到廣泛應用，由于TAP標簽的高度特異性以及采用兩步洗脫純化法，在純化過程中不需要強烈沖洗，因此可以更好地保持較不穩(wěn)定的蛋白質復合物，而且非特異蛋白的量也會很低，這是一步純化法所不能比擬的?？朔穗p雜交篩選步驟復雜、假陽性結果較多、難于量化、不能滿足大規(guī)模蛋白質組研究需要的缺陷。TAP缺點更傾向于高豐度和穩(wěn)定的相互作用，許多低親和力、瞬時和依賴特殊細胞環(huán)境的相互作用可能檢測不到。另外，TAP必須采用能產生表達TAP標簽的蛋白，這種標簽蛋白的表達最好接近生理水平，所以最好將帶標簽的基因用天然啟動子表達。但在哺乳動物細胞中，天然啟動子表達標簽蛋白是非常困難的，其表達水平不同于無標簽的內源蛋白，由非生理水平的誘餌蛋白而產生假陽性。親和純化（affinitypurification

）純化：

抗體

Epitope-tag：flag,myc,HA,V5,GST…

核酸Pull-downImmunoprecipitationTAP(TandemAffinityPurification)

酵母雙雜交（Yeasttwo-hybrid

）

1989年Field等發(fā)明了酵母雙雜交系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用了酵母的生長轉錄因子GAL4含有的兩個結構域,DNA結合域(DNAbindingdomain,BD)及轉錄激活域(activationdomain,AD),將已知基因(誘餌基因)和靶基因或含有靶基因的cDNA分別構建在含BD及AD質粒載體上,將這兩種質粒共同轉化酵母感受態(tài)細胞,若BD結合的誘餌蛋白能夠與AD結合的靶蛋白或文庫中某些cDNA編碼的蛋白相互作用、彼此間結合時,則會導致位于側翼的BD與AD在空間上接近,呈現(xiàn)GAL4轉錄因子的完全活性,啟動下游的報告基因如His及LacZ等基因的表達,從而在特定的缺陷培養(yǎng)基上生長。一、酵母雙雜交系統(tǒng)基本原理典型的真核生長轉錄因子，如GAL4、GCN4、等都含有二個不同的結構域:DNA結合結構域(DNA-bindingdomain)和轉錄激活結構域(transcription-activatingdomain)。前者可識別DNA上的特異17bp長序列（UAS），并使轉錄激活結構域定位于所調節(jié)的基因的上游，轉錄激活結構域可同轉錄復合體的其他成分作用，啟動它所調節(jié)的基因的轉錄。His,β-galBD和AD功能上相互獨立又互相依賴，只有通過某種方式結合在一起才具有完整的轉錄因子活性據(jù)此可將兩個待測蛋白（X和Y）分別與這兩個結構域建成融合蛋白（BD-X和AD-Y），并共表達于同一個酵母細胞內，如果兩個待測蛋白間能相互作用，就會通過待測蛋白的橋梁作用使AD與BD形成一個完整的轉錄激活因子，并激活相應的報告基因表達。通過對報告基因的檢測就可很容易知道待測分子間是否發(fā)生了相互作用。進一步用已知蛋白X作為誘餌，分離獲得與之相互作用的蛋白質Y及其編碼序列。His,β-gal二、酵母雙雜交系統(tǒng)組成與BD融合的蛋白表達載體誘餌蛋白baitprotein與AD融合的蛋白表達載體靶蛋白preyprotein帶有多個報告基因的宿主菌株

HIS3、URA3、LacZ和LEU2等報告基因LacZreporter-Blue/WhiteScreeningHIS3reporter-ScreenonHis+media(usuallyneedtoadd3ATtoincreaseselectivity)LEU2reporter-ScreenonLeu+mediaADE2reporter-ScreenonAde+mediaURA3reporter-ScreenonUra+media(candonegativeselectionbyaddingFOA)

X-β-半乳糖苷酶藍白斑顯色分析舉例X-BD+Y-ADX-BD+gal4-ADGal4-BD+Y-ADgal4-BD+gal4-ADYeasttwo-hybrid（酵母雙雜交）應用

發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質

鑒定和分析已有的蛋白質間的相互作用

確定蛋白質間相互作用的功能基團lacZUASDBADlacZUASADDBlacZlacZUASADYDBXlacZ發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質BDB-PrMarker1AD基因庫Marker2lacZUASADYlacZDBB-prBDB-PrMarker1AD基因庫Marker2lacZUASADlacZDBB-prBDB-PrMarker1YAD基因庫Marker2文庫篩選的步驟1、將待測基因與Gal4或LexA或其他合適蛋白的DNA結合域融合構建誘餌質粒。2、將誘餌質粒轉化缺乏報告基因啟動子的酵母細胞株中，選擇被轉化的酵母。3、再將文庫質粒轉化到酵母中。4、通過報告基因的功能篩選相互作用的蛋白。確定蛋白質間相互作用的功能基團ProteinA1234BDB-PrMarker1AD1Marker2AD2Marker2AD3AD3白蘭白白鑒定和分析已有的蛋白質間的相互作用BDB-PrMarker1ADA-PrMarker2蘭：相互作用白：不相互作用序列分析

從酵母中分離質粒然后轉化E.coli從大腸桿菌中提取質粒并測序在數(shù)據(jù)庫中比對所測定序列與已知蛋白的同源性酵母雙雜交測序結果酵母雙雜交得到的陽性克隆子質粒經過DNA測序，由NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST檢索cDNA編碼的蛋白質舉例測序結果查詢過程cDNA序列NCBIBLASTNucleotidemegablastsearchformatresultsBlast舉例Results舉例優(yōu)點

1、快速獲得相互作用蛋白的基因2、只需單一步驟的質粒構建3、檢測在真核活細胞內進行,在一定程度上

代表細胞內的真實情況。4、作用信號是在融合基因表達后,在細胞內重建轉錄因子的作用而給出的,省去了純化蛋白質的繁瑣步驟5、檢測的結果可以是基因表達產物的積累效應,因而可檢測存在于蛋白質之間的微弱的或暫時的相互作用。6、酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細胞類型和分化時期材料構建cDNA文庫,能分析細胞漿、細胞核及膜結合蛋白等多種不同亞細胞部位及功能的蛋白。7、通過mRNA產生多種穩(wěn)定的酶使信號放大。同時,酵母表型,X—Gal及HIS3蛋白表達等檢測方法均很敏感局限性1、雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細胞核內，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等，這些反應在核內無法進行。另外有些蛋白的正確折疊和功能有賴于其他非酵母蛋白的輔助，這限制了某些細胞外蛋白和細胞膜受體蛋白等的研究。2、假陽性是酵母雙雜交系統(tǒng)的最