原核生物的基因表達(dá)與操作課件

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原核生物的基因表達(dá)與操作3.1原核生物的基因表達(dá)3.2有功能的啟動(dòng)子的分離3.3可調(diào)控強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)3.4原核生物表達(dá)產(chǎn)物的分離純化3原核生物的基因表達(dá)與操作3.1原核生物的基因表達(dá)1原核生物的基因表達(dá)與操作課件2目的基因載體體外重組重組子（雜合DNA）轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞篩選陽(yáng)性克隆大量擴(kuò)增，獲得子代DNA基因克隆的技術(shù)路線目的基因載體體外重組重組子（雜合DN3大腸桿菌表達(dá)體系大腸桿菌表達(dá)體系4大腸桿菌表達(dá)體系優(yōu)越性：1.對(duì)大腸桿菌的背景知識(shí)，特別是基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理有深刻的了解；2.是一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，擁有各類(lèi)適用的寄主菌株和不同類(lèi)型的載體；3.許多克隆的真核基因都可以在大腸桿菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效、高水平的表達(dá)；4.大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，易用于批量生產(chǎn)。大腸桿菌表達(dá)體系優(yōu)越性：1.對(duì)大腸桿菌的背景知識(shí)，特別是基5大腸桿菌中表達(dá)體系的不足：1.真核基因，在結(jié)構(gòu)上同原核基因之間存在著很大的差別。2.真核基因的轉(zhuǎn)錄信號(hào)同原核的不同。細(xì)菌的RNA聚合酶不能識(shí)別真核的啟動(dòng)子；外源基因可能含有具大腸桿菌轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)功能的核苷酸序列。3.真核基因mRNA的分子結(jié)構(gòu)同細(xì)菌的有所差異，影響真核基因mRNA穩(wěn)定性。大腸桿菌中表達(dá)體系的不足：1.真核基因，在結(jié)構(gòu)上同原核基因64.許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)譯后的加工修飾（正確折疊和組裝），而大多數(shù)的這類(lèi)修飾作用在細(xì)菌細(xì)胞中并不存在；5.細(xì)菌的蛋白酶，能夠識(shí)別外來(lái)的真核基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，并把它們降解掉。4.許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)過(guò)7大腸桿菌表達(dá)載體大腸桿菌表達(dá)載體8啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止子啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止子93.2有功能的啟動(dòng)子的分離一般程序：1.選用一種適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶，消化切割大腸桿菌的染色體DNA2.接著將切割產(chǎn)生的DNA限制片斷群體，同一種無(wú)啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體重組，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求使插入的片斷恰好緊鄰報(bào)告基因的上游位置3.隨后把此重組混合物轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主細(xì)胞，構(gòu)成質(zhì)粒載體基因文庫(kù)，并檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)活性。3.2有功能的啟動(dòng)子的分離一般程序：10報(bào)告基因（reportergene）：特指那些編碼產(chǎn)物可以被快速測(cè)定的功能核苷酸編碼單元（半乳糖苷酶基因、堿性磷酸酶基因、螢光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因等）。追蹤某種特定的DNA結(jié)構(gòu)（重組質(zhì)粒）是否已經(jīng)導(dǎo)入寄主細(xì)胞、抑或是器官和組織；也可用來(lái)同任何一種目的啟動(dòng)子連接，因此其表達(dá)活性可作為檢測(cè)啟動(dòng)子功能的依據(jù)。報(bào)告基因（reportergene）：特指那些編碼產(chǎn)物可以11用大腸桿菌質(zhì)粒pBR316篩選啟動(dòng)子用pK01篩選啟動(dòng)子分離有功能啟動(dòng)子的兩個(gè)實(shí)例：用大腸桿菌質(zhì)粒pBR316篩選啟動(dòng)子分離有功能啟動(dòng)子的兩個(gè)實(shí)12用大腸桿菌質(zhì)粒pBR316篩選啟動(dòng)子1.構(gòu)建質(zhì)粒pBRH3B和pBRH12.篩選啟動(dòng)子使用四環(huán)素（Tetr）作報(bào)告基因分離功能啟動(dòng)子用大腸桿菌質(zhì)粒pBR316篩選啟動(dòng)子1.構(gòu)建質(zhì)粒pBRH13用pK01篩選啟動(dòng)子使用galK（半乳糖激酶基因）作報(bào)告基因分離功能啟動(dòng)子能夠檢測(cè)啟動(dòng)子活性強(qiáng)弱的新型質(zhì)粒載體系統(tǒng)。來(lái)源于pBR322用pK01篩選啟動(dòng)子使用galK（半乳糖激酶基因）作報(bào)告基因14檢測(cè)啟動(dòng)子強(qiáng)弱的原理：半乳糖激酶能夠從ATP分子上轉(zhuǎn)移一個(gè)磷酸集團(tuán)給半乳糖分子，從而催化半乳糖發(fā)生磷酸化作用，形成半乳糖-1-磷酸。用同位素標(biāo)記ATP，測(cè)定從ATP轉(zhuǎn)移到半乳糖去的32P的放射性強(qiáng)度，可推算報(bào)告基因（galK）表達(dá)的半乳糖激酶的產(chǎn)量。檢測(cè)啟動(dòng)子強(qiáng)弱的原理：半乳糖激酶能夠從ATP分15分離功能的啟動(dòng)子將大腸桿菌基因組的酶切片斷，克隆在pOK1質(zhì)粒載體的單克隆位點(diǎn)上；將DNA重組分子，轉(zhuǎn)化給宿主細(xì)胞（GalE＋、GalT＋、GalK－），避免內(nèi)源半乳糖激酶的干擾；將它們涂布在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基（含有PH值指示劑的中性紅和結(jié)晶紫，檢測(cè)碳水化合物）上，篩選轉(zhuǎn)化子（重組子產(chǎn)生紅色的菌落）。分離功能的啟動(dòng)子將大腸桿菌基因組的酶切片斷，克隆在pOK1質(zhì)163.3可調(diào)控強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)3.3.1可調(diào)控的啟動(dòng)子3.3.2常用原核表達(dá)載體3.3.3提高蛋白的表達(dá)量3.3.6非融合蛋白的表達(dá)3.3.7融合蛋白的表達(dá)及純化3.3.9增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性3.3.10DNA整合入宿主染色體中3.3.11加強(qiáng)分泌內(nèi)容：3.3可調(diào)控強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)3.3.1可調(diào)控的啟17Lac(乳糖啟動(dòng)子)Trp(色氨酸啟動(dòng)子)Tac(乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子)PL(λ噬菌體的左向啟動(dòng)子)T7噬菌體啟動(dòng)子3.3.1可調(diào)控的啟動(dòng)子通過(guò)與阻遏蛋白的相互作用來(lái)控制基因的啟動(dòng)和停止Lac(乳糖啟動(dòng)子)3.3.1可調(diào)控的啟動(dòng)子通過(guò)與阻遏蛋18大腸桿菌的Lac啟動(dòng)子

來(lái)自大腸桿菌的乳糖操縱子由阻遏蛋白基因(LacI)、啟動(dòng)基因(P)、操縱基因(O)和編碼3個(gè)與乳糖利用有關(guān)的酶的結(jié)構(gòu)基因所組成受活化蛋白和cAMP的正調(diào)控，阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控受IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）、TMG（硫甲基半乳糖苷）、ONPG（鄰硝基苯基半乳糖苷）的誘導(dǎo)LacUV5啟動(dòng)子：Lac啟動(dòng)子的衍生物大腸桿菌的Lac啟動(dòng)子來(lái)自大腸桿菌的乳糖操縱子19大腸桿菌的trp啟動(dòng)子

來(lái)自大腸桿菌的色氨酸操縱子由啟動(dòng)子、衰減子、操縱基因及trpE的部分結(jié)構(gòu)基因組成受阻遏蛋白和衰減子的調(diào)控，阻遏蛋白前體必須與色氨酸結(jié)合才有活性3-β-吲哚丙烯酸（IAA）可競(jìng)爭(zhēng)性抑制色氨酸與阻遏蛋白的結(jié)合，提高轉(zhuǎn)錄活性。

大腸桿菌的trp啟動(dòng)子來(lái)自大腸桿菌的色氨酸操縱子20Tac啟動(dòng)子

是一組由Lac和trp啟動(dòng)子人工構(gòu)建的雜合啟動(dòng)子，其啟動(dòng)能力比Lac和trp都強(qiáng)；受Lac阻遏蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)，受IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）的誘導(dǎo)。Tac啟動(dòng)子是一組由Lac和trp啟動(dòng)子人工構(gòu)建的雜合啟動(dòng)21PL啟動(dòng)子

λ噬菌體的左向啟動(dòng)子PL來(lái)自λ噬菌體早期左向轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，活性比Trp啟動(dòng)子高約11倍；受控于溫度敏感的阻遏蛋白cI

。在低溫(28-30℃)時(shí)，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。在高溫(42℃)時(shí)，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。PL啟動(dòng)子λ噬菌體的左向啟動(dòng)子PL來(lái)自λ噬菌體早期左向轉(zhuǎn)錄223.3.2常用原核表達(dá)載體含Lac啟動(dòng)子的表達(dá)載體，如pOP203-13。含trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體，如pDR720。含tac啟動(dòng)子的表達(dá)載體，如pKK223-3。含PL啟動(dòng)子的表達(dá)載體，如pPL-λ。分泌蛋白表達(dá)載體3.3.2常用原核表達(dá)載體含Lac啟動(dòng)子的表達(dá)載體，如p23融合型表達(dá)載體：----融合蛋白非融合型表達(dá)載體：---天然完整蛋白分泌型表達(dá)載體：----產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙融合型表達(dá)載體：----融合蛋白243.3.3提高蛋白的表達(dá)量1、選擇合適載體，提高翻譯水平強(qiáng)啟動(dòng)子----提高轉(zhuǎn)錄水平核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ATG---SD）避免產(chǎn)物降解：分泌/融合表達(dá)細(xì)菌蛋白酶抑制劑3.3.3提高蛋白的表達(dá)量1、選擇合適載體，提高翻譯水平252、選擇合適宿主Lac啟動(dòng)子----LacI菌PL啟動(dòng)子--------cI857溶源菌

3、誘導(dǎo)表達(dá)溫度誘導(dǎo)------PLIPTG的化學(xué)誘導(dǎo)----Plac、Ptac4、提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，防止被宿主降解2、選擇合適宿主26若克隆的基因所用的密碼子為宿主罕見(jiàn)密碼子，可對(duì)外源基因進(jìn)行定點(diǎn)突變或?qū)λ拗骷?xì)菌進(jìn)行改造。若克隆的基因所用的密碼子為宿主罕見(jiàn)密碼子，可對(duì)外源基因進(jìn)行定273.3.6非融合蛋白的表達(dá)非融合蛋白：指所表達(dá)的外源蛋白的N端或C端不含任何其他氨基酸。所表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細(xì)菌多肽序列。

3.3.6非融合蛋白的表達(dá)非融合蛋白：指所表達(dá)的外源蛋白28PSDForeignDNA非融合型表達(dá)載體非融合基因非融合型蛋白表達(dá)PSDForeignDNA非融合型表達(dá)載體非融合基因非融合29非融合蛋白特點(diǎn)：1、表達(dá)時(shí)要求高：SD序列與ATG的距離要合適。即使改變2-3個(gè)堿基，表達(dá)效率也會(huì)大受影響。2、優(yōu)點(diǎn)：能夠較好地保持原來(lái)蛋白的活性。3、缺點(diǎn)：在宿主細(xì)胞內(nèi)容易被蛋白酶降解，蛋白產(chǎn)量低；分離純化費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本較高。非融合蛋白特點(diǎn)：30非融合蛋白抗宿主蛋白酶降解方法：1、選用Ion-（黃嘌呤核苷）營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主菌2、利用細(xì)菌蛋白酶抑制劑非融合蛋白抗宿主蛋白酶降解方法：1、選用Ion-（黃嘌呤核苷31融合蛋白：是指蛋白質(zhì)的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列編碼，C端由真核DNA的完整序列編碼。這樣的蛋白質(zhì)有一段短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真核蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，故稱(chēng)為融合蛋白。

3.3.7融合蛋白的表達(dá)及純化融合蛋白：是指蛋白質(zhì)的N末端由原核DNA3.3.7融合蛋32融合型蛋白表達(dá)PSDForeignDNA融合型表達(dá)載體融合基因融合型蛋白表達(dá)PSDForeignDNA融合型表達(dá)載體融33融合蛋白的表達(dá)及純化1、構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體：在外源蛋白的N或C端加標(biāo)記物（如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記物、6×組氨酸標(biāo)記物、Flag或HA肽段標(biāo)記物、CBP標(biāo)記物等）；在標(biāo)記物和外源蛋白之間插入一段可被蛋白酶識(shí)別的氨基酸序列。2、轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞并誘導(dǎo)表達(dá)3、裂解細(xì)胞，親和柱層析分離融合蛋白4、切割融合蛋白獲得目的蛋白主要步驟：融合蛋白的表達(dá)及純化1、構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體：在外源蛋白的N34例：谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記物例：谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記物35融合蛋白質(zhì)的純化的基本原理：利用與融合蛋白質(zhì)配偶體相對(duì)應(yīng)的配體作為吸附劑，制備親和層析柱，通過(guò)配偶體與配體之間的相互作用，過(guò)柱的融合蛋白質(zhì)被滯留下來(lái)，其它蛋白質(zhì)則流出柱外，經(jīng)洗脫處理，便可回收到純化的融合蛋白質(zhì)。融合蛋白質(zhì)的純化的基本原理：利用與融合蛋白質(zhì)配偶36融合蛋白質(zhì)中目的蛋白的純化1.溴化氰（CNBr）切割法：能特異性的從甲硫氨酸殘基處切割多肽鏈。如胰島素的制備。2.胰蛋白酶切割法：能從精氨酸或是賴(lài)氨酸殘基羧基一側(cè)進(jìn)行特異性的切割。3.凝血因子X(jué)a切割法：能唯一地從特異識(shí)別序列C－末端切割多肽融合蛋白質(zhì)中目的蛋白的純化1.溴化氰（CNBr）切割法：373.3.9增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性3.3.10DNA整合入宿主染色體中3.3.9增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性383.3.11加強(qiáng)分泌外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)部位:1.細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)2.周質(zhì)中表達(dá)3.胞外表達(dá)3.3.11加強(qiáng)分泌外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)部位391、細(xì)胞質(zhì)中表達(dá):外源基因在大腸桿菌寄主細(xì)胞質(zhì)中高效表達(dá)時(shí)，常會(huì)發(fā)生一種特殊的生理現(xiàn)象，形成包含體。包含體：存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種由不可溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。影響其形成的關(guān)鍵因素：電荷的平均數(shù)、形成轉(zhuǎn)角的氨基酸殘基組分1、細(xì)胞質(zhì)中表達(dá):外源基因在大腸桿菌寄主細(xì)胞質(zhì)中高效表達(dá)時(shí)，40優(yōu)點(diǎn)：1.形成包含體a.蛋白質(zhì)易于以高純度和高濃度方式分離b.蛋白質(zhì)受保護(hù)而免受胞內(nèi)酶的降解作用c.蛋白質(zhì)沒(méi)有活性，因此不會(huì)使寄主細(xì)胞受傷害優(yōu)點(diǎn)：1.形成包含體412.蛋白質(zhì)的產(chǎn)量高二硫鍵的斷裂以及轉(zhuǎn)譯修飾作用的喪失，會(huì)導(dǎo)致外源片斷編碼的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中超量表達(dá)。3.表達(dá)的質(zhì)粒載體構(gòu)建比較簡(jiǎn)單。2.蛋白質(zhì)的產(chǎn)量高42缺點(diǎn)：1.包含體a.蛋白質(zhì)折疊了，再折疊的蛋白質(zhì)可能無(wú)法恢復(fù)其生物學(xué)活性b.蛋白質(zhì)的終產(chǎn)量偏低c.蛋白質(zhì)的生產(chǎn)成本比較昂貴2.還原的環(huán)境不利于二硫鍵的形成（硫氧還蛋白系統(tǒng)、谷氧還蛋白系統(tǒng)）缺點(diǎn)：1.包含體433.蛋白質(zhì)會(huì)被酶解4.蛋白質(zhì)種類(lèi)多，因此純化比較復(fù)雜原核生物的基因表達(dá)與操作課件442、周質(zhì)中表達(dá)周質(zhì)：在大腸桿菌一類(lèi)格蘭氏陰性菌中，位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。在周質(zhì)中表達(dá)的蛋白，需要信號(hào)肽序列才能從細(xì)胞質(zhì)中穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜進(jìn)入周質(zhì)。2、周質(zhì)中表達(dá)周質(zhì)：在大腸桿菌一類(lèi)格蘭氏陰性菌45優(yōu)點(diǎn)：1.由于周質(zhì)中蛋白質(zhì)種類(lèi)比較少，因此目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化就比較簡(jiǎn)單2.蛋白質(zhì)酶解的程度不甚嚴(yán)重3.促進(jìn)了二硫鍵的形成及蛋白質(zhì)的折疊作用（氧化環(huán)境）在正確折疊的蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，在體內(nèi)對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行切割優(yōu)點(diǎn)：46缺點(diǎn)：1.信號(hào)肽并非總是有助于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)2.有可能形成包含體缺點(diǎn)：473、胞外表達(dá)使克隆在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)，分泌到胞外培養(yǎng)基中進(jìn)行分離純化。3、胞外表達(dá)使克隆在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)，分泌到胞48途徑：1.用大腸桿菌細(xì)胞固有的途徑，使真正屬于分泌型的蛋白質(zhì)直接分泌到胞外培養(yǎng)基中。（不是特別有效的程序）2.誘導(dǎo)大腸桿菌細(xì)胞的外膜發(fā)生有限的滲漏，導(dǎo)致胞內(nèi)的蛋白質(zhì)向胞外培養(yǎng)基方向分泌。（可以分離到中等產(chǎn)量的蛋白質(zhì)）途徑：49優(yōu)點(diǎn)：1.蛋白質(zhì)的酶解作用程度低2.由于分泌到胞外的蛋白質(zhì)種類(lèi)少，因此目標(biāo)蛋白容易純化3.增進(jìn)了蛋白質(zhì)的折疊作用

優(yōu)點(diǎn)：50缺點(diǎn)：1.在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源真核蛋白質(zhì)，通常是不會(huì)分泌到胞外培養(yǎng)基中去的2.由于分泌在胞外培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)相當(dāng)稀釋?zhuān)虼四繕?biāo)蛋白質(zhì)的純化過(guò)程比較復(fù)雜缺點(diǎn)：513.4原核生物表達(dá)產(chǎn)物的分離純化包含體蛋白的提取蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)的純化蛋白質(zhì)的PEG化蛋白質(zhì)的質(zhì)量檢測(cè)3.4原核生物表達(dá)產(chǎn)物的分離純化包含體蛋白的提取蛋白質(zhì)的521、包含體蛋白的提取細(xì)菌的收獲包含體的洗滌破碎離心包含體蛋白的變性（溶解）蛋白質(zhì)的復(fù)性及純化（0.1%以下的中性去污劑，如Tween20）（變性劑：尿素、鹽酸胍提高PH、溫度及離子強(qiáng)度）（超聲破碎、機(jī)械破碎、化學(xué)方法破碎）（5000-10000g）1、包含體蛋白的提取細(xì)菌的收獲包含體的洗滌破碎離心包含體蛋白532、蛋白質(zhì)的復(fù)性通過(guò)緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時(shí)去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時(shí)復(fù)性過(guò)程開(kāi)始，到2M左右時(shí)結(jié)束。對(duì)于鹽酸胍而言，可以從4M開(kāi)始，到1.5M

時(shí)復(fù)性過(guò)程已經(jīng)結(jié)束。

復(fù)性中常采用的方法：稀釋復(fù)性、透析復(fù)性、超濾復(fù)性、柱上復(fù)性等。2、蛋白質(zhì)的復(fù)性通過(guò)緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變543、蛋白質(zhì)的純化層析類(lèi)型離子交換層析親和層析疏水作用層析反相作用層析凝膠排阻層析經(jīng)向?qū)游龇蛛x技術(shù)3、蛋白質(zhì)的純化層析類(lèi)型離子交換層析親和層析疏水作用層析反相554、蛋白質(zhì)的PEG化聚已二醇（polyethyleneglycol，PEG）是一種不帶電的線性親水分子，它可以與蛋白質(zhì)的非必需基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，形成空間構(gòu)象上的屏障，從而避免外源蛋白的抗原決定簇誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體；甚至可以阻止抗體與之結(jié)合。在蛋白質(zhì)的PEG化過(guò)程中，最關(guān)鍵的問(wèn)題是確定最佳修飾程度和選用合適相對(duì)分子質(zhì)量的PEG。4、蛋白質(zhì)的PEG化聚已二醇（polyethyleneg563.4.5原核表達(dá)蛋白的質(zhì)量控制3.4.5原核表達(dá)蛋白的質(zhì)量控制57樹(shù)立質(zhì)量法制觀念、提高全員質(zhì)量意識(shí)。12月-2212月-22Wednesday,December21,2022人生得意須盡歡，莫使金樽空對(duì)月。12:31:0312:31:0312:3112/21/202212:31:03PM安全象只弓，不拉它就松，要想保安全，常把弓弦繃。12月-2212:31:0312:31Dec-2221-Dec-22加強(qiáng)交通建設(shè)管理，確保工程建設(shè)質(zhì)量。12:31:0312:31:0312:31Wednesday,December21,2022安全在于心細(xì)，事故出在麻痹。12月-2212月-2212:31:0312:31:03December21,2022踏實(shí)肯干，努力奮斗。2022年12月21日12:31下午12月-2212月-22追求至善憑技術(shù)開(kāi)拓市場(chǎng)，憑管理增創(chuàng)效益，憑服務(wù)樹(shù)立形象。21十二月202212:31:03下午12:31:0312月-22嚴(yán)格把控質(zhì)量關(guān)，讓生產(chǎn)更加有保障。十二月2212:31下午12月-2212:31December21,2022作業(yè)標(biāo)準(zhǔn)記得牢，駕輕就熟除煩惱。2022/12/2112:31:0312:31:0321December2022好的事情馬上就會(huì)到來(lái)，一切都是最好的安排。12:31:03下午12:31下午12:31:0312月-22一馬當(dāng)先，全員舉績(jī)，梅開(kāi)二度，業(yè)績(jī)保底。12月-2212月-2212:3112:31:0312:31:03Dec-22牢記安全之責(zé)，善謀安全之策，力務(wù)安全之實(shí)。2022/12/2112:31:03Wednesday,December21,2022相信相信得力量。12月-222022/12/2112:31:0312月-22謝謝大家！樹(shù)立質(zhì)量法制觀念、提高全員質(zhì)量意識(shí)。12月-2212月-22583

原核生物的基因表達(dá)與操作3.1原核生物的基因表達(dá)3.2有功能的啟動(dòng)子的分離3.3可調(diào)控強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)3.4原核生物表達(dá)產(chǎn)物的分離純化3原核生物的基因表達(dá)與操作3.1原核生物的基因表達(dá)59原核生物的基因表達(dá)與操作課件60目的基因載體體外重組重組子（雜合DNA）轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞篩選陽(yáng)性克隆大量擴(kuò)增，獲得子代DNA基因克隆的技術(shù)路線目的基因載體體外重組重組子（雜合DN61大腸桿菌表達(dá)體系大腸桿菌表達(dá)體系62大腸桿菌表達(dá)體系優(yōu)越性：1.對(duì)大腸桿菌的背景知識(shí)，特別是基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理有深刻的了解；2.是一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，擁有各類(lèi)適用的寄主菌株和不同類(lèi)型的載體；3.許多克隆的真核基因都可以在大腸桿菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效、高水平的表達(dá)；4.大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，易用于批量生產(chǎn)。大腸桿菌表達(dá)體系優(yōu)越性：1.對(duì)大腸桿菌的背景知識(shí)，特別是基63大腸桿菌中表達(dá)體系的不足：1.真核基因，在結(jié)構(gòu)上同原核基因之間存在著很大的差別。2.真核基因的轉(zhuǎn)錄信號(hào)同原核的不同。細(xì)菌的RNA聚合酶不能識(shí)別真核的啟動(dòng)子；外源基因可能含有具大腸桿菌轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)功能的核苷酸序列。3.真核基因mRNA的分子結(jié)構(gòu)同細(xì)菌的有所差異，影響真核基因mRNA穩(wěn)定性。大腸桿菌中表達(dá)體系的不足：1.真核基因，在結(jié)構(gòu)上同原核基因644.許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)譯后的加工修飾（正確折疊和組裝），而大多數(shù)的這類(lèi)修飾作用在細(xì)菌細(xì)胞中并不存在；5.細(xì)菌的蛋白酶，能夠識(shí)別外來(lái)的真核基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，并把它們降解掉。4.許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)過(guò)65大腸桿菌表達(dá)載體大腸桿菌表達(dá)載體66啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止子啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止子673.2有功能的啟動(dòng)子的分離一般程序：1.選用一種適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶，消化切割大腸桿菌的染色體DNA2.接著將切割產(chǎn)生的DNA限制片斷群體，同一種無(wú)啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體重組，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求使插入的片斷恰好緊鄰報(bào)告基因的上游位置3.隨后把此重組混合物轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主細(xì)胞，構(gòu)成質(zhì)粒載體基因文庫(kù)，并檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)活性。3.2有功能的啟動(dòng)子的分離一般程序：68報(bào)告基因（reportergene）：特指那些編碼產(chǎn)物可以被快速測(cè)定的功能核苷酸編碼單元（半乳糖苷酶基因、堿性磷酸酶基因、螢光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因等）。追蹤某種特定的DNA結(jié)構(gòu)（重組質(zhì)粒）是否已經(jīng)導(dǎo)入寄主細(xì)胞、抑或是器官和組織；也可用來(lái)同任何一種目的啟動(dòng)子連接，因此其表達(dá)活性可作為檢測(cè)啟動(dòng)子功能的依據(jù)。報(bào)告基因（reportergene）：特指那些編碼產(chǎn)物可以69用大腸桿菌質(zhì)粒pBR316篩選啟動(dòng)子用pK01篩選啟動(dòng)子分離有功能啟動(dòng)子的兩個(gè)實(shí)例：用大腸桿菌質(zhì)粒pBR316篩選啟動(dòng)子分離有功能啟動(dòng)子的兩個(gè)實(shí)70用大腸桿菌質(zhì)粒pBR316篩選啟動(dòng)子1.構(gòu)建質(zhì)粒pBRH3B和pBRH12.篩選啟動(dòng)子使用四環(huán)素（Tetr）作報(bào)告基因分離功能啟動(dòng)子用大腸桿菌質(zhì)粒pBR316篩選啟動(dòng)子1.構(gòu)建質(zhì)粒pBRH71用pK01篩選啟動(dòng)子使用galK（半乳糖激酶基因）作報(bào)告基因分離功能啟動(dòng)子能夠檢測(cè)啟動(dòng)子活性強(qiáng)弱的新型質(zhì)粒載體系統(tǒng)。來(lái)源于pBR322用pK01篩選啟動(dòng)子使用galK（半乳糖激酶基因）作報(bào)告基因72檢測(cè)啟動(dòng)子強(qiáng)弱的原理：半乳糖激酶能夠從ATP分子上轉(zhuǎn)移一個(gè)磷酸集團(tuán)給半乳糖分子，從而催化半乳糖發(fā)生磷酸化作用，形成半乳糖-1-磷酸。用同位素標(biāo)記ATP，測(cè)定從ATP轉(zhuǎn)移到半乳糖去的32P的放射性強(qiáng)度，可推算報(bào)告基因（galK）表達(dá)的半乳糖激酶的產(chǎn)量。檢測(cè)啟動(dòng)子強(qiáng)弱的原理：半乳糖激酶能夠從ATP分73分離功能的啟動(dòng)子將大腸桿菌基因組的酶切片斷，克隆在pOK1質(zhì)粒載體的單克隆位點(diǎn)上；將DNA重組分子，轉(zhuǎn)化給宿主細(xì)胞（GalE＋、GalT＋、GalK－），避免內(nèi)源半乳糖激酶的干擾；將它們涂布在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基（含有PH值指示劑的中性紅和結(jié)晶紫，檢測(cè)碳水化合物）上，篩選轉(zhuǎn)化子（重組子產(chǎn)生紅色的菌落）。分離功能的啟動(dòng)子將大腸桿菌基因組的酶切片斷，克隆在pOK1質(zhì)743.3可調(diào)控強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)3.3.1可調(diào)控的啟動(dòng)子3.3.2常用原核表達(dá)載體3.3.3提高蛋白的表達(dá)量3.3.6非融合蛋白的表達(dá)3.3.7融合蛋白的表達(dá)及純化3.3.9增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性3.3.10DNA整合入宿主染色體中3.3.11加強(qiáng)分泌內(nèi)容：3.3可調(diào)控強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)3.3.1可調(diào)控的啟75Lac(乳糖啟動(dòng)子)Trp(色氨酸啟動(dòng)子)Tac(乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子)PL(λ噬菌體的左向啟動(dòng)子)T7噬菌體啟動(dòng)子3.3.1可調(diào)控的啟動(dòng)子通過(guò)與阻遏蛋白的相互作用來(lái)控制基因的啟動(dòng)和停止Lac(乳糖啟動(dòng)子)3.3.1可調(diào)控的啟動(dòng)子通過(guò)與阻遏蛋76大腸桿菌的Lac啟動(dòng)子

來(lái)自大腸桿菌的乳糖操縱子由阻遏蛋白基因(LacI)、啟動(dòng)基因(P)、操縱基因(O)和編碼3個(gè)與乳糖利用有關(guān)的酶的結(jié)構(gòu)基因所組成受活化蛋白和cAMP的正調(diào)控，阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控受IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）、TMG（硫甲基半乳糖苷）、ONPG（鄰硝基苯基半乳糖苷）的誘導(dǎo)LacUV5啟動(dòng)子：Lac啟動(dòng)子的衍生物大腸桿菌的Lac啟動(dòng)子來(lái)自大腸桿菌的乳糖操縱子77大腸桿菌的trp啟動(dòng)子

來(lái)自大腸桿菌的色氨酸操縱子由啟動(dòng)子、衰減子、操縱基因及trpE的部分結(jié)構(gòu)基因組成受阻遏蛋白和衰減子的調(diào)控，阻遏蛋白前體必須與色氨酸結(jié)合才有活性3-β-吲哚丙烯酸（IAA）可競(jìng)爭(zhēng)性抑制色氨酸與阻遏蛋白的結(jié)合，提高轉(zhuǎn)錄活性。

大腸桿菌的trp啟動(dòng)子來(lái)自大腸桿菌的色氨酸操縱子78Tac啟動(dòng)子

是一組由Lac和trp啟動(dòng)子人工構(gòu)建的雜合啟動(dòng)子，其啟動(dòng)能力比Lac和trp都強(qiáng)；受Lac阻遏蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)，受IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）的誘導(dǎo)。Tac啟動(dòng)子是一組由Lac和trp啟動(dòng)子人工構(gòu)建的雜合啟動(dòng)79PL啟動(dòng)子

λ噬菌體的左向啟動(dòng)子PL來(lái)自λ噬菌體早期左向轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，活性比Trp啟動(dòng)子高約11倍；受控于溫度敏感的阻遏蛋白cI

。在低溫(28-30℃)時(shí)，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。在高溫(42℃)時(shí)，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。PL啟動(dòng)子λ噬菌體的左向啟動(dòng)子PL來(lái)自λ噬菌體早期左向轉(zhuǎn)錄803.3.2常用原核表達(dá)載體含Lac啟動(dòng)子的表達(dá)載體，如pOP203-13。含trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體，如pDR720。含tac啟動(dòng)子的表達(dá)載體，如pKK223-3。含PL啟動(dòng)子的表達(dá)載體，如pPL-λ。分泌蛋白表達(dá)載體3.3.2常用原核表達(dá)載體含Lac啟動(dòng)子的表達(dá)載體，如p81融合型表達(dá)載體：----融合蛋白非融合型表達(dá)載體：---天然完整蛋白分泌型表達(dá)載體：----產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙融合型表達(dá)載體：----融合蛋白823.3.3提高蛋白的表達(dá)量1、選擇合適載體，提高翻譯水平強(qiáng)啟動(dòng)子----提高轉(zhuǎn)錄水平核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ATG---SD）避免產(chǎn)物降解：分泌/融合表達(dá)細(xì)菌蛋白酶抑制劑3.3.3提高蛋白的表達(dá)量1、選擇合適載體，提高翻譯水平832、選擇合適宿主Lac啟動(dòng)子----LacI菌PL啟動(dòng)子--------cI857溶源菌

3、誘導(dǎo)表達(dá)溫度誘導(dǎo)------PLIPTG的化學(xué)誘導(dǎo)----Plac、Ptac4、提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，防止被宿主降解2、選擇合適宿主84若克隆的基因所用的密碼子為宿主罕見(jiàn)密碼子，可對(duì)外源基因進(jìn)行定點(diǎn)突變或?qū)λ拗骷?xì)菌進(jìn)行改造。若克隆的基因所用的密碼子為宿主罕見(jiàn)密碼子，可對(duì)外源基因進(jìn)行定853.3.6非融合蛋白的表達(dá)非融合蛋白：指所表達(dá)的外源蛋白的N端或C端不含任何其他氨基酸。所表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細(xì)菌多肽序列。

3.3.6非融合蛋白的表達(dá)非融合蛋白：指所表達(dá)的外源蛋白86PSDForeignDNA非融合型表達(dá)載體非融合基因非融合型蛋白表達(dá)PSDForeignDNA非融合型表達(dá)載體非融合基因非融合87非融合蛋白特點(diǎn)：1、表達(dá)時(shí)要求高：SD序列與ATG的距離要合適。即使改變2-3個(gè)堿基，表達(dá)效率也會(huì)大受影響。2、優(yōu)點(diǎn)：能夠較好地保持原來(lái)蛋白的活性。3、缺點(diǎn)：在宿主細(xì)胞內(nèi)容易被蛋白酶降解，蛋白產(chǎn)量低；分離純化費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本較高。非融合蛋白特點(diǎn)：88非融合蛋白抗宿主蛋白酶降解方法：1、選用Ion-（黃嘌呤核苷）營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主菌2、利用細(xì)菌蛋白酶抑制劑非融合蛋白抗宿主蛋白酶降解方法：1、選用Ion-（黃嘌呤核苷89融合蛋白：是指蛋白質(zhì)的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列編碼，C端由真核DNA的完整序列編碼。這樣的蛋白質(zhì)有一段短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真核蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，故稱(chēng)為融合蛋白。

3.3.7融合蛋白的表達(dá)及純化融合蛋白：是指蛋白質(zhì)的N末端由原核DNA3.3.7融合蛋90融合型蛋白表達(dá)PSDForeignDNA融合型表達(dá)載體融合基因融合型蛋白表達(dá)PSDForeignDNA融合型表達(dá)載體融91融合蛋白的表達(dá)及純化1、構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體：在外源蛋白的N或C端加標(biāo)記物（如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記物、6×組氨酸標(biāo)記物、Flag或HA肽段標(biāo)記物、CBP標(biāo)記物等）；在標(biāo)記物和外源蛋白之間插入一段可被蛋白酶識(shí)別的氨基酸序列。2、轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞并誘導(dǎo)表達(dá)3、裂解細(xì)胞，親和柱層析分離融合蛋白4、切割融合蛋白獲得目的蛋白主要步驟：融合蛋白的表達(dá)及純化1、構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體：在外源蛋白的N92例：谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記物例：谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記物93融合蛋白質(zhì)的純化的基本原理：利用與融合蛋白質(zhì)配偶體相對(duì)應(yīng)的配體作為吸附劑，制備親和層析柱，通過(guò)配偶體與配體之間的相互作用，過(guò)柱的融合蛋白質(zhì)被滯留下來(lái)，其它蛋白質(zhì)則流出柱外，經(jīng)洗脫處理，便可回收到純化的融合蛋白質(zhì)。融合蛋白質(zhì)的純化的基本原理：利用與融合蛋白質(zhì)配偶94融合蛋白質(zhì)中目的蛋白的純化1.溴化氰（CNBr）切割法：能特異性的從甲硫氨酸殘基處切割多肽鏈。如胰島素的制備。2.胰蛋白酶切割法：能從精氨酸或是賴(lài)氨酸殘基羧基一側(cè)進(jìn)行特異性的切割。3.凝血因子X(jué)a切割法：能唯一地從特異識(shí)別序列C－末端切割多肽融合蛋白質(zhì)中目的蛋白的純化1.溴化氰（CNBr）切割法：953.3.9增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性3.3.10DNA整合入宿主染色體中3.3.9增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性963.3.11加強(qiáng)分泌外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)部位:1.細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)2.周質(zhì)中表達(dá)3.胞外表達(dá)3.3.11加強(qiáng)分泌外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)部位971、細(xì)胞質(zhì)中表達(dá):外源基因在大腸桿菌寄主細(xì)胞質(zhì)中高效表達(dá)時(shí)，常會(huì)發(fā)生一種特殊的生理現(xiàn)象，形成包含體。包含體：存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種由不可溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。影響其形成的關(guān)鍵因素：電荷的平均數(shù)、形成轉(zhuǎn)角的氨基酸殘基組分1、細(xì)胞質(zhì)中表達(dá):外源基因在大腸桿菌寄主細(xì)胞質(zhì)中高效表達(dá)時(shí)，98優(yōu)點(diǎn)：1.形成包含體a.蛋白質(zhì)易于以高純度和高濃度方式分離b.蛋白質(zhì)受保護(hù)而免受胞內(nèi)酶的降解作用c.蛋白質(zhì)沒(méi)有活性，因此不會(huì)使寄主細(xì)胞受傷害優(yōu)點(diǎn)：1.形成包含體992.蛋白質(zhì)的產(chǎn)量高二硫鍵的斷裂以及轉(zhuǎn)譯修飾作用的喪失，會(huì)導(dǎo)致外源片斷編碼的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中超量表達(dá)。3.表達(dá)的質(zhì)粒載體構(gòu)建比較簡(jiǎn)單。2.蛋白質(zhì)的產(chǎn)量高100缺點(diǎn)：1.包含體a.蛋白質(zhì)折疊了，再折疊的蛋白質(zhì)可能無(wú)法恢復(fù)其生物學(xué)活性b.蛋白質(zhì)的終產(chǎn)量偏低c.蛋白質(zhì)的生產(chǎn)成本比較昂貴2.還原的環(huán)境不利于二硫鍵的形成（硫氧還蛋白系統(tǒng)、谷氧還蛋白系統(tǒng)）缺點(diǎn)：1.包含體1013.蛋白質(zhì)會(huì)被酶解4.蛋白質(zhì)種類(lèi)多，因此純化比較復(fù)雜原核生物的基因表達(dá)與操作課件1022、周質(zhì)中表達(dá)周質(zhì)：在大腸桿菌一類(lèi)格蘭氏陰性菌中，位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。在周質(zhì)中表達(dá)的蛋白，需要信號(hào)肽序列才能從細(xì)胞質(zhì)中穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜進(jìn)入周質(zhì)。2、周質(zhì)中表達(dá)周質(zhì)：在大腸桿菌一類(lèi)格蘭氏陰性菌103優(yōu)點(diǎn)：1.由于周質(zhì)中蛋白質(zhì)種類(lèi)比較少，因此目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化就比較簡(jiǎn)單2.蛋白質(zhì)酶解的程度不甚嚴(yán)重3.促進(jìn)了二硫鍵的形成及蛋白質(zhì)的折疊作用（氧化環(huán)境）在正確折疊的蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，在體內(nèi)對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行切割優(yōu)點(diǎn)：104缺點(diǎn)：1.信號(hào)肽并非總是有助于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)2.有可能形成包含體缺點(diǎn)：1053、胞外表達(dá)使克隆在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)，分泌到胞外培養(yǎng)基中進(jìn)行分離純化。3、胞外表達(dá)使克隆在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)，分泌到胞106途徑：1.用大腸桿菌細(xì)胞固有的途徑，使真正屬于分泌型的蛋白質(zhì)直接分泌到胞外培養(yǎng)基中。（不是特別有效的程序）2.誘導(dǎo)大腸桿菌細(xì)胞的外膜發(fā)生有限的滲漏，導(dǎo)致胞內(nèi)的蛋白質(zhì)向胞外培養(yǎng)基方向分泌。（可以分離到中等產(chǎn)量的蛋白質(zhì)）途徑：107優(yōu)點(diǎn)：1.蛋白質(zhì)的酶解作用程度低2.由于分泌到胞外的蛋白質(zhì)種類(lèi)少，因此目標(biāo)蛋白容易純化3.增進(jìn)了蛋白質(zhì)的折疊作用

優(yōu)點(diǎn)：108缺點(diǎn)：1.在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源真核蛋白質(zhì)，通常是不會(huì)分泌到胞外培養(yǎng)基中去的2.由于分泌在胞外培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)相當(dāng)稀釋?zhuān)虼四繕?biāo)蛋白質(zhì)的純化過(guò)程比較復(fù)雜缺點(diǎn)：1093.4原核生物表達(dá)產(chǎn)物的分離純化包含體蛋白的提取蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)的純化蛋白質(zhì)的PEG化蛋白