WB過程中常見問題及處理方法課件

WB過程中的常見問題及處理方法WB的簡介WB即蛋白質(zhì)印跡法（WesternBlot）。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。

基本原理通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色，分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。三、WB的影響因素步驟較多，任何一步都可能影響結(jié)果1、電泳分離蛋白蛋白抽提；蛋白定量；樣品制備變性；上樣量；電泳（電壓、電流的大小，膠濃度、制膠）3、封閉封閉液的選擇；封閉條件優(yōu)化；……5、抗體孵育抗體及稀釋液選擇；抗體稀釋倍數(shù)優(yōu)化；抗體孵育時間；……四、注意事項(xiàng)1.蛋白樣品的提取盡可能新鮮組織或蛋白避免反復(fù)凍融對于有些蛋白，加去磷酸化的（NaF）盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子（通過加入核酸酶或采取不同提取策略）

選擇合適的裂解液準(zhǔn)確定量（BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白）

2、制膠根據(jù)不同的蛋白大小，選擇不同的濃度制膠。制膠的時候一定要注意玻璃板一定要干凈，不能有殘留的膠。玻璃板底部放平，盡量不能漏膠灌膠的時候，不能太快，容易產(chǎn)生旋窩水或異丙醇壓的時候，不能太久

3、轉(zhuǎn)膜a泡膜：轉(zhuǎn)膜之前將海綿、膠、膜都用預(yù)冷的轉(zhuǎn)移液浸泡20min；

凝膠若是沒在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜buffer中浸泡，就會在轉(zhuǎn)膜過程中出現(xiàn)凝膠皺縮，導(dǎo)致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移條帶變形bPVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡，活化g夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在，否則會導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不完全h保證膜和濾紙的大小和凝膠完全一樣，過大和過小都會影響轉(zhuǎn)膜效率i一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景4、封閉a脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標(biāo)記的抗體一起使用，因?yàn)槊撝谭酆刑堑鞍缀蜕锼豣如果封閉劑中含磷酸酶，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白受到影響，因?yàn)榱姿崦概c印記膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化c檢測磷酸化抗體時，不能使用酪蛋白/脫脂奶粉作為封閉劑五、常見問題及解決電泳中的問題︶條帶呈笑臉狀——凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好;——電泳系統(tǒng)溫度偏高︵條帶呈皺眉狀

可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全紋理（縱向條紋）樣品中含有不溶性顆粒條帶偏斜電極不平衡或者加樣位置偏斜條帶兩邊擴(kuò)散加樣量過多4、二抗非特異性結(jié)合或與封閉劑交叉反應(yīng)——設(shè)置二抗對照(不加一抗),降低二抗?jié)舛?、洗膜不充分——增加洗滌次數(shù)，增加洗膜次數(shù)沒有陽性條帶或很弱1、一抗、二抗等不匹配訂購試劑時認(rèn)真選取一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間相匹配的抗體及底物。可通過設(shè)置內(nèi)參可以驗(yàn)證二級測系統(tǒng)的有效性更換更好的一抗二抗2、一抗或/和二抗?jié)舛鹊驮黾涌贵w濃度；長孵育時間；3、封閉劑與一抗或二抗有交叉反應(yīng)封閉時使用溫和的去污劑，如TWEEN20更換封閉劑（常用的脫脂奶、BSA、血清或明膠）4、樣本中無靶蛋白或靶蛋白含量過設(shè)置陽性對照，如果陽性對照有結(jié)果，但標(biāo)本沒有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加標(biāo)本上樣量至少每孔20-30ug蛋白,樣本制備時使用蛋白酶抑制劑,或分級提取目5、轉(zhuǎn)膜不充分,或洗膜過度使用麗春紅S檢測轉(zhuǎn)膜效果,PVDF膜需浸透,需正確的轉(zhuǎn)膜操作,勿過度洗膜6、曝光時間過短