多糖分離純化

關(guān)于多糖分離純化第一頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日柱層析技術(shù)(chromatography)

柱層析技術(shù)(chromatography)又稱柱色譜技術(shù)，主要原理是根據(jù)樣品混合物中各組分在固定相和流動(dòng)相中分配系數(shù)不同，經(jīng)多次反復(fù)分配將組分分離開(kāi)來(lái)。第二頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日柱層析測(cè)定多糖分子分布量原理

多糖為單糖的天然聚合物,多糖的性質(zhì)和藥理作用與其分子量大小,分子量分布及其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。多糖的分子量不是均一的,具多分散性,需要用統(tǒng)計(jì)方法表征其平均分子量及其分子量分布。高效凝膠色譜法測(cè)定多糖的分子量及其分布,具有快速,重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),在國(guó)內(nèi)外得到了廣泛的應(yīng)用第三頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日案例分析：多花黃精多糖云芝多糖蟲(chóng)草多糖第四頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日高效凝膠色譜法測(cè)定多花黃精多糖分子量與分子量分布

多花黃精多糖為水溶性多糖,針對(duì)其單糖組成和空間結(jié)構(gòu)與葡聚糖相似,在色譜柱的選擇上傾向于更適合于水溶性多糖分離測(cè)定用的ShodexOHPakSB-803HQ系列(對(duì)葡聚糖的排阻極限為1×105)第五頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日操作流程1.色譜條件色譜柱為ShodexOHPakSB-803HQ,流動(dòng)相為0.71%硫酸鈉溶液(內(nèi)含0.02%疊氮鈉),柱溫:35℃,示差折光檢測(cè)器(檢測(cè)器溫度35℃),流速0.5ml·min-1,取供試品溶液及對(duì)照品溶液各20μl注入液相色譜儀。2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及樣品測(cè)定取數(shù)個(gè)已知分子量的葡聚糖對(duì)照品，制成每1ml中各含10mg的溶液作為對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣，由GPC專用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)GPC專用軟件繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線及供試品的保留時(shí)間采用GPC專用軟件計(jì)算樣品各組分的重均分子量及其分子量分布。供試品溶液配置：多花黃精多糖適量,加流動(dòng)相制成每1ml中約含10mg的溶液,振搖,室溫放置過(guò)夜第六頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日操作流程3.精密度試驗(yàn)取同一供試品連續(xù)測(cè)定5次，表明該系統(tǒng)測(cè)定樣品分子量的精密度良好。4.重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)樣品制作5份供試品分別測(cè)定，表明該分析方法測(cè)定樣品分子量精密度良好。3.精密度試驗(yàn)取同一供試品連續(xù)測(cè)定5次，表明該系統(tǒng)測(cè)定樣品分子量的精密度良好。第七頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日操作流程5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一供試品，在配置完成后不同時(shí)間段進(jìn)樣（0h、2h、4h、8h、12h….），表明供試品在配置后一定時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定。6.樣品測(cè)定取不同批號(hào)的多花黃精多糖樣品，制備供試品溶液，并進(jìn)行分子量及分子量分布的測(cè)定。第八頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日高效凝膠色譜法測(cè)定云芝多糖的分子量及其分布云芝多糖能激活人體內(nèi)巨噬細(xì)胞，從而具有增強(qiáng)人體免疫功能的作用，臨床上用于治療慢性乙型肝炎、免疫功能低下等疾病。第九頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日1.云芝多糖的純化取云芝多糖原料約5g，加水25ml，微熱振搖使溶餌，用Sevage法去蛋白，即加入等量氯仿一正丁醇(4：1)充分振搖，離心，棄下層凝膠樣物，取上層溶液同法處理，直至下層溶液不再出現(xiàn)凝膠樣物質(zhì)。取上層溶液加入4倍體積的無(wú)水乙醇，振搖，離心，棄溶液，取沉淀物，加水10ml振搖使溶解，再加入4倍體積的無(wú)水乙醇，振搖，離心，同法處理兩次。取沉淀60~C減壓干燥4h，取干燥物研細(xì)，備用。操作流程第十頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日2.色譜條件色譜柱：TSK—GELG3000PWxl，TSK—GELGuradPWxl；流動(dòng)相：0．05mol／LNa2SOd[(含0．05NaN。)，流速：0．6ml／min；檢測(cè)器衰減：1／4，檢測(cè)器溫度25¨C(由RM6超級(jí)恒溫水浴循環(huán)水控制)；數(shù)據(jù)采集時(shí)間：22min。操作流程第十一頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日3.測(cè)定方法取純化后的樣品以流動(dòng)相制成10mg／ml溶液，取右旋糖苷分子量對(duì)照品以流動(dòng)相制成5mg／ml溶液，分別用0．5gm微孔濾膜過(guò)濾，各取20l注入色譜儀。4.標(biāo)準(zhǔn)曲線取重均分子量分別為200000、133800、84400、41100、21400、10000、4600和2500Da的右旋糖苷分子量對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰值保留時(shí)間，標(biāo)定色譜柱。以保留時(shí)間對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作線性回歸，得回歸方程。操作流程第十二頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日蟲(chóng)草多糖的柱層析分離純化蟲(chóng)草多糖為白色粉末，無(wú)異味，易溶于水，蟲(chóng)草多糖是蟲(chóng)草體內(nèi)含量最豐富、最重要的生物活性物質(zhì)之一，具有諸多藥理作用。第十三頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日一、蟲(chóng)草多糖的柱層析分離純化操作流程第十四頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日操作流程第十五頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日二、分部收集及多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法測(cè)定每管收集洗脫液的吸光值，繪制蟲(chóng)草多糖各柱層析過(guò)程的蟲(chóng)草多糖洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線合并每個(gè)波峰相應(yīng)波寬長(zhǎng)度的洗脫管數(shù)，定容后測(cè)定多糖含量。操作流程第十六頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日三.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制將葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品系列分別用流動(dòng)相配成濃度為1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)樣品液，進(jìn)樣量為20ul，采集色譜圖，繪制曲線相關(guān)度較好的葡聚糖GPC校正曲線方程。色譜條件：TSK-GELG-5000PWxlcolumn（7.8mm×300mm）與TSK-GELG-3000PWxlcolumn（7.8mm×300mm）串聯(lián)；流動(dòng)相0.02mol/LKH2PO4溶液，Ph6.0；流速0.6ml/min，柱溫35℃，進(jìn)樣量20μl操作流程第十七頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日四.分子量測(cè)定收集各多糖組分，經(jīng)濃縮，透析，真空干燥后，用流動(dòng)相配成濃度為1.0mg/ml的樣液，高速離心（10000r/min，10min）后，取1.0ml上清液，過(guò)0.45um水相微孔濾膜，進(jìn)樣量為20ul，采集色譜圖，根據(jù)上述所得葡聚糖G