甘露聚糖發(fā)酵液絮凝

卩-甘露聚糖酶發(fā)酵液絮凝條件的統(tǒng)計(jì)學(xué)篩選與響應(yīng)面優(yōu)化韓健，劉朝輝，齊崴，何志敏(天津大學(xué)化工學(xué)院化學(xué)工程研究所，天津300072)摘要：采用Plackett-Burman(PB)法和中心復(fù)合設(shè)計(jì)(CentralCompositeDesign)法對(duì)影響地衣芽抱桿菌TJ-101發(fā)酵生產(chǎn)卩-甘露聚糖酶粗發(fā)酵液絮凝操作的8個(gè)條件進(jìn)行篩選優(yōu)化。PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明：加水量，陽(yáng)離子聚丙烯酰胺(C-PAM)和陰離子聚丙烯酰胺(A-PAM)的濃度是影響酶活收率的三個(gè)關(guān)鍵因素。以酶活收率為響應(yīng)目標(biāo)，對(duì)三因素進(jìn)行中心復(fù)合設(shè)計(jì)，并經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化分析得到影響酶活收率的二階模型，確定了卩-甘露聚糖酶發(fā)酵液絮凝實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)操作條件為：加水量240.55%(V),C-PAM14.13%(V),A-PAM16.97%(V),絮凝后發(fā)酵液的酶活收率達(dá)70.42%。關(guān)鍵詞：卩-甘露聚糖酶，絮凝，Plackett-Burman設(shè)計(jì)，中心復(fù)合設(shè)計(jì)，響應(yīng)面，優(yōu)化文章編號(hào)：中圖分類(lèi)號(hào)：Q814.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：AOptimizationoftheflocculationconditionsofp-mannanasebroth

usingstatisticalscreeningandresponsesurfacemethodology

HANJian,LIUZhao-hui,QIWei,HEZhi-min(ChemicalEngineeringResearchCentre,SchoolofChemicalEngineeringandTechnology,Tianjin

University,Tianjin,300072,China)Abstract：Plackett-Burman(PB)designandCentralCompositeDesign(CCD)wereappliedtoscreeningandoptimizing8factorsfortheflocculationofp-mannanaseproductionbyBacilluslicheniformisTJ-101.Theamountofwater,andtheconcentrationsofC-PAMandA-PAM,asthreekeyfactors,werefoundtosignificantlyinfluencetheyieldofp-mannanaseactivityviaPBdesignandthefollowingstatisticanalysis.ByCCDdesignandresponsesurfaceanalysis,thequadraticmodelforthreesignificantfactorswasestablishedwithp-mannanaseactivityasthetargetresponse.Attheoptimalflocculationconditions,i.e.240.55%water,14.13%C-PAMand16.97%A-PAM,theyieldofenzymeactivityachieved70.42%.Keywords：p-Mannanase;flocculation;Plackett-Burman;centralcompositedesign;responsesurfacemethodology;optimizationP-甘露聚糖酶(1,4-卩-D-mannanase,EC8)是一類(lèi)能夠隨機(jī)裂解卩-1,4糖苷鍵的半纖維素內(nèi)切水解酶［1］，可通過(guò)多種產(chǎn)酶微生物如芽孢桿菌［2-3］、曲霉［4］等經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)制得。隨著人們對(duì)自然界半纖維素資源的開(kāi)發(fā)和甘露寡糖藥用價(jià)值的發(fā)現(xiàn)，卩-甘露聚糖酶已成為一種極其重要的工業(yè)酶制劑，在食品、醫(yī)藥、造紙、紡織、印染、石油開(kāi)采及生物技術(shù)等諸多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［5］。絮凝是生物技術(shù)下游加工過(guò)程特別是對(duì)微生物發(fā)酵液進(jìn)行分離純化以制備具有實(shí)用價(jià)值和競(jìng)爭(zhēng)力產(chǎn)品的重要手段［6-9］，它涉及各種絮凝劑的組合混凝作用和絮凝操作條件的優(yōu)化，以達(dá)到去除發(fā)酵液中菌體等雜質(zhì)，提高產(chǎn)品純度的目的。在實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化方面，傳統(tǒng)的單因素實(shí)驗(yàn)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且沒(méi)有考慮因素的交互作用致使最優(yōu)值并不可靠［10］。Plackett-Burman(PB)［10-12］方法廣泛應(yīng)用于微生物發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化和發(fā)酵工藝關(guān)鍵參數(shù)的篩選，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，篩選出對(duì)目標(biāo)值影響最大的關(guān)鍵因素，可大大減少優(yōu)化過(guò)程考察的因素?cái)?shù)和實(shí)驗(yàn)次數(shù)，節(jié)省大量人力、財(cái)力、物力和時(shí)間。收稿日期：基金項(xiàng)目：天津市重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(05YFGZGX04600)作者簡(jiǎn)介：韓健(1982-)，男，山東威海人，天津大學(xué)碩士生,研究方向：酶工程。聯(lián)系人：何志敏，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:enzyme@響應(yīng)面分析法（ResponseSurfaceMethodology,簡(jiǎn)稱(chēng)RSM）是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法［11-13］,其中的中心復(fù)合設(shè)計(jì)（CCD）應(yīng)用廣泛，可用于確定實(shí)驗(yàn)因素及其交互作用在工藝過(guò)程中對(duì)指標(biāo)響應(yīng)值的影響，精確地表述因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系。與以往采用的正交設(shè)計(jì)法不同，響應(yīng)面分析法通常是利用中心組合實(shí)驗(yàn)擬合出一個(gè)完整的二次多項(xiàng)式模型，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果表述方面更加優(yōu)良。將PB篩選和響應(yīng)面分析聯(lián)合應(yīng)用于發(fā)酵產(chǎn)品分離純化工藝，特別是絮凝工藝的優(yōu)化在國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。本文將在已有工作［14-16］基礎(chǔ)上，對(duì)近期經(jīng)紫外誘變和熱誘變獲得的高產(chǎn)菌株（地衣芽孢桿菌TJ-101）培養(yǎng)后所得發(fā)酵液進(jìn)行絮凝工藝優(yōu)化，即采用PB設(shè)計(jì)方法考察8個(gè)絮凝條件，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)篩選得出三個(gè)關(guān)鍵因素，進(jìn)一步利用CCD設(shè)計(jì)對(duì)三個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，最終得到最優(yōu)絮凝條件，以高效制備卩-甘露聚糖酶。1實(shí)驗(yàn)部分1.1實(shí)驗(yàn)材料酶液：地衣芽抱桿菌（Bacilluslicheniformis）TJ-101經(jīng)6.6L發(fā)酵罐培養(yǎng)48小時(shí)得卩-甘露聚糖酶發(fā)酵液；CaCl2:分析純，配制成40%的水溶液；聚合鋁（PAC）：工業(yè)級(jí)；陽(yáng)離子聚丙烯酰胺（C-PAM）、陰離子聚丙烯酰胺（A-PAM）:均配制成0.1%（w/v）的水溶液。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1絮凝操作：取適量發(fā)酵液，加水稀釋?zhuān){(diào)節(jié)攪拌速度，加入助凝劑CaCl2和PAC后調(diào)節(jié)pH值，再加入絮凝劑C-PAM和A-PAM，靜置；絮凝液用紗布過(guò)濾，取濾液；濾液經(jīng)離心5000g/15分鐘（BECKMANAllegraTM21R）后，取上清液，稱(chēng)量體積。1.2.2酶活分析：以DNS法［17］測(cè)定卩-甘露聚糖酶酶活。酶活定義：以0.5%角豆膠為底物，50°C反應(yīng)10分鐘，每分鐘釋放出lymol還原糖所需酶量為1個(gè)活力單位。酶活收率定義：Y=（絮凝液酶活x絮凝液體積）/（發(fā)酵液酶活x發(fā)酵液體積）x100%1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本文以酶活收率作為響應(yīng)目標(biāo)，采用兩步法進(jìn)行優(yōu)化：首先利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)挑選出對(duì)響應(yīng)影響較大的幾個(gè)因素；然后再利用響應(yīng)面方法（RSM）中的中心復(fù)合設(shè)計(jì)（CCD）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得到二階響應(yīng)面模型，最終確定最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件，并進(jìn)行驗(yàn)證。1.3.1篩選實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) Plackett-Burman設(shè)計(jì)Plackett-Burman設(shè)計(jì)由Plackett和Burman于1946年提出，它建立在不完全平衡板塊原理的基礎(chǔ)上，通過(guò)N個(gè)實(shí)驗(yàn)至多可以研究（N-1）個(gè)變量（N—般為4的倍數(shù)四］。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，通常會(huì)預(yù)留出虛擬變量作為誤差分析。每個(gè)變量有高、低兩個(gè)水平，分別以+、-標(biāo)記，在整個(gè)Plackett-Burman設(shè)計(jì)中，每個(gè)變量取高、低水平的值各N/2次，而且在某個(gè)因素取得高（低）水平時(shí)，其他各個(gè)因素取得高、低水平各N/4次。應(yīng)用‘DesignExpert'軟件（Stat-EaseInc.,Minmeapolis,USA）對(duì)絮凝實(shí)驗(yàn)進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)（因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1）。對(duì)絮凝過(guò)程的8個(gè)主要因素進(jìn)行篩選：即加水量，CaCl2、聚鋁（PAC）、陽(yáng)離子聚丙烯酰胺（C-PAM）和陰離子聚丙烯酰胺（A-PAM）的濃度，發(fā)酵液初始pH值，絮凝時(shí)間和攪拌速度，外加三個(gè)虛擬變量。每個(gè)變量分別確定（+）和（-）兩個(gè)水平，共進(jìn)行12次實(shí)驗(yàn)以確定每個(gè)因素的影響因子。表1Plackett-Burman設(shè)計(jì)因子水平Table1RangeofdifferentfactorsinvestigatedwithPlackett-Burman變量絮凝條件/（單位）低水平（-）高水平（+）X1加水量/（%）150250X240%CaCl2/(%)0.180.3X3PAC/(%)0.30.5X4pH6.08.0X50.1%C-PAM/(%)1418X60.1%A-PAM/(%)1418X7攪拌速度/（r/min）100150X8絮凝時(shí)間/（min）24XXX9 io 11虛擬因素--注：所加試劑用量均以200ml發(fā)酵液為基準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，應(yīng)用線性函數(shù)進(jìn)行因素篩選，忽略交互作用[12]，線性模型方程如式1所示：Y=卩+丫卩x（i=l……k） （1）0ii其中，Y為絮凝液的酶活收率響應(yīng)值，x.是考察因素，P.是回歸系數(shù)，反映了x.的影響程度，每iii一因素的影響由下述方程計(jì)算：2（ZM—M）E（x）= i+ i— （2）.N式中，E（x.）是所考察因素的主要影響水平，M.和M.為因素i在實(shí)驗(yàn)中所測(cè)得的酶活收率達(dá)到..+.-最大值和最小值時(shí)的數(shù)值，N是實(shí)驗(yàn)次數(shù)。1.3.2優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一一中心復(fù)合設(shè)計(jì)（CCD）由Box和Wilson開(kāi)發(fā)的中心復(fù)合設(shè)計(jì)CentralCompositeDesign（CCD）是一種常用的響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法，可以通過(guò)最少的實(shí)驗(yàn)來(lái)擬合響應(yīng)面模型，每個(gè)因素通常設(shè)置5個(gè)水平，一般采用二階經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)變量的響應(yīng)行為進(jìn)行表征：Y-卩+工卩X+藝為卩XX+工卩X2 （3）0 .. .j.j....=1 .=1j=1 .=1式中Y代表系統(tǒng)響應(yīng)，％、斥、你分別是偏移項(xiàng)、線性偏移和二階偏移系數(shù)，0帀是交互效應(yīng)系數(shù),X.是各因素水平值。.應(yīng)用‘DesignExpert'軟件，采用CCD方法，對(duì)Plackett-Burman篩選出的三個(gè)重要因素（水加入量、C-PAM、A-PAM）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2）,同時(shí)固定其他非關(guān)鍵因素:pH值6.0，助凝劑聚鋁0.4%（V），40%氯化鈣0.18%（V）,攪拌速度150r/min,時(shí)間2min。表2中心組合設(shè)計(jì)各因素水平Table2RangeofdifferentfactorsinvestigatedwithCCDdesign因素絮凝條件/（單位）水平-2-1012A水/(mL/100mL)100150200250300BC-PAM/(g/100mL)1214161820CA-PAM/(g/100mL)1214161820

2結(jié)果與討論2.1Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。表3Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table3Plackett-Burmanexperimentdesignandresponsevalues實(shí)驗(yàn)X]X2X3X4X5X6X7X8X9X]0X]]酶活收率/%1---0.42452+-++-+++---0.53373-++-+++---+0.15394+-+++---+-+0.50525++-+++---+-0.17036--+-++-+++-0.13587---+-++-+++0.39428+++---+-++-1.00609-+++---+-++0.573110+---+-++-++0.530811++---+-++-+0.495312-+-++-+++--0.3026采用‘DesignExpert'軟件對(duì)表3中的酶活收率數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到各影響因子的偏回歸系數(shù)及其顯著性(表4)。表4偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析Table4Partialregressioncoefficientsandanalysesoftheirsignificance因素回歸系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差E(x])平方和/%重要性截距0.440.032X]0.100.0320.21020.89重要X20.0150.0320.0300.41*X30.0490.0320.0984.60*X4-0.0220.032-0.0450.94*X5-0.140.032-0.2735.04重要X6-0.120.032-0.2428.13重要X70.0510.0320.015.03*X8-0.00690.032-0.0140.091*X90.0380.0320.0752.71*X]00.0330.0320.0662.06*X,,0.00660.0320.0130.084*注：*代表不重要以因素X]加水量為例：其偏回歸系數(shù)為0.10、標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.032、影響水平為E(xi)=0.210，表明因素兀對(duì)酶活收率的影響為正效應(yīng)，即隨著加水量的增加，酶活收率呈增加趨勢(shì)，因此在后繼因素優(yōu)化試驗(yàn)中應(yīng)該提高X]值；因素X]的平方和百分值(contributionofss)ss%=20.89%,較之因素X2、 X3、 X4、 X7、 X8、 X9、 X10、 X11 的相應(yīng)值明顯增高，因此顯著性分析結(jié)果為重要2 3 4789]0]](Significant)。由表4可明顯看出因素X,(加水量)、X(C-PAM濃度)、(A-PAM濃度)]56為主要影響因子，其影響值分別為：20.89%、35.04%和28.13%，而三個(gè)虛擬因素X9、X]0和X]]對(duì)響應(yīng)值酶活收率的低值影響(2.71%、2.06%和0.084%)表明了該線性模型的適用性。經(jīng)影響因素篩選，得到以酶活收率為響應(yīng)值的線性回歸方程：Y=0.44+O.lxA—0.14xB—0.12xC (3)其中：A=(X—200)/50,B=(X—16)/2，C=(X—16)/2。1 5 6

表5酶活收率回歸模型方程的方差分析Table5Analysesofvariancefortheregressionmodelequationofenzymeactivityyield類(lèi)型自由度平方和均方F值Prob(P)>F值回歸30.530.1814.070.0015離回歸80.10.013總變異110.63注：R2=0.8406,AdjR2=0.7809,CV=25.74%,AdeqPrecision=11.190方差分析模型的Prob(P)>F值為0.0015，表明所得回歸方程達(dá)到極顯著，即該模型在被研究的整個(gè)回歸區(qū)域擬合很好；復(fù)相關(guān)系數(shù) R2=0.8406,說(shuō)明相關(guān)性較好；校正決定系數(shù) AdjR2=0.7809,表明78.09%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來(lái)解釋?zhuān)煌ǔＧ闆r下變化系數(shù)(CV)越低，實(shí)驗(yàn)的可信度和精確度越高，CV值等于25.74%，表示PB實(shí)驗(yàn)的可信度和精確度較好；精密度(Adeqprecision)是有效信號(hào)與噪聲的比值，大于4.0視為合理，本實(shí)驗(yàn)精密度達(dá)到11.190。2.2CCD優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果與響應(yīng)面分析表6中心組合設(shè)計(jì)及結(jié)果Table6CCDdesignandresponsevalues實(shí)驗(yàn)ABC預(yù)測(cè)收率/%酶活收率/%10+200.5445460.54502520000.6055440.601055300+20.5649740.59969840000.6055440.5989455+1-1+10.7585440.68356860000.6055440.6281417+1+1+10.5302970.502018-1+1+10.6506110.679029-1-1-10.5950450.575201100-200.6665430.72995110000.6055440.6471861200-20.6461140.71444713-1+1-10.7012940.72814114+1+1-10.4179780.357663150000.6055440.62600516-2000.5687230.48663317-1-1+10.4015850.413769180000.6055440.57829119+1-1-10.7890010.71246220+2000.6423660.704221通過(guò)對(duì)加水量、C-PAM、A-PAM進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6)，得到相應(yīng)的二次方程模型(式4)：Y=1.14462+0.014298A+0.06442B—0.28978C-1.19319x10-3AB+4.07507x10-4AC ⑷8.9235x10-3BC—3.39654x10-6A2+5.05946x10-4B2+1.73001x10-3C2其中，Y是響應(yīng)值，即絮凝后卩-甘露聚糖酶的酶活收率，A，B，C分別表示加入水量、A-PAM和C-PAM濃度值。響應(yīng)面分析中對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬和的二次模型方差分析見(jiàn)表7。F值為4.93,多元相關(guān)系數(shù)為R2=0.8160,說(shuō)明模型對(duì)實(shí)際情況擬合較好；Prob(P)>F值為0.0101(‘Prob(P)>F'〈0視為模型顯著)，表明該模型高度顯著，可用來(lái)進(jìn)行響應(yīng)值預(yù)測(cè)。表7中心組合設(shè)計(jì)二次模型方差分析Table7AnalyseofvariancefortheregressionquadraticmodelequationofCCDdesign類(lèi)型自由度平方和均方F值Prob(P)>F回歸90.170.0194.930.0101誤差100.0380.003795失擬性50.0350.00696711.20.0096總和190.208二次模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)（表8）表明：因素B對(duì)絮凝效果的線性效應(yīng)顯著，而因素A和C不顯著；因素A2、B2、C2對(duì)絮凝效果的曲面效應(yīng)不顯著；AB對(duì)絮凝效果的交互影響顯著,而AC和BC不顯著。表8二次模型回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table8Coefficientestimatesbytheregressionquadraticmodel模型項(xiàng)回歸系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差F值Prob(P)>F常數(shù)項(xiàng)1.144620.025A（加水量）0.0142980.0151.430.2592B（陽(yáng)離子）0.064420.0153.920.0758C（陰離子）-0.289780.0151.740.2171A2乂-3.3965410-60.0120.480.5052B2乂5.05946 10-40.0120.0270.8724C2乂1.7300110-30.0120.320.5857AB乂-1.19319 10-30.02230.010.0003AC乂4.0750710-40.0223.50.0909BC乂8.9235 10-30.0222.690.1323圖1、圖2和圖3是由多元回歸方程式4所做的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖。由此可對(duì)任何兩因素交互影響絮凝后的酶活收率進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)，以確定最佳因素水平范圍。圖1顯示了A-PAM濃度在最佳值（16.97%）條件下，水的加入量和C-PAM濃度對(duì)酶活收率的交互影響。當(dāng)C-PAM處于低水平條件時(shí)（14mL），隨著加水量的增加，響應(yīng)酶活收率出現(xiàn)上升趨勢(shì)，而在C-PAM處于高水平條件下（18mL），隨著加水量的增加，響應(yīng)酶活收率反而出現(xiàn)降低。這說(shuō)明C-PAM與水之間存在顯著的交互影響，不同比例的C-PAM與水組合，將出現(xiàn)不同的響應(yīng)值變化趨勢(shì)。由于聚丙烯酰胺的成本比水高得多，因此確定C-PAM為低水平，加水量為高水平可達(dá)到較高的酶活收率值。圖2顯示了C-PAM濃度處于最佳值（14.13%）時(shí)，加水量和A-PAM濃度對(duì)絮凝效果的交互影響。從三維圖中可以看出，兩個(gè)因素的交互影響并不顯著。當(dāng)加水量A處于高水平時(shí)，可以獲得很高的酶活收率，且隨著A-PAM濃度的增大，酶活收率略有增加，但不明顯，因此確定A-PAM濃度應(yīng)為較高水平。圖3顯示了加水量為最佳值（240.55%）時(shí)，C-PAM和A-PAM對(duì)絮凝效果的交互影響。從圖中明顯看出，在實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi)，當(dāng)C-PAM濃度處于低水平時(shí)可獲得較高的酶活收率，而此時(shí)隨A-PAM濃度的增加，酶活收率略有下降，因此A-PAM濃度應(yīng)為較低水平。率收活酶0.770.68750.6050.52250.44子離陽(yáng)B14.00B:陽(yáng)離子517.0018.00250.00225.00A0加水量75.00率收活酶0.770.68750.6050.52250.44子離陽(yáng)B14.00B:陽(yáng)離子517.0018.00250.00225.00A0加水量75.00150.000.551218_ 0.6037217.000.551218-015.000.49871714.00150.00 175.00200.00 225.00 250.00A:加水量酶活收率18.000.685率收活酶0.590.495250.002A加水水0量0175.00“ 14.0015.001700&00C陰離子0.685率收活酶0.590.495250.002A加水水0量0175.00“ 14.0015.001700&00C陰離子150.0018.0014.0018.0017.0016.0015.000.0.531960.4707450.5931750.65439150.00 175.00 200.00 225.00 250.00A:加水量圖1加水量和C-PAM對(duì)酶活收率交互影響的三維曲面圖和寺咼線圖Fig.1Surfaceandcontourplotsofmutual-influenceforwaterandC-PAMontheyieldofenzymeactivity0.6950.78Fig.2Surfaceandcontourplotsofmutual-influenceforwaterandA-PAMontheyieldofenzymeactivity18.00率收活酶0.610.5250.4414.00.16.0015.00B陽(yáng)離子17.0018.0014.0015.00 ‘°C陰離子18.0014.000.50210517.000.5564260.610747>506814.00 15.00 16.0017.000.6950.78Fig.2Surfaceandcontourplotsofmutual-influenceforwaterandA-PAMontheyieldofenzymeactivity18.00率收活酶0.610.5250.4414.00.16.0015.00B陽(yáng)離子17.0018.0014.0015.00 ‘°C陰離子18.0014.000.50210517.000.5564260.610747>506814.00 15.00 16.0017.0018.00B:陽(yáng)離子圖2加水量和A-PAM對(duì)酶活收率交互影響的三維曲面圖和等高線圖圖3C-PAM和A-PAM對(duì)酶活收率交互影響的三維曲面圖和等高線圖Fig.3Surfaceandcontourplotsofmutual-influenceforA-PAMandC-PAMontheyieldofenzymeactivity由設(shè)計(jì)軟件得到30組（未列出）優(yōu)化條件，確定最優(yōu)絮凝工藝為：關(guān)鍵因素加水量240.55%(V),C-PAM14.13%(V),A-PAM16.97%(V),理論計(jì)算酶活收率達(dá)到72.93%。

2.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)按照優(yōu)化后的絮凝條件：加水量240.55%(V),C-PAM14.13%(V),A-PAM16.97%(V),發(fā)酵液初始pH值6.0,助凝劑聚鋁0.4%(V),氯化鈣(40%)0.18%(V),攪拌速度150r/min，時(shí)間2min,進(jìn)行了粗發(fā)酵液絮凝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),實(shí)測(cè)酶活收率達(dá)到70.42%,與預(yù)測(cè)值72.93%較接近,預(yù)測(cè)精度達(dá)96.56%，表明了PB和CCD方法聯(lián)用的可行性，也證明了該套統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析方法在生物加工過(guò)程應(yīng)用中的準(zhǔn)確性和可靠性。3結(jié)論本文將PB篩選和RSM分析相結(jié)合成功地應(yīng)用于卜甘露聚糖酶發(fā)酵液絮凝純化工藝的優(yōu)化，研究證明：PB方法可從影響發(fā)酵液絮凝工藝的眾多操作條件中高效地篩選出關(guān)鍵因素；CCD設(shè)計(jì)和RSM分析，可實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵因素的合理優(yōu)化，在最佳條件下，粗發(fā)酵液絮凝提純后的酶活收率達(dá)到70.42%,接近理論預(yù)測(cè)值72.93%。參考文獻(xiàn):ReeseTandShibataY.卩-Mannanaseoffungi[J].CanJMicrobiol,1965,11:167-183.AraujoAandWardOP.MannanasecomponentsfromBacilluspumilus[J].ApplEnvironMicrobiol,1990,56:1954-1956.⑶崔福綿，石家驥，魯茁壯.枯草芽抱桿菌中性-甘露聚糖酶的產(chǎn)生與性質(zhì)[J].微生物學(xué)報(bào),1999,39:60-63.[4]TsujisakaY,HiyamaK,TakenishiSandFukumotoJ.Studiesonthehemicellulase.PartIII.PurificationandsomepropertiesofmannanasefromAspergillusnigervanTieghemsp.(inJapanese)[J].NipponNogeikagakuKaishi,1972,46:155-161.⑸何志敏，蘇榮欣，齊崴.魔芋葡甘聚糖的pH觸發(fā)酶解[J].生物加工過(guò)程,2004,2(4):36-40HanBinbing,AkeprathumchaiS.Flocculationofbiologicalcells:experimentvs.theory[J].AIChEJournal,2003,49(7):1687-1701.GeXumeng,YuLu,ZhaoXinqing,BaiFengwu,AnLijia.On-linecharacterizationofflocculatingyeastparticles[J].JournalofChemicalIndustryandEngineering(China),2005,56(2):306-311.Ver