素材微生物的計(jì)數(shù) 高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

微生物的計(jì)數(shù)高中生物學(xué)選擇性必修三教材中出現(xiàn)多次微生物計(jì)數(shù)的問(wèn)題，如細(xì)菌的計(jì)數(shù)，酵母菌的計(jì)數(shù)等。那么，培養(yǎng)皿內(nèi)菌落計(jì)數(shù)得到細(xì)菌數(shù)需要控制數(shù)量范圍是多少？菌落的分離需要控制在什么數(shù)量范圍內(nèi)？細(xì)菌的計(jì)數(shù)有哪些方法？菌落計(jì)數(shù)數(shù)值范圍人教版教材中，涂布分離法統(tǒng)計(jì)的菌落個(gè)數(shù)應(yīng)介于30～300之間（如下所示），指的是統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，目的不是分離菌落。意思是只要有菌落生長(zhǎng)出來(lái)就可以計(jì)數(shù)，不需要菌落生長(zhǎng)到一定的大小。微生物的計(jì)數(shù)有哪些方法？平板劃線分離法是不能用來(lái)細(xì)菌計(jì)數(shù)的，因?yàn)橹挥袆澗€的后期才有可能是單菌落，通常用稀釋涂布分離法來(lái)計(jì)數(shù)，那么“細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)只能采用涂布分離法”，為什么是錯(cuò)誤的呢？

測(cè)定微生物生長(zhǎng)的方法很多，各種方法均有其優(yōu)缺點(diǎn)，也不是在任何情況下都適用。在微生物學(xué)工作中一般常用的是培養(yǎng)皿菌落計(jì)數(shù)法、計(jì)數(shù)器法和比濁法等。

1．計(jì)數(shù)板測(cè)定法

即用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。取一定體積的樣品細(xì)胞懸液置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室內(nèi)，用顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)室的容積是一定的（0.1mm3），因而根據(jù)計(jì)數(shù)板刻度內(nèi)的細(xì)菌數(shù)，可計(jì)算樣品中的含菌數(shù)。

本法不僅適于細(xì)菌計(jì)數(shù)，也適用于酵母菌及霉菌孢子計(jì)數(shù)。

2．比濁法比濁法是根據(jù)菌懸液的透光量間接地測(cè)定細(xì)菌的數(shù)量。細(xì)菌懸浮液的濃度在一定范圍內(nèi)與透光度成反比，與光密度成正比，所以，可用光電比色計(jì)測(cè)定菌液，用光密度（OD值）表示樣品菌液濃度。

此法簡(jiǎn)便快捷，但只能檢測(cè)含有大量細(xì)菌的懸浮液，得出相對(duì)的細(xì)菌數(shù)目，對(duì)顏色太深的樣品，不能用此法測(cè)定。

3．活細(xì)胞計(jì)數(shù)法常用的有平板菌落計(jì)數(shù)法，是根據(jù)每個(gè)活的細(xì)菌能長(zhǎng)出一個(gè)菌落的原理設(shè)計(jì)的。取一定容量的菌懸液，作一系列的倍比稀釋?zhuān)缓髮⒍康南♂屢哼M(jìn)行平板培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù)，可算出培養(yǎng)物中的活菌數(shù)。

此法靈敏度高，是一種檢測(cè)污染活菌數(shù)的方法，也是目前國(guó)際上許多國(guó)家所采用的方法。

使用該法應(yīng)注意：①一般選取菌落數(shù)在30～300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，過(guò)多或過(guò)少均不準(zhǔn)確；②為了防止菌落蔓延，影響計(jì)數(shù)，可在培養(yǎng)基中加入0.001%2，3，5一氯化三苯基四氮唑（TTC）；③本法限用于形成菌落的微生物。

廣泛應(yīng)用于水、牛奶、食物、藥品等各種材料的細(xì)菌檢驗(yàn)，是最常用的活菌計(jì)數(shù)法。

4．電子計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法電子計(jì)數(shù)器的工作原理是測(cè)定小孔中液體的電阻變化，小孔僅能通過(guò)一個(gè)細(xì)胞，當(dāng)一個(gè)細(xì)胞通過(guò)這個(gè)小孔時(shí)，電阻明顯增加，形成一個(gè)脈沖，自動(dòng)記錄在電子記錄裝置上。

該法測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確，但它只識(shí)別顆粒大小，而不能區(qū)分是否為細(xì)菌。因此，要求菌懸液中不含任何碎片。5．測(cè)定細(xì)胞重量法此法分為濕重法和干重法。濕重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后將濕菌體進(jìn)行稱(chēng)重；干重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后，以清水洗凈放人干燥器加熱烘干，使之失去水分然后稱(chēng)重。

此法適于菌體濃度較高的樣品，是測(cè)定絲狀真菌生長(zhǎng)量的一種常用方法。

6．測(cè)定細(xì)胞總氮量或總碳量氮碳是細(xì)胞的主要成分，含量較穩(wěn)定，測(cè)定氮、碳的含量可以推知細(xì)胞的質(zhì)量。此法適于細(xì)胞濃度較高的樣品。

7．顏色改變單位法（CCU）這種方法通常用于很小，用一般的比濁法無(wú)法計(jì)數(shù)的微生物，比如原核生物支原體等，因?yàn)橹гw的液體培養(yǎng)物是完全透明的，呈現(xiàn)為清亮透明紅色，因此無(wú)法用比濁法來(lái)計(jì)數(shù)，由于支原體固體培養(yǎng)很困難，用菌落形成法也不容易計(jì)數(shù)，因此需要用特殊的計(jì)數(shù)方法，即CCU法。

它是以微生物在培養(yǎng)基中的代謝活力為指標(biāo)，來(lái)計(jì)數(shù)微生物的相對(duì)含量的，下面以解脲脲原體（人類(lèi)泌尿生殖道常見(jiàn)的寄生菌）為例，簡(jiǎn)單介紹其操作：（1）取12只無(wú)菌試管，每一管裝1.8ml解脲脲原體培養(yǎng)基。（2）在第一管加入0.2ml待測(cè)解脲脲原體菌液，充分混勻，從中吸取0.2ml加入第二管，依次類(lèi)推，10倍梯度稀釋?zhuān)恢钡阶钅┮还堋＃?）于37℃培養(yǎng)，以培養(yǎng)基顏色改變的最末一管作為待測(cè)菌液的CCU，也就是支原體的最大代謝活力，比如，第六管出現(xiàn)顏色改變，他的相對(duì)濃度就是106CCU/ml。

一般來(lái)說(shuō)，比濁法和菌落計(jì)數(shù)法就可以滿足絕大多數(shù)細(xì)菌的計(jì)數(shù)，但是對(duì)支原體這樣比較特殊的微生物，用CCU法比較合適。

例、如圖是從土壤中篩選產(chǎn)脲酶細(xì)菌的過(guò)程。請(qǐng)回答（1）圖中選擇培養(yǎng)基應(yīng)以

為唯一氮源；鑒別培養(yǎng)基還需添加

作指示劑。（2）在5個(gè)細(xì)菌培養(yǎng)基平板上，均接種稀釋倍數(shù)為105的土壤樣品溶液0.1mL，培養(yǎng)一段時(shí)間后，平板上長(zhǎng)出的細(xì)菌菌落數(shù)分別為13、156、462、178和191。該過(guò)程采取的接種方法是

，每克土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)量為

個(gè)。解析：（1）脲酶能夠催化尿素分解為氨，因此要從土壤中篩選產(chǎn)脲酶的細(xì)菌，培養(yǎng)基應(yīng)以尿素為唯一氮源；由于尿素被脲酶分解成氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，pH升高，從而使酚紅指示劑變紅，因此鑒別培養(yǎng)基還需添加酚紅作指示劑。（2）用于計(jì)數(shù)細(xì)菌菌落數(shù)的常用方法是稀釋涂布平板法，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)應(yīng)介于30～300之間，故選擇細(xì)菌菌落數(shù)為156、178和191的平板計(jì)數(shù)．每克該