鹽酸克倫特羅殘留課件

第六章

鹽酸克倫特羅（clenbuterol，CLB）

及其殘留量的檢測1瘦肉精萊克多巴胺（Ractopamine，又名雷托巴胺，培林）鹽酸克侖特羅（clenbuterol）硫酸沙丁胺醇（Salbutamol）硫酸特布他林Terbutaline)西巴特羅鹽酸多巴胺指能夠促進瘦肉生長、抑制肥肉生長的一類藥物添加劑。

因有毒性極低、代謝快速、無累積性等特點被美國等24個國家允許添加入豬飼料，日本也允許使用培林的豬肉進口，但包括中國和歐盟在內(nèi)的160多個國家禁用。2一、概述化學結構：化學名：羥甲叔丁腎上腺素，α-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽中文名：瘦肉精；克倫特羅；鹽酸克倫特羅；鹽酸雙氯醇胺；克喘素；氨哮素；氨必妥；氨雙氯喘通；氨雙氯醇胺分子式：C12H18C12N20-HCl相對分子質(zhì)量：313.65結構式：

NHCCH3H2NClClCHCH2OH·HClCH3CH33CLB在動物組織中蓄積殘留分布蓄積部位

眼

肺、肝、腎

肌肉、脂肪

殘留（血漿中濃度倍數(shù)）

10720-90

3-15

4、代謝吸收迅速、在體內(nèi)殘留時間長；服藥后10~20min起效，2~3h在血液濃度達最大峰值并維持5h左右，半衰期25~39h，消除5個半衰期（約97%）需5-8d。易在眼、毛發(fā)、內(nèi)臟（尤其肝、肺、腎）中蓄積。造成肝、腎及神經(jīng)系統(tǒng)損害。CLB在豬尿中的殘留時間給藥方式

給藥劑量

給藥時間尿中殘留

混飼給藥

1.33mg/kg7d

30d

55、中毒表現(xiàn)骨骼肌興奮：面頸、四肢肌肉顫動，手抖甚至不能站立，乏力心肌興奮：心悸，心動過速，室性早搏，心電圖示S-T段壓低與T波倒置，血壓升高平滑肌興奮：嘔吐和腹瀉神經(jīng)系統(tǒng)興奮：頭疼頭暈脂肪分解：血液游離酸↑,血管壁彈性↓,血壓↑有高血壓、冠心病、甲亢、心律失常者、應用擬交感神經(jīng)藥者或?qū)η八庍^敏者，反應更強烈。與糖皮質(zhì)激素合用可引起低血鉀，加劇心律失常反復使用會產(chǎn)生耐受性66、CLB殘留危害事件不斷發(fā)生CLB殘留引起中毒事件最早發(fā)生在西班牙，89年10月至90年7月間135人中毒，43個家庭中91%成員受到影響；92年該國北部地區(qū)又暴發(fā)232例中毒病例。1990年秋季法國有8個家庭22人發(fā)生CLB中毒1998年5月香港有17人發(fā)生CLB中毒，2000年10月9日又有57人中毒。1999年10月6日，浙江嘉興市有57人中毒。2000年4月14日廣東博羅縣龍華鎮(zhèn)30人中毒，01年11月7日河源縣發(fā)生747人大規(guī)模CLB中毒的事件7來自“廣州日報”

的報道2006年06月06，佛山市一家旅館的員工紛紛感覺身體不適前往佛山市第一人民醫(yī)院治療。據(jù)醫(yī)院急診科的醫(yī)生介紹，經(jīng)過診斷，這些員工很可能食用了含瘦肉精的肉制品而導致食物中毒。2006年8月14日惠城區(qū)河南岸一間小五金廠5名工人，因吃了瘦肉精超標1000倍的豬肝而引起中毒。8“瘦肉精”喂出“健美豬”

央視“每周質(zhì)量報告”2011年3·15特別節(jié)目《“健美豬”真相》報道河南孟州等地養(yǎng)豬場用“瘦肉精”養(yǎng)豬，有毒豬肉流向了雙匯。10二、CLB的檢驗與監(jiān)測㈠、檢驗、檢疫現(xiàn)狀歐共體1988年1月1日開始禁止其作為獸用飼料添加劑，美國也作了相同的規(guī)定。目前CLB是歐盟成員國肉品進口必檢項目我國農(nóng)業(yè)部1997年3月下文[農(nóng)牧發(fā)(1997)3號]嚴禁β-腎上腺素激素在飼料和畜牧生產(chǎn)中使用國際奧委會將CLB列為興奮劑名單12㈢、CLB的檢驗、檢測方法感官識別法：健康肉淡紅色，肉質(zhì)彈性好，無“出汗”“問題肉”特別鮮紅，脂肪非常薄，瘦肉纖維疏松，有“出汗”現(xiàn)象142、儀器法檢測法農(nóng)業(yè)部2001年頒布的強制性行業(yè)標準——《飼料中鹽酸克倫特羅測定》(Ny438-2001)指定的儀器檢測方法有：高效液相色譜法（HPLC）：最低檢測限范圍為1~15ng/g，半確證法氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）：檢測限度可達0.5ng/ml(豬尿)，可同時定性、定量，確證性方法儀器法是利用儀器設備對瘦肉精進行定量定性檢測，是比較傳統(tǒng)的辦法，具有檢測準確，精度高的特點，日前仍作為仲裁和確認的方法。但需要昂貴的儀器設備作為基本條件，而且操作繁雜、耗時較長，檢測成本高，僅限于少數(shù)的大型檢測機構使用。15質(zhì)譜分析技術的基本原理質(zhì)譜分析法（MassSpectrometry，MS）：物質(zhì)分子的質(zhì)量譜，是分離和測定分子的質(zhì)量、強度信息的一種物理方法，并由此表示物質(zhì)的成分與結構。質(zhì)譜分析法的基本原理是：首先將樣品中的分子電離，不同質(zhì)量離子在電場或磁場中，將按其質(zhì)量和所帶的電荷比（質(zhì)荷比，m/z）進行分離和排序，根據(jù)m/z的大小和相對強度形成有規(guī)則的質(zhì)譜，從而對物質(zhì)進行結構鑒定和定量分析16GS—MS法測定動物性食品中的克倫特羅殘留（GB/T5009.192——2003）詳見教材63~65頁173、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法特異性強、靈敏度高、酶標板上一次可作多份樣品檢測，可對CLB進行定性、定量測定，與傳統(tǒng)的儀器檢測法相比，只需要簡單的儀器設備，檢測時間大大縮短，目前是生產(chǎn)中快速初篩的主要方法。（enzymelinkedimmunosorbentassay）是應用最廣泛的免疫檢測技術18抗原（Antigen，Ag）能刺激機體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細胞并能與之結合引起特異性免疫反應的物質(zhì)完全抗原：既具有免疫原性又具有反應原性的物質(zhì)。如蛋白質(zhì)（細菌、病毒、動物血清等）。半抗原：只有反應原性，缺乏免疫原性的物質(zhì)，如大多數(shù)農(nóng)藥、獸藥。半抗原與蛋白質(zhì)等大分子結合后，可具有免疫原性，即半抗原+載體＝完全抗原免疫原性反應原性20抗體（Antibody，Ab）機體在抗原刺激下形成的一類可與抗原發(fā)生特異性結合反應的免疫球蛋白（immunoglobulin）天然抗體：天然存在于各種動物血清中的抗體，有凝集和溶解異種動物紅細胞的效應免疫抗體：機體受抗原刺激或接受接種而產(chǎn)生的抗體21⑵、ELISA法的原理用酶標記已知抗體(或抗原)，然后與樣品在一定條件下反應，如果樣品中含有相應的抗原(或抗體)，就會發(fā)生特異性免疫反應，生成酶標記的免疫復合物，吸附在固相載體上，不會被緩沖液沖掉。當加入酶的底物時，酶與底物發(fā)生反應生成有色產(chǎn)物，顏色的深淺與樣品中抗原(或抗體)的量成正比，可用肉眼或借助儀器進行定性定量分析。＋樣品(吸附在固相載體上)已知酶聯(lián)結合物吸附在固相載體上的酶聯(lián)免疫復合物酶底物有色產(chǎn)物比色定性定量不會被緩沖液沖掉23ELISA法必要的三種物質(zhì)固相載體：用于吸附Ag(或Ab)已知的酶標Ab(或Ag)酶作用的底物24SubstratePrimaryantibodyEnzymeSecondaryantibodyDifferentantigensinsampleColouredproduct間接法(測定抗體)將抗原吸附于固相載體表面形成固相抗原加待測抗體,形成固相抗原—抗體復合物加酶標二抗，形成固相抗原—抗體—抗抗體洗滌，加底物，測定底物的降解量＝抗體量26雙抗體夾心法(測定抗原)將已知抗體吸附于固相表面，形成固相抗體;加待測抗原，形成固相抗體—抗原復合物

加酶標抗體，形成固相抗體-抗原-酶標抗體復合物洗滌，加底物，底物的降解量＝抗原量27競爭法(測定抗原)將抗體吸附在對照孔和樣品孔固相載體表面

對照孔：加酶標抗原樣品孔：加酶標抗原和待測樣品，如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會競爭性與固相抗體結合，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。洗滌，加底物顯色。樣品孔顏色越淡，表示樣品中抗原含量越多。對照孔顏色深度與樣品孔顏色深度之差，代表受檢樣品含抗原的量。樣品孔本法也可用于測定抗體28羊抗兔IgG抗體抗CLB抗體陽性(positive)Wash1H2O2+TMBNOCOLOR樣品酶偶聯(lián)CLB30羊抗兔IgG抗體抗CLB抗體陰性(negative)Wash1H2O2+TMB樣品酶偶聯(lián)CLB31陰性(negative)加反應停止液后32②、試劑高氯酸(0.1mol/L)異丙醇+乙酸乙脂(40+60)氫氧化鈉(1mol/L)磷酸二氫鈉緩沖液(PBS，0.1mol/L，pH=6.0)克倫特羅酶聯(lián)免疫試劑盒96孔板(12條×8孔)包被有針對克倫特羅IgG的包被抗體過氧化物酶標記物（濃縮液）克倫特羅抗體（濃縮液）酶底物和顯色劑：過氧化氫(或過氧化尿素)+四甲基聯(lián)苯胺(TMB)反應停止液：1mol/L硫酸稀釋用緩沖液：PBS33③、儀器超聲波清洗器具塞磨口玻璃離心管：11.5cm(長)×3.5cm(內(nèi)徑)離心機（5000r/min）振蕩器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器渦漩式混合器勻漿器酶標儀（配450nm濾光片）針筒式微孔過濾膜(0.45μm，水相)微量移液器：單道20μl、50μl、100μl和多道50~250μl34樣品提取試劑和試樣的準備ELISA法測定加樣→溫育→洗滌→顯色→比色結果計算，定量④、試樣測定步驟35樣品提取的主要環(huán)節(jié)樣品中加入高氯酸溶液，用超聲波加熱提取用異丙醇—乙酸乙酯（40：60）萃取取有機相濃縮36樣品提取的步驟肌肉、肝臟、腎試樣10g20ml0.1mol/L高氯酸溶液+勻漿，置于磨口玻璃離心管中，超聲波清洗器中超聲20min80℃水浴加熱30min，冷卻后離心15min(4500r/min)沉淀用5ml0.1mol/L高氯酸溶液洗滌，再離心置于磨口玻璃離心管中，用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至9.5±0.1（若有沉淀，再離心10min）+氯化鈉8g+25ml異丙醇+乙酸乙脂(40+60)振蕩器振蕩20min，放置5min吸取上層有機相下層用20ml異丙醇+乙酸乙脂(40+60)再萃取1次轉(zhuǎn)移至5ml玻璃離心管中，用0.1mol/L磷酸二氫鈉緩沖液(pH6.0)定容至刻度經(jīng)針筒式微孔濾膜過濾，洗滌3次于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮近干，用1ml0.1mol/L磷酸二氫鈉緩沖液(pH6.0)充分溶解殘留物取上清液37②、試劑、試樣的準備稀釋酶標記物和CLB抗體試驗用試劑應提前1~2h從冰箱中取出，待溫度與室溫平衡后使用，試劑完畢后不需用的部分應及時放回冰箱保存稀釋前要仔細振搖，用緩沖液以1：10的比例稀釋因稀釋后的酶標記物和抗體穩(wěn)定性變差，僅按實際需要量稀釋微孔板按實際需要取用，剩下的于干燥劑一起重新密封保存于2~8℃。試樣準備：取提取物20μl進行分析，高殘留試樣用蒸餾水進一步稀釋。38傾空微孔板,用250ul沖洗液重復洗板2遍以上加100ul稀釋后的克倫特羅抗體溶液到每個孔中，充分混合并在室溫孵育15min加20ul標準溶液或處理好的待測試樣傾空微孔板,用250ul緩沖洗液重復洗板2遍以上加酶底物(H2O2和TMB各50ul)，充分混合并室溫孵育15min加100ul反應停止液，混合后盡快在450nm波長處測量吸光度③、測定室溫20-25℃避光孵育30min+100ul稀釋的酶聯(lián)標記物39④、結果計算，定量繪制標準曲線測定6個梯度的克倫特羅標準溶液（0、100、300、900、2700、8100

ng／L）吸光度值