兩面針種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程

T/CSMAXXXX－2018兩面針種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了兩面針[Zanthoxylum

nitidum

（Roxb.）DC.]種子超低溫保存過程中的術(shù)語和定義、種子的選擇、種子前處理、種子保存量、種子冷凍方式、恢復(fù)培養(yǎng)等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于兩面針種子的超低溫長期貯藏。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.6農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程水分測定術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。兩面針Zanthoxylum

nitidum

（Roxb.）DC.為蕓香科（Rutaceae）花椒屬（ZanthoxylumL.）多年生植物，別稱入地金牛，藥用價值廣泛，具有活血化瘀、解毒消腫、行氣止痛等功效，在胃火牙痛等方面有獨特的療效。是《中國藥典（2015）》收載的臨床常用中藥材。兩面針果實Zanthoxylumnitidum

（Roxb.）DC.fruits果實為蒴果，果梗長2~5mm，稀較長或較短；果皮紅褐色，單個分果瓣徑5.5~7mm，頂端有短芒尖；部分裂開，可見內(nèi)部種子。兩面針種子Zanthoxylum

nitidum

（Roxb.）DC.seeds兩面針的播種材料為完整種子，貯藏特性判斷為中間性種子。種子黑色、圓珠形，表面為一層光亮的黑色蠟質(zhì)，去除后可見網(wǎng)狀的骨質(zhì)結(jié)構(gòu)，質(zhì)堅硬，腹面稍平坦，橫徑5~6mm，種胚白色圓形。種子超低溫保存seedofcryopreservation指將經(jīng)過前處理的兩面針種子置于液氮（-196℃）中保存。保存種子的選擇果實采收9月至11月間，當(dāng)果皮顏色為紅褐色時即可采收，去除果皮，取出種子。種子選擇挑選發(fā)育飽滿、均勻、健康的種子，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ù娣艜r間不超過3個月）。種子前處理生活力檢測參照《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》中的溴麝香草酚藍(lán)（BTB）法測定兩面針種子生活力。待測種子在30℃~35℃溫水中浸種2h，隨后取吸脹種子20粒，整齊地埋于備好的瓊脂凝膠中，注意要將胚埋入凝膠中。將培養(yǎng)皿置于35℃溫箱中5h后觀察結(jié)果。生活力計算在光下用放大鏡對染色結(jié)果進(jìn)行觀察鑒定。凡種胚周圍出現(xiàn)黃色暈圈的種子為有活力的種子，否則為無活力的種子。計算：生活力=有活力的種子數(shù)/總的種子數(shù)×100%待保存的兩面針種子生活力應(yīng)≥70%。含水量范圍用尼龍網(wǎng)袋包裹兩面針種子，置于盛有變色硅膠的干燥器內(nèi)，硅膠與種子的體積比為29000:1，室溫條件下干燥處理2~10h，在干燥過程中定期測定種子含水量，將種子含水量由15%~20%降至11%~14%。參照GB/T3543.6中的高恒溫烘干法（130℃烘干1h）測定種子含水量（W0），W0=（鮮重-絕干重）/鮮重×100%。種子保存量兩面針種子保存量不少于360粒，以便后期的活力檢測使用。種子冷凍方式兩面針種子超低溫保存的冷凍方式為直接冷凍法，即將待保存的兩面針種子放入2mL凍存管（每管30粒種子）中，迅速投入液氮中保存。恢復(fù)培養(yǎng)種子解凍處理液氮中至少凍存24h后，取出2個凍存管，立即放入40℃水浴中快速解凍2min。凍后種子生活力檢測取出1管解凍后的種子，參照5.1~5.2生活力檢測方法，進(jìn)行超低溫保存后的初始生活力檢測。當(dāng)種子生活力≥70%時視為保存成功。恢復(fù)培養(yǎng)將剩下1管解凍后的兩面針種子，播種到帶有無菌濾紙的發(fā)芽盒中，溫度25℃～30℃，濕度70%～85%條件下培養(yǎng)。附錄BTB的配制和保存方法精密稱取BTB0.1g，溶解于煮沸過的100mL純水中，然后用濾紙去殘渣。濾液若呈黃色，可加數(shù)滴氫氧化鈉溶液，使之變?yōu)樗{(lán)色或藍(lán)綠色，此液長期貯存于棕色瓶中。1.5%BTB瓊脂凝膠：稱量0.1%BTB溶液40mL置于燒杯中，稱取0.5g瓊脂，將其剪碎后加入杯中，加熱并不斷攪拌使之完全溶解。待溶液稍稍冷卻即可趁熱倒入9cm培養(yǎng)皿中，使之成一均勻的薄層，完全冷卻后備用。參考文獻(xiàn)中國科學(xué)院中國植物志委員會.中國植物志.第43（2）卷[M].科學(xué)出版社，2004（1997）：013ZhangDianxiang.ThomasG.Hartley.DavidJ.Mabberley.Rutaceae[M]//FloraOfChinaBeijing:SciencePress/St.Louis:MissouriBotanicalGardenPress.2008.11:54-55.[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].XX，中國醫(yī)藥科技出版社，2015：169-170[4]傅家瑞，宋松泉