離心實(shí)驗(yàn)方案

離心實(shí)驗(yàn)報(bào)告（方案）（分離并鑒定葉綠體和線粒體、細(xì)胞核）一、實(shí)驗(yàn)儀器剪刀、研缽、三角瓶、小燒杯、紗布、超聲波細(xì)胞破碎儀、玻棒、離心管、注射器、離心管架、普通高速離心機(jī)、超速離心機(jī)、載玻片、蓋玻片、膠頭滴管、接種環(huán)、鑷子、擦鏡紙、吸水紙、冰箱、數(shù)碼顯微鏡二、實(shí)驗(yàn)藥品液氮、50mmol/LTirs鹽酸緩沖液（PH=7.4）、0.25mol/L蔗糖溶液、詹納斯綠染液（線粒體）、姬姆薩染液（細(xì)胞核）、香柏油（人工）、二甲苯三、實(shí)驗(yàn)材料蔞蒿鮮莖葉、根四、實(shí)驗(yàn)原理將破碎后的細(xì)胞進(jìn)行離心實(shí)驗(yàn)，設(shè)置不同轉(zhuǎn)速梯度，從而得到不同轉(zhuǎn)速下的沉淀，收集沉淀用數(shù)碼顯微鏡進(jìn)行觀察，看是否分離得到線粒體和葉綠體。五、 溶液配制1、 緩沖液的配制：50mmol/LTirs鹽酸緩沖液配法（PH=7.4）：50ml0.1mol/LTris溶液溶于42ml0.1mol/L的鹽酸，混勻加水稀釋至100ml0.1mol/LTris：12.114g溶于1L水，0.1mol/L鹽酸：1ml36%HCL定容與100ml水中2、 0.25mol/L蔗糖溶液（懸浮介質(zhì)）：8.56g溶于100ml水中注：蔗糖等一些小分子溶液，可以預(yù)先在分離的樣品中形成密度梯度，在上面再加上一層少量的大分子溶液后，離心，大分子就形成層狀而沉降。若含有沉降系數(shù)不同的許多成分，就會(huì)出現(xiàn)許多層。然后0.25mol/L的蔗糖形成的密度梯度的最大值比葉綠體勻漿介質(zhì)密度要小，滿足密度梯度離心的要求低溫下研磨一般都是保護(hù)作用，防止蛋白質(zhì)變性3、 1%詹納斯綠染液：稱取50mg（pH7.4）,詹納斯綠B溶于5ml生理鹽水中，稍微加熱使之溶解后，過濾，即為1%原液4姬姆薩染液（Giemsa）：稱取姬姆薩粉0.5g，甘油33ml、純甲醇33m1。先在姬姆薩粉中添加少量甘油，然后在研缽內(nèi)研磨至無顆粒狀，再將剩余甘油倒入混勻，56°C左右保溫2h使其充分溶解，最后加甲醇混勻，成為姬姆薩原液，保存于棕色瓶。使用時(shí)吸出少量，用1/5mol/L磷酸緩沖液作10~20倍稀釋。六、 實(shí)驗(yàn)步驟：1、 樣品采集：采集菊科蒿屬植物蔞蒿鮮樣（莖、葉），用自來水和去離子水反復(fù)沖洗干凈，淋干水分，剪成碎片至于研缽內(nèi)加液氮研成精細(xì)粉末，稱取5g（0.5g）粉末溶于200ml（20ml）緩沖液混勻測(cè)ph=7.15（量多需等比例擴(kuò)大）2、 細(xì)胞破碎：將混合液分裝入100ml三角瓶中，用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎。機(jī)器參數(shù)設(shè)置如下：6號(hào)變幅桿（10-100ml）,超聲時(shí)間3s，間隙時(shí)間3s，總時(shí)20min，溫度21C，功率45%。5、超、高速離心實(shí)驗(yàn)：（1）、將破碎溶液進(jìn)行過濾（用兩層紗布），上層殘?jiān)礊榧?xì)胞壁部分（收集入冰箱保存待測(cè)），濾液為原生質(zhì)體部分（包括各種細(xì)胞器和細(xì)胞液等），待離心。（2）將濾液分裝入離心管，先用高速離心機(jī)進(jìn)行初步離心實(shí)驗(yàn)，依據(jù)現(xiàn)有資料設(shè)置離心力和轉(zhuǎn)速，參數(shù)如下：

離心力（轉(zhuǎn)數(shù)）所得沉淀600g（2400轉(zhuǎn)）細(xì)胞核部分2000g（4000轉(zhuǎn)）葉綠體部分10000g（9800轉(zhuǎn)）線粒體部分（分級(jí)得到的線粒體可米用蔗糖密度20000g（13900轉(zhuǎn)）梯度禺心方法來純化）（3）根據(jù)濃度梯度、根莖葉、嫩中老三個(gè)指標(biāo)來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（濃度單位：mg/L,mg/kg）離心前不同濃度、不同部位、不同時(shí)期鎘的含量X鎘X處理\濃、\度離心前鎘含量 、、0510204080160嫩根嫩莖嫩葉中根中莖中葉老根老莖老葉離心后不同濃度、不同部位、不同時(shí)期鎘的含量\鎘\處X.理、\濃'、、度離心后鎘含量 、、0510204080160嫩根嫩莖嫩葉中根中莖中葉老根老莖老葉細(xì)分的話：1、不同濃度、嫩苗期、根莖葉部位、不同轉(zhuǎn)速下鎘的含量不同濃度，600g嫩根離心鎘含量（細(xì)胞核部分）

6OOg嫩根5lO2O4O8Ol6O不同濃度，lOOOOg嫩根離心鎘含量（線粒體部分）lOOOOg嫩根5lO2O4O8Ol6O不同濃度，600g嫩莖離心鎘含量（細(xì)胞核部分）6OOg嫩莖5lO2O4O8Ol6O不同濃度，2OOOg嫩莖離心鎘含量（葉綠體部分）2OOOg嫩莖5lO2O4O8Ol6O不同濃度，lOOOOg嫩莖離心鎘含量（線粒體部分）lOOOOg嫩莖5lO2O4O8Ol6O不同濃度，6OOg嫩葉離心鎘含量（細(xì)胞核部分）6OOg嫩莖5lO2O4O8Ol6O不同濃度，2000g嫩葉離心鎘含量（葉綠體部分）2OOOg嫩莖5lO2O4O8Ol6O不同濃度，lOOOOg嫩葉離心鎘含量（線粒體部分）lOOOOg嫩莖5lO2O4O8Ol6O2、不同濃度、中苗期、根莖葉部位、不同轉(zhuǎn)速下鎘的含量不同濃度，600g中根離心鎘含量（細(xì)胞核部分）6OOg嫩根5lO2O4O8Ol6O不同濃度，lOOOOg中根離心鎘含量（線粒體部分）lOOOOg嫩根5lO2O4O8Ol6O不同濃度，600g中莖離心鎘含量（細(xì)胞核部分）6OOg嫩莖5lO2O4O8Ol6O不同濃度，2OOOg中莖離心鎘含量（葉綠體部分）2OOOg嫩莖5lO2O4O8Ol6O不同濃度，lOOOOg中莖離心鎘含量（線粒體部分）lOOOOg嫩莖5lO2O4O8Ol6O不同濃度，6OOg中葉離心鎘含量（細(xì)胞核部分）6OOg嫩莖5lO2O4O8Ol6O不同濃度，2000g中葉離心鎘含量（葉綠體部分）2000g嫩莖510204080160不同濃度，lOOOOg中葉離心鎘含量（線粒體部分）10000g嫩莖5102040801602、不同濃度、老苗期、根莖葉部位、不同轉(zhuǎn)速下鎘的含量不同濃度，600g老根離心鎘含量（細(xì)胞核部分）600g嫩根510204080160不同濃度，10000g老根離心鎘含量（線粒體部分）10000g嫩根510204080160不同濃度，600g老莖離心鎘含量（細(xì)胞核部分）600g嫩莖510204080160不同濃度，2000g老莖離心鎘含量（葉綠體部分）2000g嫩莖510204080160不同濃度，lOOOOg老莖離心鎘含量（線粒體部分）10000g嫩莖510204080160不同濃度，600g老葉離心鎘含量（細(xì)胞核部分）600g嫩莖510204080160不同濃度，2000g老葉離心鎘含量（葉綠體部分）2000g嫩莖510204080160不同濃度，10000g老葉離心鎘含量（線粒體部分）10000g嫩莖510204080160最后總結(jié)變化趨勢(shì)，繪制趨勢(shì)圖七、活性鑒定（細(xì)胞器鑒定）：將分離出來的沉淀用來鏡檢1、葉綠體：在潔凈的載玻片上滴一滴清水，用鑷子或者接種環(huán)取一塊沉淀，蓋上蓋玻片，制成臨時(shí)裝片，用吸水紙吸取周邊多余水分，用顯微鏡低倍鏡觀察，找到葉片細(xì)胞后，再換高倍鏡觀察、拍照。在高等植物中葉綠體像雙凸或平凸透鏡，長(zhǎng)徑5~10um,短徑2~4um,厚2?3um。圖片中看到的葉綠體大概為1.5cm即15mm換算：1m=1O-2cm=1O-3mm=1O-6um=1O-9nm10um（長(zhǎng)徑）*1600（放大倍數(shù)100*16）=10*10-6*1.6*103=16mm（與照片顯示結(jié)果相同,可見，所看到綠色物體確定為葉綠體）2、線粒體：在潔凈的載玻片上滴一滴詹納斯綠染液，用鑷子或者接種環(huán)取一塊沉淀，蓋上蓋玻片，制成臨時(shí)裝片，用吸水紙吸取周邊多余水分，用顯微鏡低倍鏡觀察，找到葉片細(xì)胞后，再換高倍鏡觀察、拍照。線粒體的形狀多種多樣,一般呈線狀,也有粒狀或短線狀。線粒體的直徑一般在0.5~1.0gm,在長(zhǎng)度上變