同源重組的應(yīng)用專題講義

同源重組的應(yīng)用09生工夏章傳同源重組概述同源重組（homologousrecombination）◆即一般重組，是染色體之間進(jìn)行遺傳信息的方式之一，幾乎所有生物都發(fā)生同源重組?！羧缯婧松餃p數(shù)分裂中染色體的交換，細(xì)菌結(jié)合、轉(zhuǎn)化、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的遺傳重組都屬于同源重組。◆同源重組要求兩個(gè)DNA分子的序列同源，同源區(qū)越長(zhǎng)越有利于重組；同源區(qū)太短，則難于發(fā)生重組。因?yàn)樗蕾囉诖蠓秶鶧NA同源順序的聯(lián)會(huì)，負(fù)責(zé)DNA配對(duì)和重組的蛋白質(zhì)因子無(wú)堿基序列特異性，只要兩條DNA序列相同或相近，重組便可以在聯(lián)會(huì)部分的任何位置發(fā)生。當(dāng)然，也存在重組熱點(diǎn)，即某些序列發(fā)生重組的概率高于其它序列。◆同源重組也是對(duì)損傷DNA修復(fù)的一種重要途徑，即重組修復(fù)。同源重組的應(yīng)用◆同源重組的應(yīng)用價(jià)值主要是用于基因敲除（knock-out）和基因敲進(jìn)(knock-in)①研究基因功能②轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備③用于藥物篩選的動(dòng)物模型④轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可作為“生物反應(yīng)器”生產(chǎn)藥物基因敲進(jìn)和敲進(jìn)◆基因敲除（knockoutofgene）:是基因打靶技術(shù)的一種，指外源DNA與受體細(xì)胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，從而代替受體細(xì)胞基因組中的相同或相似的基因序列，整合入受體細(xì)胞的基因組中?！艋蚯眠M(jìn)（knockinofgene）：利用基因同源重組，將外源有功能的基因轉(zhuǎn)入基因組中不存在或已失活的細(xì)胞中與其基因組中同源序列進(jìn)行同源重組，在細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)，這一技術(shù)稱為基因敲進(jìn)?！艋蚯贸颓眠M(jìn)的原理都是同源重組，即同源雙交換，用克隆的外源基因取代基因組中野生型等位基因?！魞烧卟煌c(diǎn)在于，基因敲除導(dǎo)入的外源基因是失活的、無(wú)功能的基因，基因敲進(jìn)導(dǎo)入的是有活性和功能的基因。因而兩者的具體用途有所不同?！艋蚯贸颓眠M(jìn)都可用于基因功能的研究，基因敲進(jìn)則也可用于突變基因的修復(fù)?！艋蚯贸亲?0年代末以來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型分子生物學(xué)技術(shù)，是通過(guò)一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計(jì)的同源片段替代靶基因片段，從而達(dá)到基因敲除的目的。隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，除了同源重組外，新的原理和技術(shù)也逐漸被應(yīng)用，比較成功的有基因的插入突變和iRNA，它們同樣可以達(dá)到基因敲除的目的。小鼠基因敲除實(shí)驗(yàn)◆基因敲出實(shí)際操作簡(jiǎn)要步驟：1、克隆目的基因及其兩側(cè)的DNA序列。2、通過(guò)插入抗性基因或者DNA缺失，對(duì)克隆的目的基因進(jìn)行體外遺傳改造，使克隆的目的基因失活。3、將經(jīng)體外改造失活的目的基因引入受體細(xì)胞，使之與野生型基因進(jìn)行同源重組。◆這兩種基因取代，都是是利用內(nèi)源基因序列兩側(cè)或外面的斷裂點(diǎn)，用同源序列的目的基因整個(gè)置換內(nèi)源基因。目前用于基因敲除的技術(shù)有Cre/LoxP系統(tǒng)、FLPI系統(tǒng)等。◆此法可產(chǎn)生精確的基因突變，也可正確糾正機(jī)體的基因突變。①研究基因功能◆細(xì)菌和一些低等真核生物在進(jìn)行基因取代時(shí)，克隆的基因能精確地插入到染色體的同源部位，所以他們是研究基因取代的理想材料?！艋蛉〈ǔ晒τ糜诩?xì)菌和酵母菌的基因分析外，還成功地應(yīng)用到老鼠和雞的基因功能分析中。②轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備

◆轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用領(lǐng)域1、生物反應(yīng)器：藥用或食品蛋白的大量生產(chǎn)，即轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥；2、疾病的動(dòng)物模型：用于研究、藥物篩選、藥物治療、毒物測(cè)試；3、通過(guò)增加或刪除基因來(lái)研究基因的功能、調(diào)控和發(fā)育，如癌基因、免疫系統(tǒng)等；4、異種器官的移植；5、家畜品種的改良。◆轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用領(lǐng)域③用于于藥物篩篩選的動(dòng)動(dòng)物模型型◆誘發(fā)性或或?qū)嶒?yàn)性性動(dòng)物模模型（ExperimentalAnimalModels）用同源重重組的方方法，將將致病因因素作用用于動(dòng)物物，造成成動(dòng)物組組織、器器官或全全身一定定的損害害，出現(xiàn)現(xiàn)某些類類似人類類疾病時(shí)時(shí)的功能能、代謝謝或毒使使動(dòng)物患患相應(yīng)的的傳染病病，又如如用化學(xué)學(xué)致癌劑劑、放射射線、致致癌病毒毒誘發(fā)動(dòng)動(dòng)物的腫腫瘤等。。誘發(fā)性性疾病動(dòng)動(dòng)物模型型具有能能在短時(shí)時(shí)間內(nèi)復(fù)復(fù)制出大大量疾病病模型，，并能嚴(yán)嚴(yán)格控制制各種條條件使復(fù)復(fù)制出的的疾病模模型適合合研究目目的需要要等特點(diǎn)點(diǎn)，因而而為近代代醫(yī)學(xué)研研究所常常用，特特別是藥藥物篩選選研究工工作所首首選。但但誘發(fā)模模型和自自然產(chǎn)生生的疾病病模型在在某些方方面畢竟竟存在一一定差異異。因此此在設(shè)計(jì)計(jì)誘發(fā)性性動(dòng)物模模型要盡盡量克服服其不足足，發(fā)揮揮其特點(diǎn)點(diǎn)。③用于于藥物篩篩選的動(dòng)動(dòng)物模型型◆用于藥物物篩選的的動(dòng)物模模型例如如：帕金森病病動(dòng)物模模型，用用于藥物物篩選。。建立抗丙丙型肝炎炎病毒藥藥物篩選選的動(dòng)物物模型。。精神分裂裂癥動(dòng)物物模型及及其藥物物篩選。。高尿酸血血癥動(dòng)物物模型的的建立及及抗痛風(fēng)風(fēng)中藥的的篩選。。◆要求：：（一）相相似性（二）重重復(fù)性（三）可可靠性（四）適適用性和和可控性性（五）易易行性和和經(jīng)濟(jì)性性。③用于于藥物篩篩選的動(dòng)動(dòng)物模型型◆動(dòng)物模型型的意義義和優(yōu)越越性：：（一）避避免了在在人身上上進(jìn)行實(shí)實(shí)驗(yàn)所帶帶來(lái)的風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)。。（二）臨臨床上平平時(shí)不易易見(jiàn)到的的疾病可可用動(dòng)物物隨時(shí)復(fù)復(fù)制出來(lái)來(lái)。（三）可可以克服服人類某某些疾病病潛伏期期長(zhǎng)，病病程長(zhǎng)和和發(fā)病率率低的缺缺點(diǎn)。。（四）可可以嚴(yán)格格控制實(shí)實(shí)驗(yàn)條件件，增強(qiáng)強(qiáng)實(shí)驗(yàn)材材料的可可比性。。（五）可可以簡(jiǎn)化化實(shí)驗(yàn)操操作和樣樣品收集集。（六）有有助于更更全面地地認(rèn)識(shí)疾疾病的本本質(zhì)。④轉(zhuǎn)基基因動(dòng)物物可作為為“生物物反應(yīng)器器”生產(chǎn)產(chǎn)藥物。?！艮D(zhuǎn)基因動(dòng)動(dòng)物生產(chǎn)產(chǎn)藥物不不僅開(kāi)辟辟了制藥藥業(yè)的新新紀(jì)元，，而且它它也是轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)動(dòng)物研究究最活躍躍的領(lǐng)域域?！艋蚬こ坛趟幬?個(gè)階段:1、細(xì)菌基基因工程程，即把把目的基基因通過(guò)過(guò)適當(dāng)?shù)牡母慕▽?dǎo)導(dǎo)入大腸腸桿菌中中，再通通過(guò)細(xì)菌菌等原核核微生物物表達(dá)的的目的蛋蛋白作為為藥物;2、是細(xì)胞胞基因工工程藥物物，這是是把人或或哺乳動(dòng)動(dòng)物的基基因直接接導(dǎo)入哺哺乳動(dòng)物物的細(xì)胞胞中，生生產(chǎn)有生生物活性性的產(chǎn)品品;3、其三是是利用轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)動(dòng)物生產(chǎn)產(chǎn)低成本本、高活活性的藥藥物。一、轉(zhuǎn)基基因動(dòng)物物◆轉(zhuǎn)基因動(dòng)動(dòng)物是把把外源基基因?qū)肴雱?dòng)物的的生殖細(xì)細(xì)胞中，并整合該該細(xì)胞后后發(fā)育成成為個(gè)體體整合的的外源基基因，整合的外外源基因因又能影影響其后后代遺傳傳的動(dòng)物物。藥用蛋白白基因→→表達(dá)細(xì)細(xì)胞株→→細(xì)胞核核轉(zhuǎn)基因動(dòng)動(dòng)物生產(chǎn)產(chǎn)藥用蛋蛋白的基基本過(guò)程程受體動(dòng)物物供體動(dòng)物物→受精精卵→無(wú)核受精精卵→組裝的的核細(xì)胞胞→多細(xì)細(xì)胞胚胎胎→假孕動(dòng)物→動(dòng)動(dòng)物幼崽崽→雌性性轉(zhuǎn)基因因動(dòng)物→→乳汁→→藥用蛋蛋白◆轉(zhuǎn)基因動(dòng)動(dòng)物生產(chǎn)產(chǎn)藥物的的優(yōu)點(diǎn)：：1、品種多、、產(chǎn)量高高、質(zhì)量量好。2、設(shè)備簡(jiǎn)單單、不耗耗能、無(wú)無(wú)環(huán)鏡污污染。3、生產(chǎn)周期期短。4、生產(chǎn)成本本低。◆2006年報(bào)道：：我國(guó)目前前已有乳乳鐵蛋白白、白蛋蛋白、凝凝血因子子等進(jìn)入入臨床試試驗(yàn)階段段，首個(gè)個(gè)轉(zhuǎn)基因因動(dòng)物生生產(chǎn)的藥藥物有望望在5年內(nèi)上市市?！熬烤烤故悄哪姆N轉(zhuǎn)基基因藥物物率先上上市，還還得由臨臨床療效效說(shuō)了算算?！薄艮D(zhuǎn)基因動(dòng)動(dòng)物就是是指通過(guò)過(guò)實(shí)驗(yàn)方方法，人人工地把把外源基基因?qū)肴雱?dòng)物的的受精卵卵，使使外源基基因與動(dòng)動(dòng)物本身身的基因因組整合合在一起起，因而而外源基基因能隨隨細(xì)胞的的分裂而而增殖，，并能穩(wěn)穩(wěn)定地遺遺傳給下下一代。。在此基基礎(chǔ)上，，人們只只要將事事先提取取到的藥藥用蛋白白注射到到牛、羊羊等身上上，當(dāng)它它們的下下一代出出生，人人們便可可以從其其體內(nèi)提提取更多多的藥用用蛋白。。簡(jiǎn)單地地說(shuō)，就就像在動(dòng)動(dòng)物的體體內(nèi)批量量生產(chǎn)藥藥物一樣樣。◆此前，我我國(guó)科學(xué)學(xué)家曾在在上海成成功研制制出5頭有目的的基因整整合的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因因羊，其其中一頭頭羊產(chǎn)下下小羊進(jìn)進(jìn)入泌乳乳期后，，其乳汁汁中有活活性的人人凝血因因子IX顯示，這這種凝血血因子恰恰是治療療血友病病乙的珍珍貴藥物物。上海海醫(yī)學(xué)遺遺傳研究究所成功功培育出出含有人人血清白白蛋白的的轉(zhuǎn)基因因試管牛牛。目前前，科學(xué)學(xué)家們正正在進(jìn)一一步研究究如何提提高成功功率。Theend,thanks!9、靜夜四四無(wú)鄰，，荒居舊舊業(yè)貧。。。12月-2212月-22Thursday,December22,202210、雨中黃黃葉樹(shù)，，燈下白白頭人。。。00:41:0600:41:0600:4112/22/202212:41:06AM11、以我我獨(dú)沈沈久，，愧君君相見(jiàn)見(jiàn)頻。。。12月月-2200:41:0600:41Dec-2222-Dec-2212、故人人江海海別，，幾度度隔山山川。。。00:41:0600:41:0600:41Thursday,December22,202213、乍見(jiàn)翻疑疑夢(mèng)，相悲悲各問(wèn)年。。。12月-2212月-2200:41:0600:41:06December22,202214、他鄉(xiāng)生白白發(fā)，舊國(guó)國(guó)見(jiàn)青山。。。22十二二月202212:41:06上上午00:41:0612月-2215、比不了得就就不比，得不不到的就不要要。。。十二月2212:41上上午12月-2200:41December22,202216、行行動(dòng)動(dòng)出出成成果果，，工工作作出出財(cái)財(cái)富富。。。。2022/12/220:41:0600:41:0622December202217、做前，，能夠環(huán)環(huán)視四周周；做時(shí)時(shí)，你只只能或者者最好沿沿著以腳腳為起點(diǎn)點(diǎn)的射線線向前。。。12:41:06上上午12:41上上午00:41:0612月-229、沒(méi)有失失敗，只只有暫時(shí)時(shí)停止成成功！。。12月-2212月-22Thursday,December22,202210、很多事情情努力了未未必有結(jié)果果，但是不不努力卻什什么改變也也沒(méi)有。。。00:41:0600:41:0600:4112/22/202212:41:06AM11、成功就是是日復(fù)一日日那一點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)小小努力力的積累。。。12月-2200:41:0700:41Dec-2222-Dec-2212、世間成事事，不求其其絕對(duì)圓滿滿，留一份份不足，可可得無(wú)限完完美。。00:41:0700:41:0700:41Thursday,December22,202213、不知香積寺寺，數(shù)里入云云峰。。12月-2212月-2200:41:0700:41:07December22,202214、意志志堅(jiān)強(qiáng)強(qiáng)的人人能把把世界界放在在手中中像泥泥塊一一樣任任意揉揉捏。。22十十二二月202212:41:07上上午午00:41:0712月月-2215、楚塞塞三湘湘接，，荊門(mén)門(mén)九派派通。。。。。十二月月2212:41上上午12月月-2200:41December22,202216、少年十五五二十時(shí)，，步行奪得得胡馬騎。。。2022/12/220:41:0700:41:0722December202217、空山新雨后后，天氣晚來(lái)來(lái)秋。。12:41:07上午午12:41上上午00:41:0712月-229、楊柳柳散和和風(fēng)，，青山山澹吾吾慮。。。12月月-2212月月-22Thursday,December22,202210、閱讀一一切好書(shū)書(shū)如同和和過(guò)去最最杰出的的人談話話。00:41:0700:41:0700:4112/22/202212:41:07AM11、越是沒(méi)沒(méi)有本領(lǐng)領(lǐng)的就越越加自命命不凡。。12月-2200:41:0700:41Dec-2222-Dec-2212、越是無(wú)能的的人，越喜歡歡挑剔別人的的錯(cuò)兒。00:41:0700:41:0700:41Thursday,December22,202213、知人者智，，自知者明。。勝人者有力力，自勝