膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測實(shí)驗(yàn)報(bào)告模板一

醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓名_____________學(xué)號(hào)___________年級(jí)_______組別________實(shí)驗(yàn)名稱膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測實(shí)驗(yàn)者合作者日期指導(dǎo)老師實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握培養(yǎng)基的制備的原則和一般方法2、掌握細(xì)菌的分離培養(yǎng)方法3、掌握油鏡的正確使用，細(xì)菌標(biāo)本圖片的制備4、掌握細(xì)菌的形革蘭氏染色法以及形態(tài)學(xué)檢查方法5、熟悉細(xì)菌的生化試驗(yàn)方法（糖發(fā)酵試驗(yàn)、抗菌素敏感性試驗(yàn)、血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)、動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)）的原理及方法6、掌握玻片凝集試驗(yàn)的原理及方法二、實(shí)驗(yàn)器材1、5ml試管15支、托盤天平、錐形瓶、營養(yǎng)肉湯干粉培養(yǎng)基、量筒、使館狂、酒精燈、洗耳球、刻度吸管2、膿汁標(biāo)本1支，糞便標(biāo)本1支、伊紅美蘭平板2個(gè)，營養(yǎng)瓊脂平板2個(gè)、接種環(huán)、酒精燈3、斜面4支、細(xì)菌分離培養(yǎng)物（上次實(shí)驗(yàn)平板）4、斜面培養(yǎng)物4支，營養(yǎng)肉湯4支，生理鹽水2支，鏡油瓶、拭鏡紙1套，吸水紙1本，載玻片4張5、斜面培養(yǎng)物4支，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（菌液）4支，半固體瓊脂4支，營養(yǎng)瓊脂平板4個(gè)，糖發(fā)酵管1套，抗菌素紙片1套，眼科鑷子2把。6、半固體培養(yǎng)物4支，藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)物4個(gè)，微量發(fā)酵管培養(yǎng)物1套。三、方法與步驟流程圖：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備細(xì)菌的分離培養(yǎng)細(xì)菌的純培養(yǎng)細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查液體培養(yǎng)基接種細(xì)菌的生化實(shí)驗(yàn)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的制備=1\*GB3①稱取1.1g營養(yǎng)肉湯干粉培養(yǎng)基于錐形瓶中，加入50ml蒸餾水溶解=2\*GB3②加熱煮沸1次，加熱時(shí)需要搖動(dòng)=3\*GB3③分裝于15支小試管中，每支3ml=4\*GB3④集中放在試管筐中，罩上硫酸紙和牛皮紙，用橡皮筋包扎好=5\*GB3⑤滅菌2、細(xì)菌的分離培養(yǎng)平板畫線法：小組分工：甲→膿汁標(biāo)本→營養(yǎng)瓊脂平板丙→糞便標(biāo)本→伊紅美藍(lán)平板乙→膿汁標(biāo)本→營養(yǎng)瓊脂平板丁→糞便標(biāo)本→伊紅美藍(lán)平板步驟：=1\*GB3①點(diǎn)燃酒精燈，把接種環(huán)在酒精燈上燒灼滅菌，金屬桿快速通過火焰2～3次，以殺滅表面微生物。=2\*GB3②取出標(biāo)本，在火焰旁邊，左手斜持標(biāo)本管下端，右手小指夾住試管棉塞上端，緩慢拔出棉塞并夾持之，管口迅速通過火焰3次=3\*GB3③將冷卻的接種環(huán)沾取標(biāo)本1環(huán)，管口迅速通過火焰滅菌后塞上棉塞放回。=4\*GB3④接種環(huán)與平板呈30～40度角，在平板表面上方，以曲線的形式，作大幅度來回連續(xù)劃線，邊劃邊退，線段要?jiǎng)澋瞄L而密集，每區(qū)劃線不少于30條。畫完第一區(qū)要燒掉接種環(huán)上多余的標(biāo)本。轉(zhuǎn)動(dòng)平板，轉(zhuǎn)動(dòng)平板，通過第一區(qū)5～7次，使接種環(huán)重新沾上少量細(xì)菌，同樣的方法劃過第二到五區(qū)，接種環(huán)呈遞減次數(shù)地通過第二到第四區(qū)。=5\*GB3⑤平板倒置，37℃培養(yǎng)18~24h,觀察結(jié)果。3、細(xì)菌的純培養(yǎng)（斜面接種法）分工：甲→金黃,乙→白色。丙→紫黑,丁→粉紅。步驟：=1\*GB3①取制作的平板，在菌落分布最稀疏的區(qū)域，選擇平板上典型的、容易挑取的單菌落。（從營養(yǎng)瓊脂平板中分別選取金黃色菌落、白色菌落，從伊紅美藍(lán)平板上分別選出紫黑色菌落、粉紅色菌落。）=2\*GB3②接種環(huán)套住菌落，輕輕刮取細(xì)菌。=3\*GB3③接種環(huán)取菌后，伸入斜面底部，自下向上先拉一條細(xì)菌接種線。再伸入底部，自下向上，作蜿蜒劃線。=4\*GB3④37℃培養(yǎng)24小時(shí)，觀察結(jié)果。細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查（革蘭氏染色法）=1\*GB3①加樣槍取鹽水左3ul、右3ul,水滴間距小于2cm。=2\*GB3②挑取菌苔少許（1mm小菌落的半量）與生理鹽水混勻，涂成1cm2大小的均勻薄膜=3\*GB3③涂畢，環(huán)移至涂膜中央側(cè)立，待環(huán)內(nèi)菌膜破裂，將接種環(huán)通過火焰滅菌=4\*GB3④涂片在室溫干燥或烘干，手持玻片一端，標(biāo)本面朝上，在火焰外層快速通過2~3次，將標(biāo)本固定，促使菌體蛋白質(zhì)凝固，固定在載玻片上，以免染色水洗的時(shí)候，細(xì)菌被水洗掉。=5\*GB3⑤革蘭染色：初染：結(jié)晶紫→初染1分鐘→水洗↓媒染：盧戈碘液→媒染1分鐘→水洗↓脫色：95％乙醇→脫色約20秒鐘→水洗↓復(fù)染：稀釋品紅→復(fù)染1分鐘→水洗↓吸干,鏡檢。液體培養(yǎng)基接種分組：甲→金黃乙→白色,丙→紫黑丁→粉紅。=1\*GB3①無菌操作，接種環(huán)斜面取菌，在靠近培養(yǎng)基液面管壁上，上下研磨接種。=2\*GB3②在管壁上，將接種環(huán)內(nèi)的菌膜拍破。退出接種環(huán)，燒灼滅菌。6、細(xì)菌的生化實(shí)驗(yàn)（一）半固體穿刺接種法分工：甲→紫黑,乙→紫黑；丙→粉紅,丁→粉紅。=1\*GB3①無菌操作，接種針斜面取菌，從半固體中心,垂直刺入，到達(dá)培養(yǎng)基底部5分之4處，再循原來的路線,退出接種針。=2\*GB3②管口、接種針經(jīng)火焰燒灼滅菌。（二）細(xì)菌的糖發(fā)酵試驗(yàn)分工：甲→紫黑→①葡萄糖丙→粉紅→③葡萄糖乙→紫黑→②乳糖丁→粉紅→④乳糖①用砂輪在糖發(fā)酵管液面上方2～3cm處，切割一道切痕。將管子打開，管口燒灼滅菌②接種針針尖斜面取菌，伸入培養(yǎng)基內(nèi)，在管壁上，上下研磨接種。③管口朝向相同，放置在平皿內(nèi)。（三）抗菌素敏感性試驗(yàn)（紙片擴(kuò)散法)=1\*GB3①接種環(huán)取菌液3～5ul2次,在平板培養(yǎng)基表面，拉出2條細(xì)菌接種線，使呈“十字形”(操作時(shí)，不得同時(shí)握持菌液管和平板，以免菌液倒出來，造成污染）。=2\*GB3②平板密集劃線接種細(xì)菌（紗窗樣）。每次將平板旋轉(zhuǎn)90°，保證菌液均勻分布。=3\*GB3③設(shè)計(jì)三點(diǎn)，作標(biāo)記：青、鏈、慶。呈等邊三角距離，點(diǎn)距離平皿邊緣約15mm。=4\*GB3④鑷子火焰消毒，夾取相應(yīng)的藥物紙片，平貼在已設(shè)定的位置上，按壓，鑷子火焰滅菌。=5\*GB3⑤做標(biāo)記，37℃18～24小時(shí)培養(yǎng)，觀察結(jié)果。（四）血漿凝固酶試驗(yàn)兔血清+白色和黃色=1\*GB3①取2滴兔血漿置于潔凈的玻片上。=2\*GB3②分別用接種環(huán)取白色和黃色菌苔(約2～3個(gè)菌落的菌量)與血漿研磨混合，立即觀察結(jié)果。=3\*GB3③菌液出現(xiàn)明顯凝塊者為陽性，否則為陰性。7、細(xì)菌的血清學(xué)試驗(yàn)（玻片凝集試驗(yàn)）=1\*GB3①取潔凈的載玻片一張，將磨面近端設(shè)為對(duì)照區(qū)，滴加生理鹽水15ul。遠(yuǎn)端設(shè)為試驗(yàn)區(qū)，滴加福氏志賀菌診斷血清15ul=2\*GB3②用接種環(huán)分別取粉紅色菌苔，約2個(gè)小菌落的菌量，研磨于鹽水或血清內(nèi)，混合均勻，涂抹展開。=3\*GB3③載玻片來回傾側(cè)，讓菌液充分混勻，凝集速度更快、結(jié)果更清楚。=4\*GB3④菌液凝集者記為陽性，菌液均勻混濁記為陰性四、結(jié)果與討論1、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的制備圖1：圖1：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的制備圖2.2丙，丁圖2.2丙，丁→糞便標(biāo)本→伊紅美藍(lán)平板圖2.1甲，乙→膿汁標(biāo)本→營養(yǎng)瓊脂平板平板畫線法：結(jié)果觀察：1、由實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖可看出，膿汁標(biāo)本在普通平板上有金黃色、白色兩種菌落，菌落直徑約2mm左右、圓形、隆起、表面光滑、邊緣整齊、不透明。2、糞便標(biāo)本在伊紅美藍(lán)平板上，有紫黑色、粉紅色兩種菌落，顏色不是細(xì)菌本身的顏色，其中紫黑色菌落較大較明顯，且形成紫黑色具有金屬光澤、大而隆起、不透明的菌落。討論：糞便標(biāo)本在伊紅美藍(lán)平板上，顏色的產(chǎn)生是因?yàn)榇竽c埃希菌分解乳糖產(chǎn)酸，酸使伊紅與美藍(lán)結(jié)合，形成紫黑色具有金屬光澤、大而隆起、不透明的菌落。從四張平板畫線的結(jié)果上來看，第三張圖分離效果很好，得到的菌落典型。而其他三張均有不足。第一二張膿汁的營養(yǎng)瓊脂平板，前面兩區(qū)涂抹太密集，而板的其他部位未充分利用，得不到十分明顯的菌落。第四張糞便的平板第一區(qū)太稀疏，未充分利用平板，故在培養(yǎng)后未見到數(shù)量較少的粉紅菌落，原因是劃線時(shí)不熟練，不能連續(xù)劃線。細(xì)菌的純培養(yǎng)（斜面接種法）圖3.1斜面接種產(chǎn)物（右左向右依次為金黃，白色粉紅，紫黑菌苔)圖3.1斜面接種產(chǎn)物（右左向右依次為金黃，白色粉紅，紫黑菌苔)結(jié)果觀察與討論：從普通平板上挑取的金黃色和白色菌落接種的斜面，菌苔的顏色，仍然呈金黃色和白色。2、從伊紅美藍(lán)平板上挑取的紫黑色或粉紅色菌落接種的斜面，菌苔已經(jīng)沒有原來菌落的顏色。菌苔灰白色、表面濕潤、光滑、半透明。4、細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查（革蘭氏染色法）圖4.1膿汁菌苔（左邊為白色菌苔，右圖為金黃色菌苔）圖4.1膿汁菌苔（左邊為白色菌苔，右圖為金黃色菌苔）圖4.2糞便菌苔（左圖為粉紅菌苔，右圖為紫黑色菌苔）圖4.2糞便菌苔（左圖為粉紅菌苔，右圖為紫黑色菌苔）結(jié)果觀察與討論：1、從膿汁標(biāo)本中分離得到金黃色、白色兩種菌落，顯微鏡油鏡下呈紫色為G+球菌，排列不規(guī)則，呈葡萄串狀，是典型的葡萄球菌。這兩株葡萄球菌可能是金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌。2、從糞便標(biāo)本分離、獲得紫黑色和粉紅色半透明兩種菌落。顯微鏡油鏡下呈粉紅色為G-桿菌，散在排列，從形態(tài)上不能鑒別是什么細(xì)菌。5、液體培養(yǎng)基接種圖5液體培養(yǎng)基接種結(jié)果圖5液體培養(yǎng)基接種結(jié)果6、細(xì)菌的生化實(shí)驗(yàn)（一）半固體穿刺接種法圖6.1（照片拍攝不明顯）圖6.1（照片拍攝不明顯）結(jié)果觀察及討論：表1.動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果菌苔半固體紫黑細(xì)菌1+紫黑細(xì)菌2-粉紅細(xì)菌1-粉紅細(xì)菌2-+：陽性-：陰性紫黑細(xì)菌1細(xì)菌自接種部位向四周移動(dòng)、擴(kuò)散生長，培養(yǎng)基呈云霧狀或根須狀混濁狀態(tài)，有鞭毛。但是實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)紫黑菌苔2無任何現(xiàn)象。經(jīng)過分析，應(yīng)當(dāng)是用接種針取菌苔時(shí)，操作者僅針尖前部接觸了少量菌苔，導(dǎo)致穿刺后無細(xì)菌的生長。但是結(jié)合其他組的結(jié)果，我們認(rèn)為紫黑菌苔應(yīng)當(dāng)是動(dòng)力陽性的。粉紅細(xì)菌菌苔均沿著直線生長，可看出其無鞭毛。（二）細(xì)菌的糖發(fā)酵試驗(yàn)圖6.2.從左至右分別為：圖6.2.從左至右分別為：（④粉紅→乳糖③粉紅→葡萄糖②紫黑→乳糖①紫黑→葡萄糖）結(jié)果觀察與討論:實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄為下表：①葡萄糖②乳糖③葡萄糖④乳糖⊕⊕+-+：產(chǎn)酸或陽性⊕：產(chǎn)酸產(chǎn)氣-：陰性紫黑細(xì)菌微型發(fā)酵關(guān)內(nèi)液體變黃，產(chǎn)生氣泡，氣泡的高度分別為10mm和17mm，說明紫黑色菌苔既分解葡萄糖也分解乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；粉紅細(xì)菌只分解葡萄糖，不產(chǎn)氣，不分解乳糖。抗菌素敏感性試驗(yàn)（紙片擴(kuò)散法)圖6.3圖6.3結(jié)果觀察與討論：1、表3各菌抑菌圈直徑（mm）表菌苔青霉素頭孢曲松慶大霉素金黃色422530白色302240紫黑—3726粉紅—36282、表4.藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析青霉素頭孢曲松慶大霉素金黃色+++白色+±+紫黑-++粉紅-++-：耐藥±：中度敏感+：敏感3、G+球菌對(duì)青霉素和頭孢曲松敏感。4、G-桿菌對(duì)青霉素耐藥，對(duì)頭孢曲松敏感。5、G+球菌和G-桿菌對(duì)廣譜抗菌素慶大霉素都敏感。（四）血漿凝固酶試驗(yàn)圖6.4白色（右）與金黃色（左）菌苔圖6.4白色（右）與金黃色（左）菌苔結(jié)果觀察與討論：1、黃色菌苔能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白,附著于菌體表面,形成凝塊，涂抹不開。說明黃色細(xì)菌為致病菌。2、白色菌苔不發(fā)生凝塊，容易涂抹。呈均勻乳白狀態(tài)。7、細(xì)菌的血清學(xué)試驗(yàn)（玻片凝集試驗(yàn)）圖6.5粉紅菌苔（右）凝集結(jié)果（左側(cè)為對(duì)照）

圖6.5粉紅菌苔（右）凝集結(jié)果（左側(cè)為對(duì)照）結(jié)果觀察與討論：1、由實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖可看到，生理鹽水一端不出現(xiàn)凝集，福氏志賀菌診斷血清一端菌液渾濁，少量絮狀，為陽性。說明粉紅菌為福氏志賀菌。2、根據(jù)糖發(fā)酵試驗(yàn)和半固體動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合腸道桿菌科各菌屬生化反應(yīng)鑒別表分析：表4：腸道桿菌科各菌屬生化反應(yīng)鑒別表葡萄糖乳糖麥芽糖甘露醇蔗糖半固體

埃希菌屬⊕⊕⊕⊕√+

志賀菌屬+√√